風濕性二尖瓣疾病合并心房顫動患者心房纖維化相關微小RNA-647及預測靶基因研究

韓丹 羅超迪 閆煬

心房顫動（房顫）與心房電重構和結構重構有關，心房結構重構的重要病理基礎是間質纖維化[1]。微小RNA（miRNA）是基因轉錄后調控的重要分子，在多種疾病的發(fā)病中起關鍵作用[2]。研究發(fā)現，miRNA 參與調節(jié)心臟重構，尤其在房顫心房纖維化過程中發(fā)揮重要作用[3]。大多數房顫相關miRNA如miR-26、miR-29、miR-133、miR-590 等在心房組織中表達下調，活化相關通路，促進心房肌間質發(fā)生纖維化[4-6]。本研究旨在明確有單純二尖瓣病變的風濕性心臟?。L濕性二尖瓣疾病）患者心房組織的主要病理變化，并通過生物信息學分析篩選與風濕性二尖瓣疾病房顫心房纖維化相關的miRNA 及其靶基因。

1 對象與方法

1.1 研究對象

納入2019 年1 月至2021 年1 月于西安交通大學第一附屬醫(yī)院就診的30 例風濕性二尖瓣疾病患者，根據患者心電圖結果，分為竇性心律組10 例，房顫組20 例。所有患者均在我院心臟外科進行單純二尖瓣瓣膜置換手術及房顫迷宮手術，術中取左心耳組織。記錄患者的臨床資料，術中收集的心耳組織標本用于病理學、分子生物學檢測及生物信息學分析。本研究經西安交通大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，批件號：2021 倫審科字第（025）號（No.XJTU1AF2021LSK-025），所有入選者均簽署知情同意書。

1.2 蘇木精-伊紅染色

將新鮮左心耳組織于4%多聚甲醛中固定，梯度乙醇脫水，脫水后浸泡于二甲苯中進行透明化處理，石蠟包埋、切片、烘干、脫蠟、脫水，蘇木素-伊紅（HE）染色后脫水、封片。顯微鏡下觀察心房組織的心房肌結構、脂肪浸潤等現象。

1.3 Masson染色

將脫水后的左心耳組織石蠟切片依次放入鐵蘇木素、麗春紅、磷鉬酸、苯胺藍中染色，冰醋酸沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯浸泡，中性樹脂封片。顯微鏡下觀察心房組織的纖維化程度，ImageJ 軟件計算間質纖維化程度。

1.4 免疫組織化學染色

將左心耳石蠟切片依次放入二甲苯和梯度酒精中脫蠟，H2O2浸泡，檸檬酸緩沖液蒸煮，PBS 沖洗，BSA 封閉，加入α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）一抗于4 ℃過夜，沖洗后加入二抗于37 ℃孵育0.5 h，沖洗后依次加入鏈霉親合素-生物素-過氧化物酶復合物（SABC）、顯色劑，蘇木精復染，脫水、封片。顯微鏡下觀察α-SMA 表達情況，ImageJ 軟件計算α-SMA 相對表達量。

1.5 實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）

Trizol 法提取左心耳組織中總RNA，純化并定量。反轉錄獲取cDNA。PCR 反應體系：2 μL cDNA，1 μL 上游引物，1 μL 下游引物，10 μL SYBR Green Master Mix，6 μL dd H2O。PCR 反應條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40 個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。2-ΔΔCT計算mRNA 的相對表達水平。qRT-PCR 中使用的引物序列見表1。

表1 qRT-PCR中使用的引物序列

1.6 Western blot檢測

RIPA 裂解液提取左心耳組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取等量蛋白進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉移至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉，分別加入Ⅰ型膠原（Collagen Ⅰ）、Ⅲ型膠原（Collagen Ⅲ）、α-SMA、蛋白激酶Cα（PRKCA）、轉化生長因子β1（TGFβ1）、轉化生長因子β Ⅱ型受體（TGFβRⅡ）、磷酸化Smad2（P-Smad2）、磷酸化Smad3（P-Smad3）、Smad2、Smad3、β-actin 的一抗，4 ℃過夜，洗膜后加入對應的二抗，室溫孵育1 h。ECL 法曝光，成像，Quantity One 分析軟件測定目的蛋白相對表達水平。

1.7 雙熒光素酶報告基因實驗

分別構建與miR-647 結合的PRKCA基因野生型3'UTR 區(qū)目的質粒（PRKCA-wt）及PRKCA基因突變型3'UTR 區(qū)目的質粒（PRKCA-mut），miR-647 擬似物（miR-647）及陰性對照擬似物（NC mimics）。將10 μL DMEM 與0.16 μgPRKCA-wt或PRKCA-mut 目的質粒及5 pmol/L miR-647 或NC mimics 充分混勻后（溶液A）室溫放置，之后將10 μL DMEM 與0.3 μL 的轉染試劑（濃度為0.8 mg/mL）充分混勻后（溶液B）室溫放置5 min。將溶液A 與溶液B 充分混勻后加入293T 細胞中，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉染6 h 后換取新鮮培養(yǎng)基，轉染48 h 后收集細胞，使用Promega Dual-Luciferase System 試劑盒進行檢測。將細胞裂解液于4 ℃，12 000 轉/min 離心10 min，取上清；96 孔板中加入100 μL Luciferase Assay Reagent Ⅱ工作液與20 μL 細胞裂解液，混勻并測定記錄螢火蟲熒光素酶值，此值為內參值。上述96 孔板中繼續(xù)加入100 μL Stop &Glo?Reagent，混勻并測定記錄海腎熒光素酶值，此即為報告基因發(fā)光值。

1.8 統(tǒng)計學分析

數據采用Prism 7.0 統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，兩組間比較采用Student'st檢驗。計數資料組間比較采用卡方檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 2組臨床基線資料比較

2 組患者在性別構成、紐約心臟病協會（NYHA）心功能分級、收縮壓、舒張壓、左室射血分數（LVEF）、右心房直徑（RAD）等的差異無統(tǒng)計學意義。房顫組的年齡、房顫持續(xù)時間、左房直徑（LAD）顯著高于竇性心律組（P均＜0.01），見表2。

表2 竇性心律組與房顫組臨床基線資料比較

2.2 2組患者左心房組織形態(tài)學比較

HE 染色顯示，竇性心律組心房肌組織排列整齊，脂肪浸潤少，房顫組心房肌組織結構破壞、細胞間脂肪浸潤現象更明顯。Masson 染色顯示，竇性心律組心房肌組織間質纖維化程度輕，膠原容積分數（CVF）為11.75±1.54，房顫組心房肌組織間質纖維化程度高，CVF 為33.52±1.41，2 組CVF比較有顯著性差異（P＜0.01）。免疫組織化學染色顯示房顫組心房肌組織纖維化表型相關蛋白α-SMA 的平均光密度（AOD）顯著高于竇性心律組（0.39±0.01 對0.23±0.01，P＜0.01）。見圖1。

圖1 2組患者左心房組織形態(tài)學比較（×200）

2.3 2組纖維化相關基因表達水平比較

房顫組左心房組織Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、α-SMA 的mRNA 及蛋白表達水平顯著高于竇性心律組（P均＜0.01）。見圖2、表3。

表3 2組患者左心房纖維化相關基因mRNA及蛋白表達水平比較

圖2 2組患者左心房纖維化相關蛋白表達情況

2.4 2組TGFβ1/Smad纖維化相關通路表達水平比較

房顫組左心房組織TGFβ1/Smad 纖維化通路中TGFβ1、TGFβRⅡ、Smad2、Smad3的mRNA 及蛋白表達水平顯著高于竇性心律組（P均＜0.01）。見圖3、表5。

圖3 2組患者左心房TGFβ1/Smad纖維化通路蛋白表達情況

2.5 差異表達的miRNA及其靶基因預測

前述結果提示心房纖維化是風濕性二尖瓣疾病房顫發(fā)病的主要病理改變。為了研究miRNA 及其靶基因在房顫心房纖維化中的作用，本研究進一步通過靶點預測軟件TargetScan 和Tarbase 數據庫分析可能與房顫相關的靶基因。篩選到的靶基因有10 個，對應的miRNA 為19 個。既往文獻調查顯示PRKCA基因與組織纖維化進程有關，且未有該基因在房顫相關研究中的報道，PRKCA對應的miR-647 的預測分值較高（91 分），且qRT-PCR 及Western blot 驗證房顫患者心房組織中miR-647 及PRKCA的表達符合理論上應有的變化趨勢，說明PRKCA基因及其對應的miR-647 與風濕性二尖瓣疾病房顫發(fā)病機制相關。見圖4、表5。

表5 2組左心房組織PRKCA及miR-647表達水平比較

圖4 2組PRKCA蛋白表達情況

2.6 雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-647靶向作用于PRKCA基因

雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，NC mimics＋PRKCA-mut 的相對熒光強度為1.00±0.02，miR-647＋PRKCA-mut 的相對熒光強度 為1.01±0.02，NC mimics＋PRKCA-wt 的相對熒光強度為1.00±0.02，miR-647＋PRKCA-wt 的相對熒光強度為0.64±0.01，miR-647 顯著下調PRKCA-wt 的熒光強度（P＜0.01），提示miR-647與PRKCA-wt 相互結合，miR-647 可靶向抑制PRKCA的表達，其結合位點如圖5 所示。

圖5 miR-647 與PRKCA 作用靶點示意圖

3 討論

在房顫心房重構過程中，心房組織表現為間質纖維化、炎性細胞浸潤、心房肌細胞壞死、脂肪浸潤、淀粉樣變性和心房肌細胞肥大等，對這些患者進行早期干預，可延緩纖維化進展，減輕心房和心室結構重構，對房顫治療起積極作用[7]。Haemers等[8]研究發(fā)現，多數房顫患者出現心外膜下脂肪組織浸潤，其中間質纖維化和脂肪浸潤在持續(xù)性房顫患者心房組織中最為常見。本研究對風濕性二尖瓣疾病患者心房組織樣本進行HE 和Masson 染色，結果顯示房顫患者的左心房組織中可見典型的心房肌肥大、脂肪浸潤、心房肌細胞壞死以及大量的間質纖維化等病理改變，與既往研究結果一致，證實左心房組織纖維化是風濕性二尖瓣疾病房顫發(fā)病的重要病理基礎。

表4 2組患者左心房TGFβ1/Smad纖維化通路基因mRNA及蛋白表達水平比較

房顫心房纖維化的分子機制復雜，TGFβ1/Smad 信號通路活化、Collagen Ⅰ和Ⅲ的表達和沉積、纖維化表型相關α-SMA 的表達在房顫心房纖維化中發(fā)揮重要作用[9]。本研究在風濕性二尖瓣疾病房顫患者的左心房組織中發(fā)現，與TGFβ1/Smad 信號通路相關的TGFβ1、TGFβRⅡ、P-Smad2、P-Smad3表達水平升高，纖維化相關基因CollagenⅠ、CollagenⅢ、α-SMA的表達水平也顯著升高，這些纖維化相關的通路及基因激活后促進了房顫的發(fā)生發(fā)展。

蛋白激酶C（PKC）作為G 蛋白耦聯信號轉導通路的關鍵酶，在細胞內信號轉導過程中發(fā)揮重要作用，且與多種離子通道的表達和功能有密切聯系[10]。蛋白激酶Cα（PKCα）是PKC 的一種亞型，在人類基因組中由PRKCA基因編碼，參與調控機體多種生理功能，包括細胞增殖、凋亡、分化、遷移，并且在心律失常、心肌梗死、心力衰竭、高血壓等多種心臟疾病中發(fā)揮重要作用[11]。Li 等[12]研究人心房肌組織PRKCA突變與心臟疾病的關系，結果發(fā)現攜帶rs9909004 等位基因突變影響PRKCA在心臟中的表達，且與心力衰竭的發(fā)生和預后密切相關，可能影響心力衰竭的治療效果[13]。既往研究表明，心房肌肥大時PKCα表達水平明顯上調，且PRKCA基因活化可引起QRS 間期延長，說明PKCα 可能同時參與心臟的結構重構和電重構。

研究發(fā)現，對miRNA 進行檢測可能會發(fā)現新的發(fā)病機制及潛在治療靶點。本研究通過對風濕性二尖瓣疾病竇性心律及房顫患者進行生物信息學預測分析，篩選出與風濕性二尖瓣疾病房顫發(fā)病相關的miR-647 及其靶基因PRKCA進行研究。通過回顧文獻，發(fā)現關于miR-647 的報道僅限于腫瘤研究。Rawlings-Goss 等[14]采用全基因組測序法對14 個人群（包括歐洲、亞洲和非洲）中69 個不相關個體的1 524 個miRNA進行研究，確定了7 個與腫瘤生物標志物或診斷相關的miRNA，其中包括miR-647。Liu 等[15]研究結直腸癌中與細胞增殖和遷移相關的miRNA，結果發(fā)現miR-647 和miR-1914 表達升高，抑制miR-647 及miR-1914 可以抑制結直腸癌細胞的增殖和遷移能力。此外，miR-647在前列腺癌復發(fā)、卵巢癌預后中起重要作用[16-17]。既往研究顯示PRKCA基因與組織纖維化進程有關，但尚無該基因與房顫相關的研究報道。本研究發(fā)現房顫患者心房組織中miR-647 及PRKCA的表達符合理論上應有的變化趨勢，故選擇miR-647 及PRKCA作為研究對象。

本研究明確了心房纖維化是風濕性二尖瓣疾病合并房顫患者心房組織的主要病理變化，并對風濕性二尖瓣疾病房顫病理狀態(tài)下miR-647 及PRKCA的表達情況及靶向作用關系作進行初步分析，發(fā)現miR-647 靶向作用于PRKCA基因，與房顫心房纖維化相關。miR-647 及PRKCA調控心房纖維化的具體機制有待進一步研究探索。