移行上皮反應基因1蛋白調(diào)控巨噬細胞膽固醇代謝作用研究

王勇 張瑞巖

動脈粥樣硬化是心血管事件發(fā)生的重要病理生理基礎(chǔ)，對動脈粥樣硬化發(fā)病機制的研究具有重要價值。以往的研究表明，巨噬細胞大量吞噬膽固醇后變?yōu)榕菽毎瑓⑴c粥樣硬化斑塊形成[1-3]。移行上皮反應基因1（TERE1）蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和細胞膜等，廣泛表達于各種細胞和組織中，例如外周血白細胞、心臟、血管、肝臟、眼等[4-6]，具有多種生物學功能[7-11]。然而，目前尚不清楚TERE1 蛋白是否影響巨噬細胞內(nèi)膽固醇代謝。本研究利用巨噬細胞RAW264.7，探討TERE1 蛋白對巨噬細胞膽固醇代謝的影響及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)和實驗分組及方案

應用RAW264.7 小鼠巨噬細胞（中科院上海細胞庫），培養(yǎng)傳代后用于實驗。

實驗一：RAW264.7 細胞以氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）50 μg/mL 孵育24 h（另設(shè)對照組），研究ox-LDL 對TERE1表達的影響。

實驗二：RAW264.7 細胞以慢病毒過表達TERE1（另設(shè)空病毒轉(zhuǎn)染組和空白對照組1），觀察其對細胞內(nèi)膽固醇含量和相關(guān)因子的作用。

實驗三：RAW264.7 細胞以siRNA 敲低TERE1（另設(shè)空siRNA 轉(zhuǎn)染組和空白對照組2），觀察其對細胞內(nèi)膽固醇含量和相關(guān)因子的影響。

1.2 免疫印跡法（Western blot）檢測TERE1蛋白表達

提取細胞總蛋白并定量分析。聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉。一抗（TERE1，l∶1 000；β-actin，l ∶1 000）4 ℃過夜。加入二抗（l ∶3 000）l h。利用凝膠成像儀顯現(xiàn)蛋白條帶。以β-actin 為內(nèi)參，半定量分析。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測mRNA表達

提取細胞總RNA 并測定其純度，采用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，普通PCR 反應并條件優(yōu)化，RT-PCR 檢測細胞中目的基因mRNA 表達。以GADPH 為內(nèi)參，RT-PCR 操作步驟按照試劑盒說明書進行。

1.4 過表達TERE1慢病毒轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞

用過表達TERE1慢病毒液（上海吉瑪基因公司提供）和空白病毒液轉(zhuǎn)染細胞24 h，換液48 h 后加入含嘌呤霉素培養(yǎng)基。篩選細胞，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況，形成慢病毒轉(zhuǎn)染的細胞穩(wěn)定株，檢測TERE1表達以確認轉(zhuǎn)染效果。

1.5 TERE1 siRNA轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞

在無血清培養(yǎng)基中加入TERE1-siRNA（吉瑪基因公司提供），空siRNA 為對照，再加入LipofectamineTM RNAiMAX，靜置20 min 后加入到細胞培養(yǎng)皿中。轉(zhuǎn)染24 h，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況。檢測TERE1表達以確認轉(zhuǎn)染效果。

1.6 吞噬脂質(zhì)的RAW264.7細胞油紅O染色和細胞內(nèi)膽固醇含量測定

過表達和敲低TERE1的RAW264.7 細胞，以50 μg/mL ox-LDL 孵育24 h。將一部分細胞固定后以油紅O 染色，封片后顯微鏡下觀察；將另一部分細胞破碎后制備勻漿液，使用試劑盒檢測膽固醇含量。測定蛋白含量用于校正，細胞膽固醇含量以（mmol/mg 蛋白）表示。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，變量以均數(shù)±標準差表示。符合正態(tài)分布的兩組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，不符合正態(tài)分布的兩組間比較采用秩和檢驗。多組間比較采用單因素方差分析，并進行兩兩比較，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 脂質(zhì)吞噬狀態(tài)下巨噬細胞TERE1的表達

RT-PCR 和Western blot 檢測顯示，與對照組相比，在ox-LDL 作用下，巨噬細胞TERE1的mRNA 和蛋白表達水平均顯著增加（0.52±0.01 對0.24±0.03，0.63±0.06 對 0.24±0.03，P均＜0.05，n＝5）。

2.2 TERE1過表達和低表達對巨噬細胞膽固醇含量和膽固醇轉(zhuǎn)運因子的影響

熒光顯微鏡下觀察，過表達慢病毒液和低表達TERE1siRNA 轉(zhuǎn)染RAW264.7 細胞，其轉(zhuǎn)染情況均較好（見圖1 和圖2）。RT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，與空白對照組1 和空病毒組比較，TERE1過表達慢病毒轉(zhuǎn)染巨噬細胞組TERE1的mRNA 表達水平顯著增加；與空白對照組2 和空siRNA 組比較，TERE1siRNA 轉(zhuǎn)染巨噬細胞組TERE1的mRNA 表達水平顯著減少（見表1，P＜0.05，n＝5）。

圖1 TERE1過表達慢病毒轉(zhuǎn)染巨噬細胞效率（×200）

圖2 TERE1 siRNA轉(zhuǎn)染巨噬細胞效率（×200）

表1 各組巨噬細胞TERE1 mRNA表達水平

以ox-LDL 孵育巨噬細胞24 h 后，油紅O 染色和總膽固醇試劑盒測定顯示，與空白對照組1 和空病毒組比較，過表達TERE1組細胞內(nèi)脂滴和總膽固醇量明顯減少（圖3 和表2，P＜0.05，n＝5）；與空白對照組2 和空siRNA 組比較，TERE1siRNA敲低組細胞內(nèi)脂滴和總膽固醇量顯著增多（見圖4和表2，P＜0.05，n＝5）。

圖3 TERE1過表達對巨噬細胞膽固醇含量的影響（×200）

圖4 TERE1敲低對巨噬細胞膽固醇含量的影響（×200）

表2 各組巨噬細胞內(nèi)總膽固醇含量/mmol·mg-1蛋白

RT-PCR 檢測有關(guān)基因表達結(jié)果顯示，與空白對照組1 和空病毒組比較，過表達TERE1的細胞其膽固醇流出相關(guān)基因ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1（ABCA1）和ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1（ABCG1）的mRNA 表達水平增加；與空白對照組2 和空siRNA組比較，TERE1siRNA 敲低細胞膽固醇流出相關(guān)基因ABCA1和ABCG1的mRNA 表達水平減少（見表3，P＜0.05，n＝5）。2 種細胞的膽固醇流入相關(guān)基因白細胞分化抗原36（CD36）和清道夫受體A（SR-A）的表達無明顯改變。

表3 TERE1過表達和敲低對巨噬細胞膽固醇轉(zhuǎn)運因子mRNA表達的影響

3 討論

血循環(huán)中的單核細胞黏附于動脈內(nèi)皮細胞，并遷移至內(nèi)皮下間隙分化為巨噬細胞。后者促使ox-LDL 形成，與巨噬細胞的清道夫受體結(jié)合，轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽毎奘杉毎谀懝檀嫁D(zhuǎn)運和代謝中的作用研究，將對動脈粥樣硬化的病理生理機制和防治提供重要理論依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞以ox-LDL 孵育處理后，TERE1 蛋白表達水平顯著增加，提示其可能在膽固醇轉(zhuǎn)運和代謝中發(fā)揮一定的作用。為了研究TERE1 蛋白對巨噬細胞膽固醇代謝的作用，本研究通過過表達和敲低TERE1在巨噬細胞內(nèi)的表達量，觀察其對巨噬細胞內(nèi)膽固醇含量的影響。研究結(jié)果顯示，過表達TERE1使巨噬細胞內(nèi)膽固醇含量減少，而敲低TERE1則使膽固醇含量增加。既往的研究表明，TERE1 蛋白對其他細胞系的膽固醇代謝也有相似的作用。TERE1基因缺陷、功能減弱時，角膜細胞內(nèi)膽固醇合成和代謝因子（HMGCR）等受到影響，導致膽固醇合成增多，膽固醇在眼角膜不斷積累[10]。TERE1在膀胱腫瘤細胞表達減少，通過影響載脂蛋白E（ApoE）的作用，導致膀胱腫瘤細胞內(nèi)膽固醇含量增加，促進腫瘤細胞生長[11]。含鈣培養(yǎng)液孵育血管平滑肌細胞，可使TERE1 蛋白表達增加，細胞內(nèi)膽固醇含量減少，加速血管鈣化進程[12]。

膽固醇流入和流出環(huán)節(jié)在巨噬細胞源性泡沫細胞形成中的作用尤為重要。SR-A 和CD36 是較重要的清道夫受體，對巨噬細胞攝入膽固醇和泡沫化極重要，可促進動脈粥樣硬化的形成和進展。而膽固醇逆向轉(zhuǎn)運是外周細胞膽固醇通過高密度脂蛋白、載脂蛋白A-I 等轉(zhuǎn)運至肝臟分解代謝的重要生理過程[1-3]。細胞膽固醇的外流是膽固醇逆向轉(zhuǎn)運的首要步驟，對減少細胞內(nèi)膽固醇蓄積和動脈粥樣硬化發(fā)生具有重要意義。膽固醇外流可以由ABCA1、ABCG1 以及Apo E 等介導。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達TERE1使巨噬細胞膽固醇流出相關(guān)基因ABCA1和ABCG1表達增加，而膽固醇流入相關(guān)基因CD36和SR-A則無明顯改變；敲低TERE1則使巨噬細胞ABCA1和ABCG1表達減少。這表明，TERE1 蛋白主要通過影響巨噬細胞流出環(huán)節(jié)影響膽固醇代謝和轉(zhuǎn)運。既往文獻也顯示，以過表達TERE1的腺病毒轉(zhuǎn)染前列腺腫瘤細胞，可以使細胞的膽固醇流出相關(guān)基因ABCA1和ABCG1表達增加，與本研究相一致[8]。

總之，TERE1 蛋白可以調(diào)控巨噬細胞內(nèi)膽固醇代謝，激活TERE1可以使巨噬細胞內(nèi)膽固醇含量降低。TERE1 蛋白可能主要通過激活巨噬細胞內(nèi)膽固醇流出相關(guān)基因，進而增加膽固醇流出。加強TERE1的作用，可能有利于膽固醇逆向轉(zhuǎn)運過程，進而延緩動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。這些研究有望為動脈粥樣硬化的防治提供新的理論依據(jù)。