西方蜜蜂工蜂蛹中期響應(yīng)低溫脅迫的差異表達(dá)基因分析

李 寒, 徐新建,2, 周姝婧,2, 周冰峰,2, 朱晨煜, 許宏智, 姚 丹,劉一名, 王 青, 李 想, 王茗琦, 朱翔杰,2,*

(1. 福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院), 福州 350002; 2. 福建農(nóng)林大學(xué)蜜蜂研究所, 福州 350002;3. 廣西中醫(yī)藥大學(xué), 廣西高發(fā)傳染病中西醫(yī)結(jié)合轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南寧 530000; 4. 泉州師范學(xué)院, 福建泉州 362000)

溫度作為最重要的生態(tài)因子之一，對蜜蜂的生長發(fā)育、蜂群活動、蜜蜂個體行為、抗病抗逆力均有影響(Irwinetal., 2000; Stabentheineretal., 2021)。蜜蜂個體發(fā)育對溫度敏感，與多數(shù)昆蟲相比，更易受溫度影響。蜜蜂屬于全變態(tài)昆蟲，其卵、蟲、蛹統(tǒng)稱為蜂子。蜂子的發(fā)育溫區(qū)非常狹窄，蜜蜂卵的發(fā)育溫區(qū)為31～38℃，封蓋子的發(fā)育溫區(qū)為29～38℃，最適發(fā)育溫度為35℃ (朱翔杰等, 2006; Medrzyckietal., 2010; 周冰峰等, 2011)。蜜蜂卵期低溫會導(dǎo)致發(fā)育歷期延長、死亡率升高(陳琳等, 2016)。蜜蜂封蓋子是老熟幼蟲和蛹的總稱，發(fā)育歷期12 d，該期低溫處理會出現(xiàn)封蓋子死亡率升高、羽化蜜蜂壽命縮短和封蓋幼蟲倒置等現(xiàn)象(Wangetal., 2016)，翅脈形態(tài)異常(Zhuetal., 2018)，采集與學(xué)習(xí)記憶能力受到影響(Tautzetal., 2003; Jonesetal., 2005)，且低溫使與記憶相關(guān)基因谷氨酸受體A型基因(Glu-RA)及N-甲基-D-天冬氨酸受體I型基因(NmdarI)顯著下調(diào)表達(dá)(Yuanetal., 2016)。

前期有人關(guān)注了意大利蜜蜂Apismelliferaligustica和中華蜜蜂Apisceranacerana越冬不同時期工蜂可能具有的與抗寒基因表達(dá)量有關(guān)的低溫抵御機(jī)制(Xuetal., 2017; Qinetal., 2019)，處于化蛹發(fā)育時期的蜂子進(jìn)行低溫脅迫的差異表達(dá)基因(differentially expressed genes, DEGs)主要與發(fā)育相關(guān)激素調(diào)控有關(guān)(姚丹等, 2020)，并未發(fā)現(xiàn)與越冬工蜂相同的抗寒相關(guān)的DEGs，說明發(fā)育階段的蜜蜂與蜜蜂成蟲對低溫的響應(yīng)差異較大，蜜蜂發(fā)育階段忍受低溫的機(jī)制還未知。研究發(fā)現(xiàn)處于蛹中期的8 d封蓋子(復(fù)眼顏色呈深棕色, 關(guān)節(jié)處輕微著色)在受到96 h長時間低溫脅迫后，恢復(fù)正常發(fā)育溫度，并未出現(xiàn)封蓋子死亡現(xiàn)象，該時期成為研究蜜蜂發(fā)育階段如何忍受低溫一個很好的時間窗口。同時研究發(fā)現(xiàn)這些經(jīng)受住低溫的蜜蜂羽化后，壽命卻縮短50%(Wangetal., 2016)，說明低溫脅迫對其發(fā)育仍有不利影響。因此，本研究對西方蜜蜂工蜂8 d封蓋子低溫處理96 h的樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)，探索蜜蜂蛹中期在基因表達(dá)層面上可能存在的低溫應(yīng)對機(jī)制，以及低溫對其發(fā)育仍存在哪些不利影響。研究溫度對蜜蜂發(fā)育的影響，有助于理解低溫脅迫對狹溫性昆蟲的影響以及狹溫性昆蟲適應(yīng)低溫環(huán)境的機(jī)制。養(yǎng)蜂生產(chǎn)中，開箱檢查、子脾調(diào)整、蜂群合并以及蜂王漿生產(chǎn)需移蟲操作，均可能出現(xiàn)低溫影響蜂子發(fā)育的狀況。探索低溫對蜂子發(fā)育的影響，有利于指導(dǎo)改進(jìn)蜜蜂飼養(yǎng)管理技術(shù)(Aizen and Harder, 2009)。

1 材料與方法

1.1 供試蜜蜂

測序樣本取自西方蜜蜂蜂群，取樣時間為春季2021年4-6月蜂群增長階段，通過隔王柵限王產(chǎn)卵，獲得卵齡一致的蜜蜂卵。將卵脾放入哺育群哺育，以獲得發(fā)育良好且一致的封蓋子。移入哺育群5 d后大幼蟲即將封蓋，取4 h內(nèi)封蓋的封蓋子，割取封蓋巢脾，在恒溫恒濕箱35±0.2℃(RH 75%)[CTHI-250B, 施都凱儀器設(shè)備(上海)有限公司, 精度±0.1℃]中培育8 d作為對照組，記作CK。再將8 d封蓋子(蛹中期)放入低溫20℃(±0.2℃, RH 75%)(Wangetal., 2016)進(jìn)行96 h處理為處理組，記作T。低溫處理后的封蓋子樣本立即用液氮冷凍，放入-80℃保存?zhèn)溆谩Ｃ總€蜂群采集樣本10頭，3群作為3個生物學(xué)重復(fù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析。

1.2 轉(zhuǎn)錄組高通量測序及測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

委托廣州基迪奧生物科技有限公司完成構(gòu)建cDNA文庫以及高通量測序，測序平臺為Illumina HiSeqTM。對下機(jī)數(shù)據(jù)的原始讀段(raw reads)進(jìn)行過濾，去除含接頭的讀段(reads)、含N比例大于10%的讀段和低質(zhì)量的讀段，最終得到高質(zhì)量讀段(clean reads)(Chenetal., 2018)，然后利用Tophat2(2.1.1)軟件將讀段比對到西方蜜蜂的參考基因組上Amel_HAv3.1(NCBI Assembly: GCF_003254395.2)，并利用Cufflinks組裝轉(zhuǎn)錄本。轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)已上傳NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫(獲取號: SRR15710549-SRR15710554)。

1.3 DEGs的篩選及其GO及KEGG富集分析

使用DESeq2軟件對生物學(xué)重復(fù)的處理組與對照組間進(jìn)行DEGs分析(Loveetal., 2014)，DEGs篩選條件為|log2FC|≥1 (FC, fold change, 指基因表達(dá)水平的變化, FC=T/CK, 其中T為處理組的基因表達(dá)水平, CK為對照組的基因表達(dá)水平)，錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate, FDR)≤0.05。對CKvsT的DEGs進(jìn)行GO功能和KEGG通路注釋及富集分析(Omicshare Tools, http:∥www.omicshare. com/tools/home/index/index.html)。FDR≤0.01為差異極顯著基因。

1.4 DEGs的RT-qPCR驗(yàn)證

為驗(yàn)證RNA-Seq數(shù)據(jù)的可靠性，從DEGs中隨機(jī)挑選了5個DEGs,即二氫嘧啶酶(dihydropyrimidinase, DPYS)基因、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(UNC-51-like kinase 3, ULK3)基因、過氧化物酶體?；o酶A氧化酶3(peroxisomal acyl-coenzyme A oxidase 3, ACOX3)基因、叉頭框蛋白(forkhead box protein O, FoxO)基因和脂肪?；o酶A還原酶CG5065(putative fatty acyl-CoA reductase CG5065, FACRCG5065)基因，進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證并利用NCBI Primer Blast設(shè)計引物(表1)。從3個蜂群再次取樣，取樣方法同1.1節(jié)。每個樣本設(shè)置3個蜂群的生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)。利用全式金生物科技有限公司的Transzol Up Plus RNA Kit試劑盒提取樣本總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第1鏈(北京全式金生物技術(shù)有限公司)。以上述的cDNA作為模板進(jìn)行qPCR。qPCR反應(yīng)體系(20 μL): H2O 6.6 μL, 2×TransStart SuperMix 10 μL, 上下游引物(5 μmol/L)各1 μL, cDNA模板1 μL, Dye II 0.4 μL。qPCR反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性30 s; 95℃變性5 s, 60℃退火和延伸30 s, 共40 個循環(huán)；熔解曲線默認(rèn)系統(tǒng)程序95℃ 5 s; 60℃ 30 s; 95℃ 1 s(QuantStudio5, 美國)。以Actin作為內(nèi)參基因。

表1 引物信息

1.5 數(shù)據(jù)分析

RT-qPCR實(shí)驗(yàn)基因的表達(dá)水平按照2-ΔΔCt法進(jìn)行計算(Livak and Schmittgen, 2001)，每個目的基因進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)，取平均值，并計算數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)差；應(yīng)用SPSS V21.0軟件對RT-qPCR實(shí)驗(yàn)處理組與對照組之間平均相對表達(dá)量的差異顯著性進(jìn)行非配對T檢驗(yàn)。RT-qPCR數(shù)據(jù)結(jié)果在與RNA-Seq測序數(shù)據(jù)對比時，先經(jīng)過log2(平均值)的轉(zhuǎn)換。

2 結(jié)果

2.1 測序結(jié)果質(zhì)量評估

通過對CK和T測序，分別得到原始讀段平均為51 929 304.67和51 198 348.67，過濾后得到高質(zhì)量有效讀段平均分別為50 122 846和50 803 814。統(tǒng)計兩端的Q20和Q30平均分別在98.20%和94.85%以上，表明本研究測序數(shù)據(jù)質(zhì)量良好，可用于進(jìn)一步分析。

2.2 低溫脅迫后的DEGs

8 d封蓋子20℃低溫脅迫96 h后，CKvsT間DEGs總數(shù)為1 101個，上調(diào)基因總數(shù)為330個，下調(diào)基因總數(shù)771個，下調(diào)基因數(shù)大于上調(diào)基因數(shù)。

2.3 DEGs的GO功能和KEGG通路注釋及富集分析

對獲得DEGs的GO功能注釋和富集分析結(jié)果表明，DEGs主要富集在生物學(xué)過程(biological process)(518個)，分子功能(molecular function)(307個)和細(xì)胞組分(cellular components)(276個)3大類的27個二級GO條目上，其中基因富集數(shù)最多的是代謝過程(metabolic process)(142個)和細(xì)胞進(jìn)程(cellular process)(142個)，其次是結(jié)合(binding)(131個)、催化活性(catalytic activity)(120個)和單有機(jī)體過程(single organism process)(118個)。上調(diào)基因富集最多的為結(jié)合(45個)，其次是細(xì)胞進(jìn)程(43個)和代謝過程(41個)；下調(diào)基因富集最多的為代謝過程(101個)和細(xì)胞進(jìn)程(99個)，其次是單有機(jī)體過程(92個)和結(jié)合(86個)。在不同的GO條目上下調(diào)基因數(shù)均多于上調(diào)基因數(shù)(圖1)。

圖1 低溫脅迫西方蜜蜂工蜂8 d封蓋子DEGs的GO分類

KEGG通路注釋和富集分析結(jié)果顯示，DEGs富集的通路分為細(xì)胞進(jìn)程(30個)、環(huán)境信息加工(environmental information processing)(30個)、遺傳信息加工(genetic information processing)(49個)、代謝(metabolism)(456個)、有機(jī)體系統(tǒng)(organismal system)(9個)5大類(圖2)；DEGs富集在113個通路上，富集數(shù)排在前10的全部富集于代謝模塊，其中富集數(shù)最多通路的是代謝通路(signaling pathway)(99個)，其次是次生代謝物的生物合成(biosynthesis of secondary metabolites)(36個)、抗生素的生物合成(antibiotic biosynthesis)(26個)、 微生物在不同環(huán)境中的代謝(metabolism of microorganism in different environments)(24個)、碳代謝(carbon metabolism)(15個)、嘌呤代謝(purine metabolism)(13個)、氨基糖和核苷酸糖代謝(amino sugar and nucleotide sugar metabolism)(12個)、脂肪代謝(lipid metabolism)(11個)、氨基酸的生物合成(biosynthesis of amino acids)(11個)。與抗氧化系統(tǒng)相關(guān)的過氧化物酶體通路差異極顯著基因數(shù)有10個，均下調(diào)表達(dá)，其中控制短鏈脫氫酶家族成員4(DHRS4)合成的相關(guān)基因有兩個(LOC100577607和LOC412304)；控制脂酰輔酶A還原酶合成相關(guān)的基因有3個(LOC100576414,LOC100578329和LOC725187)。而與谷胱甘肽相關(guān)的D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝通路、谷胱甘肽代謝通路上的谷氨酸脫氫酶基因(LOC409253)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因(LOC552283)下調(diào)表達(dá)。與發(fā)育密切相關(guān)的昆蟲激素代謝通路中，控制合成保幼激素環(huán)解酶基因(JHEH)下調(diào)表達(dá)，mTOR信號通路控制合成絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因(ULK3)下調(diào)表達(dá)，且FoxO信號通路叉頭框蛋白基因(FoxO)及胰島素受體基因(INSR)上調(diào)表達(dá)(表2)。

圖2 低溫脅迫西方蜜蜂工蜂8 d封蓋子DEGs的KEGG 通路分析

2.4 DEGs的RT-qPCR驗(yàn)證

為驗(yàn)證測序數(shù)據(jù)的可靠性，選取5個DEGs的表達(dá)量進(jìn)行RT-qPCR定量檢測，結(jié)果與對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中這些差異基因的趨勢一致。RNA測序結(jié)果的基因表達(dá)水平變化趨勢一致，證實(shí)RNA測序結(jié)果可信(圖3)。

圖3 低溫脅迫西方蜜蜂工蜂8 d封蓋子DEGs的RNA-Seq測序數(shù)據(jù)的RT-qPCR驗(yàn)證

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫可導(dǎo)致調(diào)控發(fā)育系統(tǒng)發(fā)生異常，可能是蜜蜂蛹發(fā)育停滯或減緩的原因，封蓋子以此降低代謝，降低能量消耗，保存實(shí)力應(yīng)對低溫帶來的不良影響；同時低溫脅迫可能影響谷胱甘肽代謝、過氧化物酶體等影響抗氧化水平，蜜蜂蛹累積氧化損傷，從而羽化蜜蜂受到影響；蜜蜂蛹中期低溫脅迫，蜜蜂蛹發(fā)育停滯或減緩以應(yīng)對低溫帶來的不良影響，可能與保幼激素(JH)降解受到影響，蛻皮激素(20E)合成減少，F(xiàn)oxO磷酸化，細(xì)胞自噬被抑制等系列變化有關(guān)。蜜蜂的生長發(fā)育由20E和JH及胰島素等多種激素共同調(diào)控的(Pursleysetal., 2000; Wangetal., 2013)，激素的滴度變化共同誘導(dǎo)著蜜蜂的發(fā)育過程(劉川冬等, 2017)。研究結(jié)果顯示差異表達(dá)基因保幼激素環(huán)解酶基因(JHEH)下調(diào)表達(dá)(表2)，另一方面，F(xiàn)oxO基因上調(diào)表達(dá)(表2)，F(xiàn)oxO與JHEH啟動子序列結(jié)合，可抑制JHEH表達(dá)(Zengetal., 2017)，這兩個基因的差異表達(dá)均可導(dǎo)致與JH降解相關(guān)的JHEH的合成減少。JHEH的作用是降解JH(Zhangetal., 2005; Tsubotaetal., 2010)，調(diào)控JH滴度降低。因此推測低溫脅迫導(dǎo)致JH的降解受到影響，JH滴度與正常發(fā)育個體相比相對較高，有助于蜜蜂發(fā)育維持現(xiàn)狀。我們還發(fā)現(xiàn)低溫處理后參與20E合成的基因P450302a1(Dib)(Chávezetal., 2000)下調(diào)表達(dá)(表2)，同時，JH滴度相對較高也會抑制20E合成(Gaoetal., 2022)，這說明低溫脅迫封蓋子會使20E合成減少。低溫處理后胰島素受體基因(INSR)上調(diào)表達(dá)(表2)，INSR具有磷酸化FoxO蛋白的功能，F(xiàn)oxO蛋白如果發(fā)生磷酸化就無法入核，而留在細(xì)胞質(zhì)被降解。昆蟲在發(fā)育過程中，F(xiàn)oxO蛋白具有啟動蛻皮激素下游初級應(yīng)答基因Br-C傳遞蛻皮信號和發(fā)揮皮層融離作用(Heeetal., 2012; Süren-Castilloetal., 2012; Caietal., 2016)，是蛻皮激素發(fā)揮功能的重要環(huán)節(jié)(Gonzyetal., 2002)。說明低溫抑制了蛻皮激素功能，從而發(fā)育緩慢或停止發(fā)育。這與本團(tuán)隊對低溫處理蜜蜂化蛹期封蓋子轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)胰島素類似物基因(ILP)的表達(dá)量上調(diào)會導(dǎo)致FoxO磷酸化后無法激活20E下游基因(姚丹等, 2020)相似，說明在不同發(fā)育階段低溫脅迫均會造成FoxO磷酸化，但其上游的胰島素信號通路中差異基因不同。此外，還檢測到mTOR信號通路絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因(ULK3)下調(diào)表達(dá)。mTOR信號通路是生長調(diào)節(jié)的重要環(huán)節(jié)，mTOR通路主要通過生長因子，胰島素與胰島素樣生長因子(IGF)和氨基酸和葡萄糖營養(yǎng)來調(diào)節(jié)細(xì)胞生長，參與細(xì)胞自噬(Sarkaretal., 2007; Yang and Guan, 2007)。而此酶在細(xì)胞自噬過程中發(fā)揮重要作用，介導(dǎo)自噬的起始(Russelletal., 2013)，ULK3基因表達(dá)受到低溫影響后，細(xì)胞自噬也將受到不同程度的影響。因此，低溫脅迫影響蛹中期的細(xì)胞自噬而使蜜蜂發(fā)育減緩。

表2 低溫脅迫西方蜜蜂工蜂8 d封蓋子的DEGs與發(fā)育及抗氧化相關(guān)的KEGG通路

蜜蜂發(fā)育階段通過激素調(diào)控停止或減緩發(fā)育，而非抗寒小分子物質(zhì)積累或抗凍蛋白來度過低溫環(huán)境。很多昆蟲處于低溫環(huán)境中時，積累小分子物質(zhì)以抵御低溫環(huán)境(Baustetal., 1984; 歐陽芳和戈峰, 2014)。昆蟲利用小分子物質(zhì)積累及抗凍蛋白(AFPs)使冰點(diǎn)及過冷卻點(diǎn)降低以抵御低溫，利用熱激蛋白(HSPs)恢復(fù)肽鏈功能。沙蔥螢葉甲Galerucadaurica蟲體內(nèi)抗寒系統(tǒng)為小分子碳水化合物-氨基酸類-脂肪(李浩等, 2014)；二化螟Chilosupperssalis滯育幼蟲以蛋白質(zhì)及小分子糖類積累來抵御低溫(張擁軍, 2007)。AFPs通過與冰晶不可逆結(jié)合降低昆蟲過冷卻點(diǎn)，云杉蚜蟲等昆蟲利用AFPs越冬(周艷霞等, 2006)。HSPs可促進(jìn)低溫影響的細(xì)胞內(nèi)肽鏈重新折疊恢復(fù)功能，葉蟬在-7.5～-5℃下hsp20及hsp70表達(dá)量上升以抵御低溫(Huangetal., 2007)。發(fā)育過程中的昆蟲多通過滯育或休眠的方式抵御低溫，這一過程中主要涉及滯育激素(DH)和JH來調(diào)控發(fā)育。家蠶Bombyxmori卵期通過DH的作用將體內(nèi)海藻糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖，通過小分子糖類物質(zhì)積累抵御低溫；熊蜂蜂王主要通過JH滴度調(diào)控卵巢活性使發(fā)育停滯(Fueusawaetal., 1999; Hartfelder, 2000)。本研究未發(fā)現(xiàn)HSP, AFP和DH基因差異表達(dá)，且正常工蜂不參與生殖，這說明處于發(fā)育階段的蜜蜂工蜂具有狹溫性，與其他昆蟲具有不同的抵御低溫機(jī)制，這種機(jī)制可能是狹溫性昆蟲所特有的。

低溫引起蛹中期工蜂抗氧化酶表達(dá)量下降，這可能會導(dǎo)致氧化還原平衡被破壞，內(nèi)部氧化水平升高，從而積累氧化損傷。在本研究中蜜蜂蛹中期經(jīng)過長時間低溫脅迫后，進(jìn)行差異表達(dá)基因的KEGG分析，結(jié)果顯示谷胱甘肽代謝通路谷胱甘肽脫氫酶基因(GDH)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶基因(GST)以及過氧化物酶體通路短鏈脫氫酶家族成員4基因(DHRS4)均下調(diào)表達(dá)(表2)，這些基因均與抗氧化相關(guān)。谷胱甘肽代謝相關(guān)酶通過使過氧化物失活抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧含量，從而維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡。GDH位于動植物以及微生物體內(nèi)的線粒體中，對于細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡起著至關(guān)重要的作用(Goldin and Frieden, 1971; Xuetal., 2016)。而GSTs參與調(diào)控昆蟲的抗逆功能，通過對中華蜜蜂GST基因進(jìn)行基因沉默后，發(fā)現(xiàn)蜜蜂存活率下降，體內(nèi)氧化水平升高，蜜蜂受到了氧化損傷(Enayatietal., 2005; Mengetal., 2014)。由此推測蜜蜂蛹中期受到低溫脅迫會使谷胱甘肽代謝受到影響，引起氧化損傷。此外，輔酶依賴性視黃醛脫氧還原酶(NRDR)作為一種羰基還原酶參與細(xì)胞內(nèi)多種物質(zhì)的氧化還原反應(yīng)(張靜, 2014)，NRDR由DHRS4基因翻譯而成(Perssonetal., 1995)，存在于吞噬細(xì)胞質(zhì)膜，能生成用于清除病原微生物的活性氧(Steck and Grassl, 2014)。低溫脅迫后封蓋子體內(nèi)控制NRDR合成的基因下調(diào)表達(dá)時，抗氧化酶作用受到影響，細(xì)胞可能積累氧化損傷。

低溫狀況下昆蟲需要抗氧化酶系統(tǒng)相關(guān)基因高表達(dá)以抵御低溫帶來的氧化損傷。昆蟲體內(nèi)的抗氧化酶主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD) (李周直等, 1994)。本研究結(jié)果顯示發(fā)育階段的蜜蜂抗氧化酶系統(tǒng)與成蜂及其他昆蟲不同，主要為谷胱甘肽脫氫酶(GDH)、谷胱甘肽還原酶(GR)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)等?；哪ハx小胸鱉甲Microderapunctipennis在低溫條件下抗氧化酶基因SOD高表達(dá)(肖榮, 2015)；西藏飛蝗在低溫條件下體壁與消化道的抗氧化酶SOD, POD和CAT活性增強(qiáng)，以維持蟲體氧化水平(吳蕾, 2010)；小金蝠蛾Hepialusxiaojinensis幼蟲受低溫影響4 h后，體內(nèi)丙二醛(MDA)含量增加，其GSTs活性增強(qiáng)(張青等, 2016)。從這些研究結(jié)果看出，一方面對低溫耐受能力強(qiáng)的昆蟲抗氧化酶種類與蜜蜂蛹中期不同，另一方面這些昆蟲通過抗氧化酶基因上調(diào)表達(dá)提高抗氧化能力，而有研究表明越冬期中華蜜蜂體內(nèi)磷酸海藻糖合成酶(TPS)及SOD基因表達(dá)水平隨低溫脅迫時間延長先升高后降低(夏振宇等, 2019)，結(jié)合本研究中抗氧化酶表達(dá)量下降，96 h的低溫處理強(qiáng)度超出蜜蜂抗氧化能力，推測其他昆蟲延長低溫處理時間也會和蜜蜂一樣出現(xiàn)抗氧化酶表達(dá)量下降的現(xiàn)象，但這個時間可能需要很長。