橡膠樹(shù)多主棒孢拮抗細(xì)菌BACYitc8-7的分離鑒定及其揮發(fā)性抑菌物質(zhì)組分分析

戴利銘，李嵐嵐，施玉萍，劉一賢，鄧樂(lè)曄，吳忠華，蔡志英

橡膠樹(shù)多主棒孢拮抗細(xì)菌BACYitc8-7的分離鑒定及其揮發(fā)性抑菌物質(zhì)組分分析

戴利銘，李嵐嵐，施玉萍，劉一賢，鄧樂(lè)曄，吳忠華，蔡志英*

云南省熱帶作物科學(xué)研究所，云南景洪 666100

多主棒孢菌（）是為害橡膠葉片的一種重要病原真菌，目前生產(chǎn)上普遍使用化學(xué)農(nóng)藥防治該病害，給植膠區(qū)的生態(tài)環(huán)境帶來(lái)很多負(fù)面影響，從橡膠樹(shù)根際土壤中篩選對(duì)橡膠樹(shù)多主棒孢菌具有高拮抗活性的細(xì)菌，可為橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病生防藥劑的研發(fā)提供理論依據(jù)。本研究通過(guò)稀釋涂布、平板對(duì)峙法從發(fā)病橡膠樹(shù)根際土壤中分離篩選到1株對(duì)橡膠樹(shù)多主棒孢菌具有高拮抗活性的細(xì)菌，抑菌帶為(57.68±0.66)mm，且該菌株對(duì)9種重要的植物病原真菌均具有抑制作用；經(jīng)過(guò)形態(tài)觀察、生理生化檢測(cè)及基因序列分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與銅綠假單孢菌基本相符，命名為BACYitc8-7；以LB、NA、高氏、金氏B和PDA為營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，評(píng)定不同營(yíng)養(yǎng)條件下菌株BACYitc8-7揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)多主棒孢菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)菌株BACYitc8-7在金氏B和LB培養(yǎng)基上的拮抗作用最強(qiáng)，抑菌率達(dá)43.47%～48.69%；利用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法（HS-SPME-GC-MS）收集并檢測(cè)菌株BACYitc8-7揮發(fā)性物質(zhì)的抑菌組分，獲得包括胺類(lèi)、醇類(lèi)、烯類(lèi)、酚類(lèi)、酯類(lèi)、吡嗪類(lèi)等35種物質(zhì)，其中含量前5的物質(zhì)為胺、硼烷二甲硫醚絡(luò)合物、異戊醇、1-十三烯和2-甲基-3-甲硫基呋喃。

多主棒孢；拮抗細(xì)菌；分離鑒定；揮發(fā)性物質(zhì)；抑菌組分

橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病病原菌為多主棒孢[(Berk and curt.) Wei]，屬半知菌類(lèi)（Deuteromycotina）絲孢綱（Hyphom-yce-tes）絲孢目（Hyphomycetales）暗色菌科（Dema-tia-ceae）棒孢屬（）[1]，可侵害橡膠樹(shù)的幼苗、老葉、幼樹(shù)和成齡樹(shù)的嫩葉，導(dǎo)致植株樹(shù)冠稀疏和矮縮，對(duì)我國(guó)橡膠生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。多主棒孢菌是一種寄主范圍廣泛、世界性分布的植物病原真菌，能侵染葫蘆科、無(wú)患子科、大戟科及楝科等380屬530種植物[3]。多主棒孢的發(fā)生、流行與寄主植物抗病性、環(huán)境條件和人類(lèi)活動(dòng)等因素有關(guān)，其孢子可借助風(fēng)雨傳播[4]。

目前，化學(xué)藥劑結(jié)合農(nóng)業(yè)防治是防治橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病的主要方法[5-6]。農(nóng)業(yè)防治措施為選育和嫁接抗病品系、避免在發(fā)病林地附近建苗圃、嚴(yán)禁從發(fā)病膠園采種、發(fā)病嚴(yán)重的苗圃需全部砍除并對(duì)土壤進(jìn)行消毒。化學(xué)藥劑主要有咪鮮胺、苯來(lái)特、百菌清、代森錳鋅和甲基托布津等。隨著農(nóng)業(yè)快速發(fā)展，農(nóng)藥用量不斷增加，使用化學(xué)農(nóng)藥所帶來(lái)的高殘留、高污染及對(duì)人畜的危害等問(wèn)題正逐漸突顯。

目前兼具安全、綠色、高效等特性的綠色防控技術(shù)成為當(dāng)下的研究熱點(diǎn)，其中應(yīng)用生物拮抗菌來(lái)防治各種病害被證實(shí)是一種安全有效的新方法[7]。國(guó)內(nèi)報(bào)道對(duì)多主棒孢菌有拮抗作用的細(xì)菌屬芽孢桿菌類(lèi)最為豐富。趙昱榕等[8]從黃瓜植株體內(nèi)分離篩選得到貝萊斯芽胞桿菌，該菌株能產(chǎn)生大量活性物質(zhì)，對(duì)多主棒孢菌具有顯著的拮抗效果。時(shí)濤等[9]從橡膠樹(shù)組織中分離到2株對(duì)橡膠樹(shù)多主棒孢菌有拮抗作用的內(nèi)生枯草芽孢桿菌。李嵐嵐等[10]從橡膠根部組織發(fā)現(xiàn)4株解淀粉芽孢桿菌對(duì)橡膠樹(shù)多主棒孢菌和尖孢炭疽菌有一定的抑制效果。桑建偉[11]從健康的香蕉植株根部組織中分離得到1株對(duì)番茄多主棒孢菌和辣椒炭疽菌有拮抗作用的解淀粉芽孢桿菌。此外，吳利民等[12]研究發(fā)現(xiàn)真菌哈茨木霉（）對(duì)黃瓜多主棒孢菌的抑制率高達(dá)98.2%。劉一賢等[13]發(fā)現(xiàn)桑樹(shù)鏈霉菌對(duì)橡膠樹(shù)褐根病、橡膠樹(shù)多主棒孢菌具有一定的抑制作用。陳旭玉等[14]從廣藿香的根際土壤中分離得到能抑制廣藿香多主棒孢菌的銅綠假單胞菌（）CC1。目前芽孢桿菌類(lèi)是對(duì)多主棒孢菌有拮抗作用報(bào)道最多的生防菌，其他微生物報(bào)道甚少。微生物生活在生物圈的各個(gè)角落，分泌的活性物質(zhì)多種多樣，不同來(lái)源的拮抗菌株抑菌效果和抑菌譜均不同，因此對(duì)不同環(huán)境來(lái)源新拮抗菌株資源的篩選與評(píng)價(jià)，對(duì)生防菌資源的開(kāi)發(fā)有著重要的實(shí)際意義。

銅綠假單胞菌是一類(lèi)具有生物研究?jī)r(jià)值的微生物資源菌，能夠產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)鐵載體、綠膿菌素、吩嗪-1-羧酸、吩嗪-1-酰胺、鼠李糖脂和胞外多糖等[15]。銅綠假單胞菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)在農(nóng)作物病蟲(chóng)害的生物防治上也有廣泛的應(yīng)用[16]，但目前尚未見(jiàn)銅綠假單胞菌防治橡膠多主棒孢菌的報(bào)道。本研究從云南西雙版納橡膠樹(shù)根際土壤中篩選具有生防作用的菌株，并對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)鑒定；同時(shí)對(duì)拮抗菌抑菌譜、揮發(fā)性物質(zhì)抑菌能力及揮發(fā)性物質(zhì)組分進(jìn)行分析。為開(kāi)發(fā)防治多主棒孢菌的新型殺菌劑奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為菌株的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品 從云南省西雙版納州景洪市橡膠樹(shù)（棒孢霉落葉?。└鶇^(qū)土壤采集土樣，利用5點(diǎn)采樣法，去除地表土壤，取深度約為5～20 cm的土壤裝入無(wú)菌自封袋，帶回實(shí)驗(yàn)室于4℃冷藏備用。

1.1.2 主要儀器及培養(yǎng)基 PCR引物，購(gòu)自北京六合華大基因科技有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒，購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司。LB培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基、金氏B、NA培養(yǎng)基為常規(guī)配方。

1.1.3 供試菌株 靶標(biāo)病原菌尖孢炭疽菌（）DFMP1E和MLZZP3、膠孢炭疽菌（）NPS1a-2、多主棒孢菌（）JCMP7A、橡膠樹(shù)褐根菌（）JPNC4、小孢擬盤(pán)多毛孢（）MF375898、橡膠疫霉菌（）OJ20180523、五隔大無(wú)性孢麗赤殼菌（）OJ20180629及茄類(lèi)鐮刀菌（）XJ160901均由本實(shí)驗(yàn)室分離保存[13]。

1.2 方法

1.2.1 拮抗細(xì)菌的分離和篩選 （1）拮抗細(xì)菌的分離：稱(chēng)取1 g土樣放入加有100 mL的LB培養(yǎng)基的三角瓶中，振蕩培養(yǎng)30 min（30℃，180 r/min）后，采用梯度稀釋法取300倍稀釋液200 μL涂布在LB培養(yǎng)基中。倒置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，挑取菌落形態(tài)不同的單菌落進(jìn)行編號(hào)，甘油管?20℃保存。

（2）拮抗細(xì)菌的篩選：采用對(duì)峙培養(yǎng)法篩選拮抗細(xì)菌，將多主棒孢菌接種在平板中央，然后在其四周等距離處接種待測(cè)菌，以?xún)H接種多主棒孢菌餅的平板為對(duì)照，將平板置于30℃培養(yǎng)箱內(nèi)4～5 d后，取出平板十字交叉法測(cè)量病原菌直徑，每個(gè)菌株重復(fù)測(cè)試3次。

采用指示菌的生長(zhǎng)抑制率評(píng)價(jià)拮抗細(xì)菌的能力。抑菌帶寬=對(duì)照組菌落生長(zhǎng)直徑-處理組菌落生長(zhǎng)直徑；抑制率=（對(duì)照組菌落生長(zhǎng)直徑-處理組菌落生長(zhǎng)直徑）/（對(duì)照組菌落生長(zhǎng)直徑-接種菌塊直徑）×100%。

1.2.2 拮抗細(xì)菌的鑒定 將拮抗細(xì)菌單菌落劃線接種于LB、NA、PDA、高氏、金氏B培養(yǎng)基上，在30℃的恒溫箱中培養(yǎng)1 d后，觀察菌落形態(tài)特征。生理生化指標(biāo)的測(cè)定參考申順善等[17]和寧爽[18]的方法。

1.2.3 拮抗細(xì)菌抑菌廣譜性測(cè)定 以尖孢炭疽菌、膠孢炭疽菌、多主棒孢菌、橡膠樹(shù)褐根菌、小孢擬盤(pán)多毛孢、橡膠疫霉菌、五隔大無(wú)性孢麗赤殼菌和茄類(lèi)鐮刀菌為病原菌，采用對(duì)峙培養(yǎng)法測(cè)定拮抗細(xì)菌對(duì)不同病原菌的抑制作用。

1.2.4基因和基因鑒定基因的擴(kuò)增引物及吩嗪-1-羧酸（phenazine-1- carboxylic acid，PCA）基因的引物見(jiàn)表1[19]，由深圳華大基因科技有限公司合成。

基因和功能基因鑒定的PCR反應(yīng)體系均采用50 μL總體系，其中2×EsTaq Master Mix 25 μL，基因組DNA 2 μL，27F和1492R引物（10 μmol/L）各1 μL，用ddH2O補(bǔ)足至50 μL?；虻腜CR反應(yīng)條件：95℃變性5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后測(cè)序。功能基因反應(yīng)條件：95℃變性5 min；95℃ 30 s，58℃退火30 s，72℃復(fù)性1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸8 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送往深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序

系統(tǒng)發(fā)育學(xué)特征：將測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLASTn程序進(jìn)行比對(duì)，運(yùn)用MEGA 6.0軟件的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Bootstrap設(shè)為1000。

表1 本研究所用引物

1.2.5 拮抗細(xì)菌揮發(fā)性產(chǎn)物對(duì)多主棒孢菌的作用 參照梁艷瓊等[20]的雙皿對(duì)扣法，將拮抗細(xì)菌接種于50 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min培養(yǎng)12 h后，取已培養(yǎng)好的發(fā)酵液50 μL，均勻涂布于含LB培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿皿底，并將多主棒孢菌塊（直徑為5 mm）接種在含PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿蓋中間，將后者與前者對(duì)扣，兩皿接觸處用封口膜密封，以空白的LB平板和接種有病原菌的PDA皿蓋對(duì)扣為對(duì)照，重復(fù)3次。28℃黑暗培養(yǎng)4～5 d，十字交叉法測(cè)定處理組和對(duì)照組的多主棒孢菌落直徑，并計(jì)算抑制率。

1.2.6 外源營(yíng)養(yǎng)對(duì)拮抗細(xì)菌揮發(fā)性物質(zhì)抑菌活性的影響 采用LB、NA、高氏、金氏B和PDA 5種不同培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，檢測(cè)外源營(yíng)養(yǎng)對(duì)拮抗細(xì)菌揮發(fā)性物質(zhì)抑菌活性的影響。以抑制率評(píng)定不同營(yíng)養(yǎng)條件下拮抗細(xì)菌所產(chǎn)揮發(fā)物作用活性的強(qiáng)弱，篩選產(chǎn)抑菌揮發(fā)物質(zhì)的最優(yōu)培養(yǎng)基。指示菌為多主棒孢菌，將拮抗菌接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，取100 μL培養(yǎng)好的發(fā)酵液，分別涂布至上述5種培養(yǎng)基中。雙皿對(duì)扣法和測(cè)定方法同1.2.5。

1.2.7 揮發(fā)性物質(zhì)的HS-SPME-GC-MS鑒定 參照梁艷瓊等[20]的方法，在滅菌的頂空瓶（20 mL）中制作LB培養(yǎng)基，取拮抗菌株種子液50 μL接種在含LB培養(yǎng)基的頂空瓶中，將瓶蓋密封后再用封口膜密封瓶蓋外層，置于28℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，重復(fù)3次，以不接種拮抗菌株的培養(yǎng)基為對(duì)照。

萃取頂空瓶中的揮發(fā)物采用頂空固相微萃取方法。色譜柱為DB-5MS（30 m×250 μm× 0.25 μm），萃取頭采用50/30 μm DVB/CAR/ PDMS，升溫程序、載氣、質(zhì)譜條件、電離方式、電子能量、掃描質(zhì)量范圍均參照梁艷瓊等[20]的方法。將所得氣體成分采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)（Library of the National Institute of Standardsand Technology，NIST）鑒定揮發(fā)性物質(zhì)成分，再去掉對(duì)照和實(shí)驗(yàn)中同時(shí)存在的化合物成分，最終確定揮發(fā)性物質(zhì)的組分。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的分離和篩選

以多主棒孢菌作為指示菌，從西雙版納橡膠樹(shù)根際土壤中分離得到16株具有抑制作用的菌株，其中對(duì)多主棒孢菌抑菌帶最寬的菌株編號(hào)為BACYitc8-7（圖1），其抑菌直徑為57.68 mm。

A：多主棒孢菌；B：菌株BACYitc8-7的拮抗作用。

2.2 拮抗菌株BACYitc8-7的鑒定

2.2.1 菌落形態(tài)特征 BACYitc8-7革蘭氏染色陰性，有鞭毛，無(wú)芽胞，菌體呈球桿狀。在LB、NA、PDA、高氏、金氏B不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)詳見(jiàn)表2。

表2 菌株BACYitc8-7的培養(yǎng)特征

2.2.2 生理生化特征 生理生化結(jié)果顯示，菌株BACYitc8-7能利用D-木糖、甘露糖、D-葡萄糖、檸檬酸鹽、甲基紅、甘油，可使明膠液化、脂肪分解、氧化酶陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性、膿青素陽(yáng)性、硝酸鹽還原、接觸酶陽(yáng)性，但不能利用乳糖、D果糖、L-阿拉伯糖、蔗糖、麥芽糖、L-鼠李糖、半乳糖、肌醇，不產(chǎn)生硫化氫、氨氣、吲哚，不能利用淀粉，可在42℃下生長(zhǎng)，但不能在4℃下生長(zhǎng)，耐鹽濃度最高為5%。

2.3 拮抗菌株抗菌譜研究

菌株BACYitc8-7對(duì)尖孢炭疽菌MLZZP3、DFMP1、膠孢炭疽菌、多主棒孢菌、橡膠樹(shù)褐根菌、小孢擬盤(pán)多毛孢、橡膠疫霉菌、五隔大無(wú)性孢麗赤殼菌和茄類(lèi)鐮刀菌均有抑制作用（表3），其中對(duì)多主棒孢菌和小孢擬盤(pán)多毛孢抑制作用最好（圖1和圖2），抑菌直徑分別達(dá)(57.68±0.66)mm、(66.25±2.03)mm，其次對(duì)五隔大無(wú)性孢麗赤殼菌和橡膠樹(shù)褐根菌2種病原菌的抑菌能力較強(qiáng)，對(duì)尖孢炭疽菌MLZZP3和DFMP1的抑制作用最弱?？咕V試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株BACYitc8-7具有廣譜抗菌活性，尤其對(duì)半知菌類(lèi)病原菌的抑制作用顯著，推測(cè)BACYitc8-7在半知菌類(lèi)病原菌生防領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

表3 菌株BACYitc8-7對(duì)不同病原真菌的抑制作用

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（<0.05）。

Note: Different lowercase letters after the same column of data indicate significant difference (<0.05).

A；小孢擬盤(pán)多毛孢；B：菌株BACYitc8-7的拮抗作用。

2.4 BACYitc8-7菌株的16S rRNA基因和PCA基因鑒定

2.4.1基因聚類(lèi)分析 采用基因通用引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1500 bp條帶，將得到的序列于NCBI上BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)菌株BACYitc8-7與strain DSM 50071（NR 117678.1）、strain NBRC 12689（NR 113599. 1）和strain ATCC 10145（NR 114471.1）的同源性最高，均為99.93%。序列提交到GenBank，獲得登錄號(hào)為MW320450。采用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示，菌株BACYitc8-7與聚在一支上，說(shuō)明其親緣關(guān)系很近（圖3）。因此，在結(jié)合形態(tài)學(xué)及生理生化性質(zhì)分析結(jié)果的基礎(chǔ)上鑒定菌株BACYitc8-7為銅綠假單胞菌。

2.4.2 PCA鑒定 以菌株BACYitc8-7的基因組DNA為模板，用引物PCA2a/PCA3b進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)菌株中擴(kuò)增到目的片段大小與預(yù)期相符，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化并測(cè)序。將核苷酸序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物與來(lái)源的phenazine biosynthesis protein PhzC（MBH9480114.1）的相似性最高，達(dá)98%；與來(lái)源的PhzC（ABN80405.1）有97%的相似性。表明菌株BACYitc8-7含有吩嗪-1-羧酸（phenazine-1-carboxylic acid，PCA）抗菌物質(zhì)的合成相關(guān)基因。

圖3 基于16S rRNA基因序列的菌株BACYitc8-7及GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析

2.5 菌株BACYitc8-7揮發(fā)性產(chǎn)物對(duì)多主棒孢菌的抑制作用

當(dāng)對(duì)照多主棒孢菌平均菌落直徑達(dá)67.34 mm時(shí)，實(shí)驗(yàn)組多主棒孢菌平均菌落直徑為36.98 mm，平均抑制率達(dá)48.70%（表4），表明菌株BACYitc8-7能夠產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)，且該物質(zhì)對(duì)多主棒孢菌有良好的拮抗作用。

2.6 外源營(yíng)養(yǎng)對(duì)菌株BACYitc8-7揮發(fā)性物質(zhì)抑菌活性的影響

菌株BACYitc8-7能夠在金氏B、LB、NA、高氏和PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，不能在查氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；以多主棒孢菌為指示菌時(shí)，BACYitc8-7在金氏B、LB、NA、高氏和PDA培養(yǎng)基上均能產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)抑制多主棒孢菌的生長(zhǎng)，其抑菌率分別達(dá)43.47%±1.0%、48.69%±2.0%、16.02%±0.5%、11.95%±2.0%、25.89%±2.0%（表4）。表明菌株BACYitc8-7在金氏B和LB培養(yǎng)基上的產(chǎn)生抑菌揮發(fā)物最強(qiáng)，抑菌率達(dá)43.47%～48.69%。因此，選擇LB為BACYitc8-7產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)的最優(yōu)培養(yǎng)基。

表4 不同培養(yǎng)基中菌株BACYitc8-7所產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)的抑菌活性

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（<0.05）。

Note: Different lowercase letters after the same column indicate significant difference (<0.05).

2.7 菌株BACYitc8-7揮發(fā)性物質(zhì)的HS-SPME- GC-MS鑒定

依據(jù)NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)將頂空瓶中的揮發(fā)物進(jìn)行匹配分析，排除LB培養(yǎng)基處理及菌株BACYitc8-7+LB培養(yǎng)基處理中共有的物質(zhì)，獲得35種揮發(fā)性物質(zhì)，包括胺類(lèi)、醇類(lèi)、烯類(lèi)、酚類(lèi)、酯類(lèi)、吡嗪類(lèi)等；將所獲物質(zhì)按峰面積降序排列，獲得含量前10排名為胺、硼烷二甲硫醚絡(luò)合物、異戊醇、1-十三烯、2-甲基-3-甲硫基呋喃、2-壬基醇、1,4-戊二烯、2-丙基-1-戊醇、異丙醇、芐基甲基硫醚；說(shuō)明醇類(lèi)物質(zhì)為菌株BACYitc8-7的主要揮發(fā)性物質(zhì)（表5）。

3 討論

本研究采用稀釋涂布、平板對(duì)峙法從橡膠樹(shù)根際土壤中獲得拮抗橡膠樹(shù)多主棒孢菌的生防細(xì)菌BACYitc8-7。通過(guò)形態(tài)觀察、生理生化檢測(cè)及基因序列分析確定菌株BACYitc8-7為銅綠假單胞菌。

GE等[21]報(bào)道銅綠假單胞菌M18可防治瓜類(lèi)枯萎病、辣椒疫病和水稻紋枯病。任小平等[16]報(bào)道銅綠假單胞菌粗提液對(duì)水稻紋枯病菌的抑制效果顯著。然而，銅綠假單胞菌抑制多主棒孢菌，國(guó)內(nèi)僅有陳旭玉等[14]報(bào)道過(guò)，其分離的銅綠假單胞菌CC1能抑制廣藿香多主棒孢菌，抑菌帶寬為10 mm；本研究獲得的菌株BACYitc8-7能抑制橡膠樹(shù)多主棒孢菌，抑菌帶寬達(dá)57.68 mm，說(shuō)明本研究獲取的銅綠假單胞菌抑制多主棒孢菌的能力優(yōu)于CC1。此外，菌株BACYitc8-7還對(duì)小孢擬盤(pán)多毛孢具有很好的抑制作用，抑菌帶寬高達(dá)66.25 mm。小孢擬盤(pán)多毛孢為重要的植物病原體，能引起橄欖果實(shí)腐爛、閩楠葉枯病、麻瘋樹(shù)葉枯病等[22]。在澳洲堅(jiān)果種植基地，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)有小孢擬盤(pán)多毛孢引起的澳洲堅(jiān)果葉枯、落葉等病害[23]。此外菌株BACYitc8-7對(duì)尖孢炭疽菌MLZZP3、尖孢炭疽菌DFMP1、膠孢炭疽菌、橡膠樹(shù)褐根菌、橡膠疫霉、五隔大無(wú)性孢麗赤殼菌、茄類(lèi)鐮刀菌均有抑制作用，由此可見(jiàn)，BACYitc8-7是一株具有廣譜抗菌活性的生防菌株。

假單胞菌（spp）的作用機(jī)制主要是產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物包括抗生素吩嗪-1-羧酸（phenazine-1-carboxylic acid，PCA）、2,4-二乙?；g苯三酚（2,4-diacetylphloroglucinol，PHL）、硝吡咯菌素（pyrrolnitrin，PRN）、藤黃綠膿菌素（pyoluterorin，PLT）、假單胞菌酸（pseudomonic acid）、氫氰酸和植物生長(zhǎng)素吲哚乙酸（indole-3- acetic acid，IAA）[24-25]，能防治青枯菌（）、絲核菌（）、疫霉菌（）、黑曲霉（）、辣椒炭疽病菌（）[26-30]等多種病原菌。為研究菌株BACYitc8-7中是否含有PCA、PHL、PLT、PRN這4類(lèi)次生代謝產(chǎn)物的基因，本研究參考張清霞等[19]的研究方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，最終僅有次生代謝產(chǎn)物基因成功獲取，說(shuō)明產(chǎn)生PCA來(lái)發(fā)揮抑菌作用是菌株BACYitc8-7可能的抑菌途徑之一。

表5 菌株BACYitc8-7揮發(fā)性物質(zhì)組分

與抗菌物質(zhì)或脂肽類(lèi)物質(zhì)相比，揮發(fā)性物質(zhì)中的抑菌物質(zhì)更易在土壤、空氣中擴(kuò)散和滲透[31]，F(xiàn)ERNANDO等[32]從細(xì)菌中分離鑒定到包括醛類(lèi)、醇類(lèi)、酮類(lèi)、硫化物等23種揮發(fā)性物質(zhì)，其中有6種物質(zhì)能夠抑制核盤(pán)菌菌絲的生長(zhǎng)和菌核的生成。GOTOR等[33]報(bào)道解淀粉芽孢桿菌CPA-8產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)3-羥基-2-丁酮、1,3-戊二烯、噻吩對(duì)、、均具有較好抑制作用。李寶慶等[34]從枯草芽孢桿菌BAB-1的揮發(fā)性物質(zhì)中明確了甲酸、正丙胺、二甲胺、丙酸4種揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)番茄灰霉菌具有極強(qiáng)的抑菌作用。細(xì)菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)除具有抑菌作用外，還有促生長(zhǎng)等作用，RYU等[35-36]報(bào)道乙酰甲基原醇（acetoin）、2,3-丁二醇（2,3-butanediol）能促進(jìn)擬南芥的生長(zhǎng)；TAHIR等[37]報(bào)道解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)1,2-苯并異噻唑-3-酮、苯甲醛和1,3-丁二烯可抑制青枯雷爾氏菌（）的運(yùn)動(dòng)性。

張清霞等[19]報(bào)道假單胞菌產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)化合物如3-羥基-2-丁酮及2R,3R-丁二醇等對(duì)植物病原菌有抑制作用。本研究用雙皿對(duì)扣法探究假單胞菌BACYitc8-7的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)橡膠樹(shù)多主棒孢菌的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)菌株揮發(fā)性物質(zhì)能抑制病原菌的生長(zhǎng)。采用HS-SPME-GC-MS對(duì)菌株BACYitc8-7揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其揮發(fā)性有機(jī)化合物包括胺類(lèi)、醇類(lèi)、烯類(lèi)、酚類(lèi)、酯類(lèi)、吡嗪類(lèi)等35種，其中戊二烯和噻吩這2種化合物與GOTOR等[33]報(bào)道相同，初步推斷戊二烯和噻吩在菌株BACYitc8-7抑制多主棒孢菌中起重要作用。

梁艷瓊等[20]利用雙皿對(duì)扣法和菌絲生長(zhǎng)速率法評(píng)定LB、TSB-YE、TSB、NB和PDA不同營(yíng)養(yǎng)條件下枯草芽孢桿菌Czk1產(chǎn)抑菌揮發(fā)性物質(zhì)的最優(yōu)培養(yǎng)基為L(zhǎng)B。本研究測(cè)定金氏B、LB、NA、高氏和PDA不同營(yíng)養(yǎng)條下菌株BACYitc8-7產(chǎn)抑菌揮發(fā)性物質(zhì)的最優(yōu)培養(yǎng)基為L(zhǎng)B，結(jié)果與梁艷瓊等[20]的報(bào)道相似。

本課題組通過(guò)表型鑒定和基因序列分析，從西雙版納橡膠樹(shù)根部土壤中篩選了一株銅綠假單胞菌BACYitc8-7。抑菌譜研究表明，菌株BACYitc8-7比已報(bào)道的拮抗多主棒孢菌的銅綠假單胞CC1具有更好的抑菌能力，且對(duì)植物病原體——小孢擬盤(pán)多毛孢也具有很好的抑菌能力。此外，發(fā)現(xiàn)菌株BACYitc8-7的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)橡膠樹(shù)多主棒孢菌具有抑菌效果；LB為產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)的最優(yōu)培養(yǎng)基；菌株BACYitc8-7揮發(fā)性物質(zhì)包括胺類(lèi)、醇類(lèi)、烯類(lèi)、酚類(lèi)、酯類(lèi)、吡嗪類(lèi)等35種，其中戊二烯和噻吩在菌株BACYitc8-7抑制多主棒孢菌中可能起重要作用。

假單胞菌在環(huán)境修復(fù)和生物防治等方面具有很大的應(yīng)用潛力，但是假單胞菌屬中的銅綠假單胞菌屬是動(dòng)、植物和人類(lèi)條件致病菌，對(duì)免疫力弱的病人具有一定的威脅性，雖然BACYitc8-7來(lái)源于橡膠根際，但其對(duì)人類(lèi)的致病性還未知。本課題組后續(xù)將針對(duì)BACYitc8-7的致病性、抑菌代謝產(chǎn)物定性、揮發(fā)性物質(zhì)中的主要抑菌組分進(jìn)行研究，為開(kāi)發(fā)新型綠色農(nóng)藥奠定基礎(chǔ)。

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DAI Liming, LI Lanlan, SHI Yuping, LIU Yixian, DENG Yueye, WU Zhonghua, CAI Zhiying*

Yunnan Institute of Tropical Crops, Jinghong, Yunnan 666100, China

is an important pathogen causingleaf fall disease of rubber trees. Chemical fungicides are widely used to prevent and control the disease at present, which brings severe ecological environmental issues in rubber planting areas. Isolating and screening bacteria strains with inhibitory activity againstfrom rhizosphere soil of rubber trees would provide theoretical foundation for researches and development of biological control agents onleaf fall disease. Bacteria with high antagonistic activity was obtained from the rhizosphere soil of rubber trees with leaf fall disease by using dilution plate coating and plate-confrontation, its bacteriostatic diameter was (57.68±0.66)mm.It was observed that nine important plant pathogenic fungi could be inhibited by the strain as well. Based on morphological, physiological, biochemical characteristics and 16S rRNA gene sequence, the strain was basically consistent with,and was named BACYitc8-7. The activity of the volatile compounds of BACYitc8-7 againstwas evaluated when LB, NA, Gause, Kim B and PDA were used as nutrition sources. The strongest antagonistic effects were found in Kim B and LB mediums, and the inhibition rate was43.47%?48.69%. 35 substances, including amines, alcohols, alkenes, phenols, esters and pyrazines were obtained from the antimicrobial components of BACYitc8-7 collected and detected by headspace solid phase micro extraction-gas chromatography-mass spectrometry (HS-SPME-GC-MS), and the top five contents were amine, borane dimethyl sulfide complex, isoamyl alcohol, 1-triene and 2-methyl-3-methylthiofuran, respectively.

; antagonistic bacteria; isolation and identification; volatile substances; antibacterial components

S794.1

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.08.013

2022-01-27；

2022-03-11

云南省熱帶作物科學(xué)研究所青年項(xiàng)目（No. QNCZ2020-8）；農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)性長(zhǎng)期性科技項(xiàng)目（No. ZX04S270200）；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃青年項(xiàng)目（No. 2018FD156）。

戴利銘（1990—），女，碩士，助理研究員，研究方向：植物保護(hù)與微生物利用。*通信作者（Corresponding author）：蔡志英（CAI Zhiying），E-mail：caizhiyingyn@sina.com。