利用DNA 條形碼技術(shù)對(duì)茶黑刺粉虱的鑒定與分析

張 莉，李 帥，張金峰，王威銳,3，孟澤洪

（1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006；3.貴州大學(xué)茶學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

茶黑刺粉虱（Aleurocanthus camelliaeKanmiya &Kasai）隸屬于半翅目（Hemiptera）粉虱科（Aleyrodidae）粉虱亞科（Aleyrodinae）刺粉虱屬（Aleurocanthus），是茶園里最常見(jiàn)的粉虱類害蟲(chóng)[1]。茶黑刺粉虱主要通過(guò)吸食葉片汁液、誘發(fā)煤煙病造成危害，從而影響樹(shù)勢(shì)，同時(shí)生產(chǎn)季節(jié)成蟲(chóng)的活動(dòng)也會(huì)干擾茶農(nóng)的勞作[2]。寄主為茶的茶黑刺粉虱（A. camelliae）與寄主為柑橘等植物的橘黑刺粉虱（A. spiniferus）的分類尚存在一定的爭(zhēng)論。早些年，一般認(rèn)為為害茶樹(shù)的黑刺粉虱即橘黑刺粉虱[3-4]；但基于生態(tài)學(xué)、形態(tài)學(xué)和分子進(jìn)化與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的研究結(jié)果表明，茶黑刺粉虱應(yīng)為獨(dú)立的物種[5]。目前，茶黑刺粉虱和橘黑刺粉虱的線粒體基因組均已公布[6-7]。但由于茶黑刺粉虱在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)被視為與橘黑刺粉虱同種，因此現(xiàn)已知的這2種粉虱的分子數(shù)據(jù)存在一定的混亂，需要進(jìn)行全面細(xì)致的區(qū)分。

DNA 條形碼技術(shù)（DNA Barcoding）是由加拿大的Hebert 博士首次提出的。該技術(shù)基于線粒體DNA 細(xì)胞色素C 氧化酶亞基I（mitochomdrail DNA cytochrome coxidase subunit I, mtDNACOI）基因進(jìn)行核苷酸序列分析，可利用mtDNACOI中一段特定區(qū)域（約658 bp）鑒定不同的物種[8]。目前，該技術(shù)已在諸多昆蟲(chóng)中得以驗(yàn)證與應(yīng)用[9-10]。

茶樹(shù)主要害蟲(chóng)茶黑刺粉虱的mtDNACOI基因數(shù)據(jù)極少且均不是目前鑒定上通用的DNA 條形碼特定標(biāo)準(zhǔn)區(qū)域序列片段[5]，如此不便于種類間的橫向比較，因此，筆者擬通過(guò)試驗(yàn)獲取茶黑刺粉虱DNA 條形碼特定標(biāo)準(zhǔn)區(qū)域（658 bp）的分子序列數(shù)據(jù)，并進(jìn)行遺傳距離及系統(tǒng)發(fā)育分析，以期為進(jìn)一步掌握茶黑刺粉虱DNA 條形碼以及分子鑒定提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試蟲(chóng)源采集信息如表1 所示，所有樣本均采自茶葉寄主，將采集到的粉虱置于裝有無(wú)水乙醇的2 mL 凍存管中，冷凍于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗(yàn)樣品信息

1.2 DNA 提取及PCR 擴(kuò)增

采用Qiagen DNEasy Tissue kit 試劑盒提取單頭蟲(chóng)體的DNA。蟲(chóng)體經(jīng)研磨破碎后，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，提取的DNA 用1%瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測(cè)，再采用通用引物L(fēng)CO1490/ HCO2198[11]對(duì)其mtDNACOI基因序列特定區(qū)域片段[8]進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增體系總體積為50 μL，包括10×PCR 緩沖液5 μL，25 mmol/L MgCl23 μL，2.5 mmol/L 的dNTP 混合液4 μL，10 μmol/L 的上下游引物各1.5 μL，5 U/μL 的TaKaRa TaqDNA 聚合酶0.3 μL 和DNA 模板2 μL，加ddH2O至50 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min；94℃30 s，Tm 40 s，72℃ 30 s，34 個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min；4℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后送上海立菲生物技術(shù)有限公司及北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

序列的拼接使用DNAMAN 軟件進(jìn)行，結(jié)合測(cè)序峰值圖進(jìn)行正反鏈的拼接校對(duì)，將拼接好的序列在NCBI 網(wǎng)站上利用BLAST 程序進(jìn)行序列同源性搜索，采用CLUSTALX2.0 進(jìn)行序列比對(duì)。比對(duì)后的結(jié)果采用Mega6 軟件[12]進(jìn)行序列組成分析、遺傳距離比較和NJ 樹(shù)構(gòu)建。下載已知的黑刺粉虱線粒體基因組數(shù)據(jù)KJ437166 和KU761949，并利用BIOEDIT 軟件截取獲得的同源DNA 條形碼特定區(qū)域658 bp 片段序列進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 條形碼特定區(qū)域片段的序列組成分析

如表1 所示，序列拼接后去掉兩端引物序列，長(zhǎng)度為658 bp，GeneBank 登錄號(hào)分別為ON534214、ON534215、ON534319、ON534320、ON548918、ON548917。序列堿基組成特征為：T（42.8%）、C（13.7%）、A（22.7%）、G（20.8%），A+T 含量明顯高于G+C 的含量。將獲得的序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST 同源性比對(duì)，結(jié)果顯示，貴州湄潭（GH81）、獨(dú)山（08、09）以及山東泰安（EM13）的樣本序列完全一致，與KJ437166 序列對(duì)應(yīng)片段高度吻合，僅在1 個(gè)堿基位點(diǎn)上有所差異，序列相似度為99.85%；貴州貴陽(yáng)（HCNK-1D1、HCNK-1D2）的茶黑刺粉虱樣本序列僅為一種單倍型，該序列同KU761949 對(duì)應(yīng)片段的序列高度吻合，僅在2 個(gè)堿基位點(diǎn)上有所差異，序列相似度為99.70%。

2.2 DNA 條形碼特定區(qū)域片段的比較分析

將試驗(yàn)獲得的茶黑刺粉虱DNA 條形碼特定區(qū)域片段序列與在GenBank 上下載的已知黑刺粉虱對(duì)應(yīng)的同源片段序列KJ437166 和KU761949 基于Kimura 2-parameter 參數(shù)進(jìn)行遺傳距離分析，選擇與茶黑刺粉虱近緣的刺桐粉虱Tetraleurodes acaciae（Quaintance）（GenBank 登錄號(hào)：AY521262）[6]作為外群，結(jié)果見(jiàn)表2，茶黑刺粉虱DNA 條形碼特定標(biāo)準(zhǔn)區(qū)域的序列遺傳距離為0～8.7%，與外群刺桐粉虱遺傳距離為28.9%～29.8%，與外群種的遺傳距離遠(yuǎn)大于茶黑刺粉虱種內(nèi)遺傳距離。利用鄰接法（Neighbor joining method，NJ 法）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，系統(tǒng)樹(shù)各分支的置信度（boostrap）均進(jìn)行1 000 次的重復(fù)檢驗(yàn)，結(jié)果如圖1 所示，茶黑刺粉虱與外群種刺桐粉虱明顯屬于不同的分支，同時(shí)6 個(gè)茶黑刺粉虱樣本明顯分出2 大分支，其中貴州湄潭（GH81）、獨(dú)山（08、09）和山東泰安（EM13）以及KJ437166 聚為一分支，貴州貴陽(yáng)樣本（HCNK-1D1、HCNK-1D2）和KU761949 聚為另一分支。

表2 遺傳距離分析

圖1 基于mtDNA COI 基因DNA 條形碼序列構(gòu)建的茶黑刺粉虱NJ 樹(shù)

3 討 論

3.1 茶黑刺粉虱的COI 基因分化

COI基因在昆蟲(chóng)物種鑒定分類上應(yīng)用極為廣泛，其中關(guān)于茶黑刺粉虱A. camelliae COI基因的研究也有相關(guān)報(bào)道[5,13-15]，例如Chen 等[6]測(cè)定的線粒體基因組全長(zhǎng)序列KU761949。但不同研究者間分析所用的COI序列片段不盡相同，并且有些研究未將序列信息上傳至GenBank[13,15]。目前，GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中除去線粒體基因組全長(zhǎng)序列外，其他已知的COI基因序列僅11 條，并且與DNA 條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列片段重合區(qū)域極窄，不利于各粉虱種類間的橫向比較。該研究提供了6 個(gè)茶黑刺粉虱mtDNACOI基因特定的DNA 條形碼標(biāo)準(zhǔn)區(qū)域片段序列，并將序列信息上傳至GenBank，登錄號(hào)分別為ON534214、ON534215、ON534319、ON534320、ON548917、ON548918。

學(xué)者們關(guān)于茶黑刺粉虱COI基因分化程度的研究結(jié)果也有所不同，這與研究限定的地理范圍有一定的關(guān)系。Kanmiya 等[5]選取了COI基因中一段759 bp的序列進(jìn)行茶黑刺粉虱遺傳分化研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)茶黑刺粉虱在日本7 個(gè)地理種群間序列相似度達(dá)99.74%，雖具有2 種單倍型，但單倍型間僅相距2 個(gè)堿基差異。胡雅輝等[13]選取了COI基因660 bp 的序列片段進(jìn)行茶園黑刺粉虱遺傳分化研究，發(fā)現(xiàn)湖南茶園內(nèi)不同地理種群黑刺粉虱遺傳距離為0～5.3%。Uesugi 等[14]對(duì)來(lái)自中國(guó)和日本的茶黑刺粉虱進(jìn)行分子序列分析，發(fā)現(xiàn)2 國(guó)的茶黑刺粉虱已經(jīng)明顯分化為3 個(gè)分支。該研究基于COI基因特定的DNA 條形碼標(biāo)準(zhǔn)區(qū)域658 bp的片段序列對(duì)6 種不同來(lái)源的茶黑刺粉虱進(jìn)行的遺傳距離分析，發(fā)現(xiàn)它們之間的遺傳距離為0～8.7%，并且分化為2 大分支，其中貴州湄潭（GH81）、獨(dú)山（08、09）和山東泰安（EM13）以及KJ437166 聚為一分支，貴州貴陽(yáng)樣本（HCNK-1D1、HCNK-1D2）和KU761949 聚為另一分支。

3.2 茶黑刺粉虱和橘黑刺粉虱的分類地位

Kanmiya 等[5]基于生態(tài)學(xué)、形態(tài)學(xué)和分子系統(tǒng)發(fā)育研究分析提出茶黑刺粉虱A. camelliae應(yīng)為單獨(dú)成立的物種。胡雅輝等[13]研究發(fā)現(xiàn)，柑橘黑刺粉虱種群和茶園黑刺粉虱種群的遺傳距離明顯高于柑橘黑刺粉虱不同地理種群間遺傳距離和茶園黑刺粉虱不同地理種群間的遺傳距離，并推測(cè)柑橘黑刺粉虱和茶園黑刺粉虱可能屬于黑刺粉虱的不同生物型或不同種。陳瑤等[15]結(jié)合分子鑒定和形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，貴州省12 個(gè)茶園的黑刺粉虱為茶黑刺粉虱A. camelliae，并與橘黑刺粉虱A. spiniferus屬于不同分支（種）。Uesugi 等[14]的研究也表明，在中國(guó)和日本，以柑橘為寄主的黑刺粉虱和以茶為寄主的黑刺粉虱應(yīng)為不同種。該研究基于COI基因中DNA 條形碼區(qū)域片段構(gòu)建了系統(tǒng)樹(shù)，發(fā)現(xiàn)茶黑刺粉虱不同地理種群可單獨(dú)作為一分支，與外群刺桐粉虱分屬不同類群。

Uesugi 等[14]利用COI基因674 bp 序列片段分析得出，茶黑刺粉虱分化為單倍型B1、B2 和單倍型群B3，采自我國(guó)安徽（宣城）、浙江（金華、寧德、溫州）、福建（福安）、廣東（英德）、江西（青原）、湖南（長(zhǎng)沙）、四川（成都）的茶黑刺粉虱均為B1 單倍型，來(lái)自重慶永川的種群均為B2 單倍型，而檢疫截獲的來(lái)自中國(guó)山茶科植物的茶黑刺粉虱既有B1 單倍型，也有B3單倍型；采自日本的茶黑刺粉虱均為B1 單倍型，這一結(jié)果同Kanmiya 等[5]建立茶黑刺粉虱A. camelliae這一新種時(shí)的數(shù)據(jù)一致。Chen 等[6]發(fā)布了采自重慶永川的茶黑刺粉虱的線粒體基因組序列（登錄號(hào)為KU761949），比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，其與Uesugi 等[14]提出的B2 單倍型結(jié)果一致。Chen 等[7]發(fā)布了采自浙江杭州的黑刺粉虱線粒體基因組序列（登錄號(hào)為KJ437166），但研究中并未提及其寄主，只是給出了鑒定種名為橘黑刺粉虱A. spiniferus；將其與Uesugi 等[14]提出的3 種單倍型數(shù)據(jù)比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，該序列與B1 單倍型結(jié)果一致。而筆者的研究也發(fā)現(xiàn)，KJ437166 種群可能是來(lái)源于茶葉寄主，應(yīng)該鑒定為茶黑刺粉虱B1 單倍型，而不是橘黑刺粉虱A. spiniferus，陳瑤等[15]也得出了類似的結(jié)論。然而，Uesugi 等[14]又表示，從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的結(jié)果來(lái)看，不同的單倍型（群）分支間可能已經(jīng)達(dá)到不同種的級(jí)別。在該研究中，貴州湄潭（GH81）、獨(dú)山（08、09）和山東泰安（EM13）的樣本屬于B1 單倍型（群），貴州貴陽(yáng)樣本（HCNK-1D1、HCNK-1D2）則屬于B2 單倍型（群），這是除茶黑刺粉虱重慶永川種群之外在其他地區(qū)初次發(fā)現(xiàn)B2 單倍型，2 種單倍型（群）分化明顯（遺傳距離8.2%～8.7%），但是否已經(jīng)達(dá)到不同種的水平，尚需要結(jié)合生態(tài)學(xué)或更多的序列數(shù)據(jù)進(jìn)一步闡明。

4 結(jié) 論

研究利用DNA 條形碼技術(shù)成功獲取了來(lái)源于貴州獨(dú)山、貴陽(yáng)、湄潭以及山東泰安茶園的6 個(gè)茶黑 刺 粉 虱 樣 本 的mt DNACOI基 因DNA 條 形 碼 特定的標(biāo)準(zhǔn)區(qū)域序列片段，登錄號(hào)分別為ON534214、ON534215、ON534319、ON534320、ON548917、ON548918，通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，茶黑刺粉虱個(gè)體間的遺傳距離（0～8.7%）遠(yuǎn)小于與外群刺桐粉虱遺傳距離（28.9%～29.8%），證明DNA 條形碼技術(shù)應(yīng)用有效；系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果顯示，來(lái)源于不同地區(qū)的茶黑刺粉虱明顯分化為2 大分支，分別為貴州湄潭、獨(dú)山和山東泰安分支以及貴州貴陽(yáng)分支，其結(jié)果可支持茶黑刺粉虱的單系性結(jié)論，同時(shí)2 大分支分化明顯，尚可能存在隱存種。