高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法測定土壤和沉積物中六溴環(huán)十二烷和四溴雙酚A

朱超飛，楊文龍，殷也筑，楊 茜，杜 兵*，范紅利，呂美玲

1. 生態(tài)環(huán)境部環(huán)境發(fā)展中心，國家環(huán)境分析測試中心，國家環(huán)境保護(hù)二英污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029

2. 安捷倫科技（中國）有限公司，北京 100102

六溴環(huán)十二烷(HBCDs)和四溴雙酚A (TBBPA)是兩類用量最大的溴代阻燃劑(BFRs)，前者廣泛用于建筑材料、車輛和紡織品中膨脹聚苯乙烯(EPS)和擠壓聚苯乙烯(XPS)的阻燃，也包括室內(nèi)裝飾紡織品、家用電器、塑料和其他材料的阻燃，后者不僅可以作為反應(yīng)型阻燃劑制造溴化環(huán)氧樹脂、酚醛樹脂和含溴聚碳酸酯，也作為添加型阻燃劑用于丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABS)和高抗沖聚苯乙烯(HIPS)樹脂中. HBCDs 理論上存在16 種立體異構(gòu)體，產(chǎn)品中主要由α-HBCD、β-HBCD 和γ-HBCD 構(gòu)成，三者含量分別為10%～13%、1%～12%和75%～89%.TBBPA 結(jié)構(gòu)中含有2 個(gè)酚羥基，具有疏水性，其p和p分別為7.5 和8.5. HBCDs 和TBBPA 在生產(chǎn)、使用、處理和回收過程中均會(huì)泄露進(jìn)入環(huán)境. 生產(chǎn)企業(yè)周邊以及南北極地區(qū)的土壤和沉積物中均檢出HBCDs 和TBBPA，濃度范圍在未檢出至幾千μg/kg 之間. HBCDs 和TBBPA 具有持久性、生物富集性、長距離遷移性和毒性等特征. 2013 年，HBCDs 被列入《關(guān)于持久性有機(jī)污染物的斯德哥爾摩公約》附件A，2016 年《〈關(guān)于持久性有機(jī)污染物的斯德哥爾摩公約〉新增列六溴環(huán)十二烷修正案》正式在我國生效，截至2021 年底，我國已經(jīng)全面禁止HBCDs 的生產(chǎn)、使用和進(jìn)出口. 盡管TBBPA 在我國尚未得到管控，但作為僅次于HBCDs 的阻燃劑，存在類似的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，需要開展廣泛調(diào)查.

我國HBCDs 和TBBPA 監(jiān)測技術(shù)體系研究起步較晚，缺乏針對土壤和沉積物中HBCDs 和TBBPA的監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)，制約了區(qū)域性和系統(tǒng)性環(huán)境監(jiān)測工作的推進(jìn). 隨著“十四五”期間有關(guān)“加強(qiáng)新污染物治理”工作的逐步深入，加快推進(jìn)HBCDs 和TBBPA 的標(biāo)準(zhǔn)化工作迫在眉睫.

研究顯示，我國發(fā)布的涉及HBCDs 和TBBPA 的標(biāo)準(zhǔn)分析方法主要集中在食品、塑料和電子電氣領(lǐng)域，除了海洋行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)HY/T 260-2018《海洋沉積物體中六溴環(huán)十二烷的測定 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》涉及海洋沉積物中HBCDs 的測定之外，主要國家、地區(qū)及國際組織尚未發(fā)布有關(guān)土壤和沉積物中兩類目標(biāo)物同時(shí)測定的標(biāo)準(zhǔn)分析方法.目前，已有較多文獻(xiàn)涉及樣品采集至分析測試的全流程. 樣品的提取方式包括索氏提取、加壓流體提取、超聲振蕩提取、微波輔助萃取等，常用的溶劑為丙酮與正己烷(體積比為1∶1)、正己烷與二氯甲烷(體積比為1∶1)等. 凈化方式主要有酸性、中性和堿性的復(fù)合硅膠填充柱，單一中性硅膠填充柱，中性與酸性硅膠結(jié)合的填充柱，以及硅膠、C和HLB 等固相萃取小柱. 儀器分析方法以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜為主，該方法分離檢測過程中的溫度可以控制在160 ℃以下，避免HBCDs 異構(gòu)體之間的轉(zhuǎn)換，從而實(shí)現(xiàn)異構(gòu)體的特異性分析，且對于同時(shí)測定的TBBPA，也不需要如氣相色譜測試前的衍生化操作. 研究表明，這兩類物質(zhì)的定量方法以內(nèi)標(biāo)法和同位素稀釋法為主.

目前，研究多集中在對單一介質(zhì)或一類目標(biāo)物的分析，且前處理方法和儀器條件存在差別. 該研究在借鑒已有研究的基礎(chǔ)上，綜合評價(jià)目標(biāo)物在土壤，尤其是基質(zhì)復(fù)雜的沉積物的提取方式，建立了同步測定土壤和沉積物中HBCDs 和TBBPA 的高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜分析方法，以期服務(wù)于履約和新污染物監(jiān)測的需求.

1 材料與方法

1.1 試劑與耗材

色譜純有機(jī)溶劑包括丙酮、正己烷、二氯甲烷、乙腈和甲醇購自霍尼韋爾(Honeywell, 新澤西州, 美國). 4 種 目 標(biāo) 物(α-HBCD、β-HBCD、γ-HBCD 和TBBPA)、同位素替代物(C-α-HBCD、C-β-HBCD、C-γ-HBCD 和C-TBBPA)、進(jìn)樣內(nèi)標(biāo)(D-α-HBCD)購自劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室(Cambridge Isotope Laboratories,美國). 硅膠、優(yōu)級純乙酸銨(純度＞98%)、氨水和甲酸購自Acros Organics (Belgium, 美國). 優(yōu)級純硫酸鈉購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司. 純水由實(shí)驗(yàn)室自制(18 MΩ·cm). 44%酸性硅膠由78.6 g 濃硫酸(98%)和100 g 中性硅膠混合得到，2% KOH 堿性硅膠由40 mL 50 g/L 的KOH 水溶液與100 g 硅膠混合得到. 復(fù)合硅膠柱從下至上填充方式依次為1 g 無水硫酸鈉、1 g 中性硅膠、10 g 的44%酸性硅膠和1 g 無水硫酸鈉. 玻璃填充柱的柱長260 mm，內(nèi)徑15 mm.

1.2 樣品前處理

土壤和沉積物樣品經(jīng)冷凍干燥，研磨粉碎后過60 目(0.25 mm)篩網(wǎng)，稱量10.00 g，加入同位素替代物內(nèi)標(biāo)后進(jìn)行加壓流體提取，溶劑為丙酮與正己烷(體積比為1∶1)，加熱溫度為100 ℃，靜態(tài)萃取5 min，萃取壓力設(shè)定為1.03×10Pa，循環(huán)萃取3 次. 提取液由復(fù)合硅膠柱凈化，用100 mL 正己烷與二氯甲烷(體積比為1∶1)洗脫，洗脫液氮吹轉(zhuǎn)溶至1 mL 甲醇，添加進(jìn)樣內(nèi)標(biāo)，過0.22 μm 濾膜后，上機(jī)分析.

1.3 儀器分析方法

該研究使用高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜(1290 Infinity Ⅱ LC-6470 MS/M S 系 統(tǒng)，Agilent, 美國)測定樣品中3 種HBCDs (α-HBCD、β-HBCD 和γ-HBCD)和TBBPA 的濃度. 液相色譜柱為Zorbax RRHD Eclipse Plus C(2.1 mm×100 mm, 1.8 μm，Agilent, 美國)，流動(dòng)相為純水和乙腈，流速為0.30 mL/min，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為5.0 μL. 基于電噴霧負(fù)離子化(ESI)和多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式對目標(biāo)物進(jìn)行檢測. HBCDs 監(jiān)測離子對均為[M-H]-＞Br模式，自然態(tài)的監(jiān)測離子對為640.8-＞81.0 和640.8-＞79.0，同位素替代物的為652.8-＞81.0 和652.8-＞79.0，進(jìn)樣內(nèi)標(biāo)D-α-HBCD 的 監(jiān) 測 離 子 對 為657.8-＞81.0 和657.8-＞79.0；TBBPA 及C-TBBPA 的監(jiān)測離子對分別為542.7-＞417.9 和542.7-＞291.0 及554.7-＞430.7 和554.7-＞296.7. 采用同位素稀釋法的平均相對響應(yīng)因子進(jìn)行定量分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

圖1 不同溶劑提取目標(biāo)物的回收率Fig.1 The recoveries of the analytes on different extracting solvents

有效的凈化處理方式能降低基質(zhì)效應(yīng)，提高定性定量的準(zhǔn)確性. 土壤和沉積物中兩類目標(biāo)物的凈化方式主要有填充柱和固相萃取柱. 前期發(fā)現(xiàn)，采用單獨(dú)的固相萃取小柱(C和硅膠)，因柱容量和凈化能力有限，凈化效果不足，基質(zhì)效應(yīng)偏高，影響定量計(jì)算，尤其是硅酸鎂小柱無法將TBBPA 洗脫下來. 為了應(yīng)對復(fù)雜基質(zhì)對目標(biāo)物定量分析的影響，該研究采用復(fù)合硅膠柱的凈化措施，首先考察了各類改性硅膠對目標(biāo)物的影響. 由圖2 可見，無水硫酸鈉沒有吸附目標(biāo)物，中性硅膠和44%酸性硅膠條件下目標(biāo)物的回收率為93.1%～106%，2% KOH 堿性硅膠條件下TBBPA的回收率偏低(29.4%)，可能是由于堿性條件下TBBPA電離產(chǎn)生不可逆吸附所致. 因此，后續(xù)選擇中性硅膠和酸性硅膠復(fù)合的方式對目標(biāo)物進(jìn)行凈化處理.

圖2 目標(biāo)物在4 種不同材料上的洗脫效果Fig.2 Elution results of targets on four different materials

選擇復(fù)合硅膠填充柱(從下至上依次填充1 g 無水硫酸鈉、1 g 中性硅膠、10 g 酸性硅膠、1 g 無水硫酸鈉)進(jìn)行洗脫曲線試驗(yàn). 由圖3 可見， 170 mL 正己烷洗脫目標(biāo)物的回收率低于1%，40 mL 二氯甲烷以及80 mL 正己烷與二氯甲烷(體積比為1∶1)均能將目標(biāo)物全部洗脫下來，且樣品基質(zhì)效應(yīng)得到有效降低(低于20%). 在實(shí)際樣品分析過程中，為了保證目標(biāo)物的洗脫效率，需要適當(dāng)增加洗脫量. 針對各類復(fù)雜基質(zhì)的土壤和沉積物樣品，采用中性和酸性復(fù)合硅膠填充柱作為凈化手段，使用50 mL 二氯甲烷和20 mL正己烷活化，樣品濃縮液上柱后，使用50 mL 正己烷淋洗凈化，100 mL 正己烷與二氯甲烷(體積比為1∶1)洗脫并收集.

圖3 目標(biāo)物在3 種不同洗脫溶劑下的淋洗曲線Fig.3 The elution curves of targets in three different solvents

2.2 儀器測試條件的優(yōu)化

前期試驗(yàn)結(jié)果顯示，液相色譜系統(tǒng)不存在目標(biāo)物的儀器背景干擾. 有關(guān)HBCDs 和TBBPA 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法涉及的流動(dòng)相有水、甲醇、乙腈，以及三者之間不同比例的混合. 為了增加離子強(qiáng)度，也有在水相或有機(jī)相中添加乙酸銨，通過氨水或甲酸調(diào)節(jié)pH 的做法，但未對各條件下目標(biāo)物的響應(yīng)進(jìn)行討論.結(jié)合文獻(xiàn)資料，以乙腈為有機(jī)相，考察4 種不同水相(無添加、0.05%氨水、2 mmol/L 乙酸銨和0.01%乙酸)下目標(biāo)物的峰面積響應(yīng). 由圖4 可見，在無添加條件下4 種目標(biāo)物整體響應(yīng)最高；2 mmol/L 乙酸銨條件下，HBCDs 響應(yīng)與純水的相近，但TBBPA 偏低；而0.05%氨水和0.01%乙酸條件下，4 種目標(biāo)物的響應(yīng)最低. 因此，選擇純水和乙腈為流動(dòng)相.

圖4 不同流動(dòng)相下目標(biāo)物的歸一化響應(yīng)Fig.4 Normalized response of targets in different mobile phases

此外，有機(jī)流動(dòng)相乙腈有利于β-HBCD 和γ-HBCD的分離，甲醇有利于α-HBCD 和β-HBCD 的分離. 當(dāng)采用乙腈與甲醇(體積比為1∶1)的混合有機(jī)相時(shí)，3種HBCDs 異構(gòu)體能夠?qū)崿F(xiàn)更大跨度的分離，該結(jié)果與已有研究結(jié)果一致. 乙腈能夠?qū)崿F(xiàn)HBCDs 異構(gòu)體的基線分離，且色譜柱柱壓較低，推薦采用水(流動(dòng)相A)和乙腈(流動(dòng)相B)作為流動(dòng)相組合，參考的梯度洗脫程序如表1 所示，對應(yīng)的目標(biāo)物提取MRM色譜圖如圖5 所示.

表1 目標(biāo)物分析的梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution profile for the target compounds analysis

圖5 HBCDs 和TBBPA 的MRM 色譜圖Fig.5 MRM chromatograms of HBCDs and TBBPA

質(zhì)譜參數(shù)能顯著影響目標(biāo)物的響應(yīng)，該研究采用安捷倫液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀器，涉及7 個(gè)參數(shù)，且參數(shù)之間有一定的組合關(guān)系，而已有研究中少有提到對參數(shù)的全面優(yōu)化. 該研究以100 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液為基礎(chǔ)，在儀器參數(shù)允許范圍內(nèi)，設(shè)置優(yōu)化范圍和步長，按照順序，逐一對7 個(gè)源參數(shù)(鞘氣溫度、鞘氣流速、噴嘴電壓、毛細(xì)管電壓、霧化氣、干燥氣溫度和干燥氣流速)進(jìn)行優(yōu)化. 其中，鞘氣溫度的設(shè)定優(yōu)化范圍為200～380 ℃，目標(biāo)物的響應(yīng)隨鞘氣溫度的升高逐漸增加，在大于340 ℃后快速降低；鞘氣流速和噴嘴電壓與目標(biāo)物響應(yīng)均呈正相關(guān)，毛細(xì)管電壓在1 500 V 時(shí)，目標(biāo)物響應(yīng)獲得最大值后迅速下降；干燥氣溫度的變化對TBBPA 的響應(yīng)有限，干燥氣流速與TBBPA 響應(yīng)呈負(fù)相關(guān)，與HBCDs 呈正相關(guān). 綜合兩類目標(biāo)物的響應(yīng)，確定的最佳離子源參數(shù)為鞘氣溫度340 ℃、鞘氣流速11 L/min、噴嘴電壓2 000 V、毛細(xì)管電壓1 500 V、霧化氣35 psi、干燥氣溫度280 ℃和干燥氣流速6 L/min.

柱溫影響目標(biāo)物在色譜柱中的分配和分離效果，研究顯示，HBCDs 和TBBPA 的柱溫通常在30～40 ℃之間. 該研究從25 ℃開始對柱溫進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖6 所示. 隨著柱溫的增加，目標(biāo)物在色譜上的保留降低，出峰時(shí)間縮短，其中γ-HBCD 受到的影響最明顯，出峰時(shí)間從柱溫25 ℃時(shí)的8.5 min，縮短至42.5 ℃時(shí)的7.5 min. 出峰時(shí)間的縮短，一方面引起α-HBCD 和β-HBCD 的分離度降低，另一方面目標(biāo)物在出峰時(shí)流動(dòng)相中乙腈比例下降，導(dǎo)致目標(biāo)物響應(yīng)受到影響. 結(jié)果顯示，35 ℃時(shí)目標(biāo)物的響應(yīng)值較其他柱溫時(shí)偏高，且各異構(gòu)體均能實(shí)現(xiàn)基線分離，因此選擇35 ℃作為最佳柱溫.

圖6 不同柱溫下HBCDs 和TBBPA 的MRM 色譜圖Fig.6 MRM chromatograms of HBCDs and TBBPA in different column temperatures

進(jìn)樣量的增加能夠提高方法的靈敏度，但可能影響分離和峰形. 該研究考察了進(jìn)樣體積1～20 μL 內(nèi)目標(biāo)物峰面積的變化情況. 結(jié)果顯示，峰面積隨進(jìn)樣量增加逐漸遞增，但在進(jìn)樣量為20 μL 時(shí)偏離線性趨勢，TBBPA 和α-HBCD 的變化更明顯，在進(jìn)樣量為20 μL 時(shí)峰面積顯著增加. β-HBCD 的響應(yīng)與進(jìn)樣量之間存在二次曲線擬合(=0.999)，γ-HBCD 是唯一的響應(yīng)與進(jìn)樣量呈線性的目標(biāo)物(=0.999 6). 從降低檢出限角度應(yīng)選擇最大進(jìn)樣量，但進(jìn)樣量大于10.0 μL 后溶劑效應(yīng)增強(qiáng)，目標(biāo)物的色譜峰形出現(xiàn)前展駝型峰. 因此，為了保證線性范圍，提高定量分析的準(zhǔn)確性，進(jìn)樣量確定為5.0 μL.

采用已建立的方法，制備2.00、5.00、10.0、20.0、50.0、100 和200 ng/mL 的校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析測試，使用同位素稀釋法的平均相對響應(yīng)因子法進(jìn)行定量計(jì)算，平均相對響應(yīng)因子的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15%. 每種目標(biāo)物均對應(yīng)一個(gè)內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，采用同位素校正的方法能最大限度增加目標(biāo)物定量分析的準(zhǔn)確性. 考察連續(xù)3 d 測試樣品中內(nèi)標(biāo)物質(zhì)疊加的色譜圖，評估保留時(shí)間的穩(wěn)定性. 結(jié)果顯示，相對于標(biāo)準(zhǔn)溶液中內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間，樣品中內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間的相對偏差均小于2.5%. 保留時(shí)間波動(dòng)最大的化合物是C-TBBPA，波動(dòng)范圍的差值為0.13 min. 與標(biāo)準(zhǔn)溶液中的保留時(shí)間相比，實(shí)際樣品中的保留時(shí)間略微提前，可能是基質(zhì)效應(yīng)引起的. 從定性角度考慮，保留時(shí)間的偏差控制在±0.3 min 以內(nèi)，相對偏差控制在±3.0%以內(nèi).

2.3 方法檢出限和方法參數(shù)

依據(jù)《環(huán)境監(jiān)測分析方法標(biāo)準(zhǔn)制訂技術(shù)導(dǎo)則》(HJ 168-2020)附錄A 有關(guān)方法檢出限的計(jì)算方法，對石英砂空白基質(zhì)進(jìn)行7 次低濃度(0.2 μg/kg)加標(biāo)試驗(yàn). 測試結(jié)果求得標(biāo)準(zhǔn)偏差，基于值得到α-HBCD、β-HBCD、γ-HBCD 和TBBPA 的方法檢出限分別為0.06、0.04、0.04 和0.06 μg/kg，測定下限分別為0.24、0.16、0.16 和0.24 μg/kg. 該結(jié)果滿足50%的被分析物樣品濃度在3～5 倍計(jì)算出的方法檢出限的范圍內(nèi)，至少90%的被分析物樣品濃度在1～10 倍計(jì)算出的方法檢出限范圍內(nèi)的要求.

該方法檢出限在0.04～0.06 μg/kg 之間，低于文獻(xiàn)中報(bào)道的背景地區(qū)的環(huán)境濃度水平，能夠滿足我國履約監(jiān)測的需要. 文獻(xiàn)中的方法檢出限多是基于3 倍信噪比的計(jì)算，且樣品定容體積和進(jìn)樣量差別較大. 在統(tǒng)一樣品分析參數(shù)的基礎(chǔ)上，該方法的檢出限與已有研究結(jié)果處于同一水平. 研究發(fā)現(xiàn)，沉積物中α-HBCD 檢出限為0.004 μg/kg，對應(yīng)的定容體積為0.2 mL，當(dāng)定容體積為1 mL 時(shí)，檢出限為0.02 μg/kg. 另有研究發(fā)現(xiàn)，沉積物中HBCDs 三個(gè)異構(gòu)體的方法檢出限為0.003～0.005 μg/kg，其進(jìn)樣體積為10 μL，定容體積為0.2 mL，換算為定容體積1 mL、進(jìn)樣量5 μL 時(shí)，檢出限為0.03～0.05 μg/kg，與筆者研究中的方法檢出限相當(dāng).

對加標(biāo)濃度為0.5、2.0 和10.0 μg/kg 的石英砂樣品，加標(biāo)濃度均為0.5 和2.0 μg/kg 的背景土壤和海洋沉積物樣品，加標(biāo)濃度均為2.0 和10.0 μg/kg 的工業(yè)土壤和河流沉積物樣品，各進(jìn)行6 次平行測定，考察分析方法的精密度和正確度. 由表2 可見，樣品加標(biāo)回收的精密度為1.76%～10.6%，加標(biāo)回收率(正確度)為92.9%～121%.

表2 方法精密度和正確度數(shù)據(jù)Table 2 The precision and accuracy of the developed method

2.4 方法適用性研究

采集8 種不同地區(qū)和類型的土壤樣品，考察pH以及基質(zhì)對方法適用性的影響. 土壤樣品類型覆蓋了我國南部、北部及中原地區(qū)，分別為湖北棕土(pH=5.54)、天津潮土(pH=8.17)、湖北棕褐土(pH=5.85)、湖北棕土(pH=5.19)、河南水稻土(pH=6.29)、云南紫色土(pH=7.51)、新疆灌淤潮土(pH=8.67)和貴州黃棕壤(pH=4.26). 對土壤樣品進(jìn)行3 次平行加標(biāo)試驗(yàn)，結(jié)果顯示，目標(biāo)物的加標(biāo)回收率范圍為85.9%～104%，C-α-HBCD、C-β-HBCD、C-γ-HBCD、C-TBBPA 的回收率分別為56.5%～124%、54.0%～107%、59.1%～126%和52.2%～144%.

3 結(jié)論

a) 該研究建立了土壤和沉積物中HBCDs 和TBBPA 的高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜結(jié)合同位素稀釋定量的分析方法.

b) 當(dāng)取樣量為10.00 g、定容體積為1.0 mL 時(shí)，α-HBCD、β-HBCD、γ-HBCD 和TBBPA 的方法檢出限在0.04～0.06 μg/kg 之間，能夠滿足實(shí)際樣品的分析測試要求.

c) 目標(biāo)物在石英砂空白基質(zhì)和實(shí)際樣品的低中高濃度的加標(biāo)回收率為92.9%～121%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.76%～10.6%. 代表性土壤的加標(biāo)回收率范圍為85.9%～104%. 該研究建立的方法具有靈敏度高、實(shí)用性好的特點(diǎn)，能夠適用于復(fù)雜土壤和沉積物樣品中HBCDs 和TBBPA 的分析測試.