間歇式超聲輔助酶法提取葡萄皮渣白藜蘆醇工藝優(yōu)化

張 勤 田子明 王金柱

(焦作職工醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，河南 焦作 454000)

白藜蘆醇屬于非黃酮類多酚有機(jī)化合物，是植物受到刺激時產(chǎn)生的一種抗毒素，主要存在于葡萄、大豆、櫻桃、石榴和一些堅果的果皮中[1-2]，具有祛痰、止咳、平喘、驅(qū)風(fēng)、健胃、解熱、鎮(zhèn)痛、抗菌、消炎等作用。同時，在抗腫瘤、抗氧化、抗菌等方面具有獨特的優(yōu)勢，對人體健康益處明顯[3-5]，被認(rèn)為是較有前景的治療心血管疾病、抗癌、防衰老的活性物質(zhì)。

許多學(xué)者對白藜蘆醇的提取開展了相關(guān)研究，在酶法、超聲波輔助以及超聲波輔助酶法提取方面均有涉及：張華等[6]使用纖維素酶和果膠酶共同酶解提取藍(lán)莓皮渣中的白藜蘆醇，發(fā)現(xiàn)最優(yōu)提取條件為料液比(m藍(lán)莓皮渣∶V乙醇)1∶20 (g/mL)、復(fù)合酶配比(m纖維素酶∶m果膠酶)1∶5、酶解溫度54.62 ℃、酶解時間1 h、pH 5.38，白藜蘆醇最高得率為236.424 mg/kg；崔霖等[7]對超聲波輔助乙醇回流法提取虎杖白藜蘆醇的工藝進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%、原料與溶劑配比(m原料∶m溶劑)1∶28、超聲功率120 W的條件下浸提60 min，白藜蘆醇得率達(dá)到1.36%。由于超聲波的空化、擾動和攪拌等多級效應(yīng)可提高提取效率[8-9]；而酶法提取則較為溫和，可有效保持天然產(chǎn)物的基本結(jié)構(gòu)[10-11]，但提取時間長、易氧化。因此，有學(xué)者開展了超聲波輔助酶法提取白藜蘆醇的研究：汪開拓等[12]對超聲波輔助乙醇提取葡萄皮渣中白藜蘆醇的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、液料比(V乙醇∶m葡萄皮渣)為12∶1 (mL/g)、提取溫度為35.6 ℃、提取時間為34.8 min和超聲波功率為231 W時，白藜蘆醇的得率最高為48.72 μg/g·FW。同時，Zhou等[13]使用超聲波輔助虎杖苷-β-葡萄糖苷酶(PBG)在乙醇/硫酸銨體系中進(jìn)行酶解來提取白藜蘆醇，最大得率較單獨使用酶法有大幅度提高，達(dá)到了10.7 mg/g。此外，黃兆翔等[14]對超聲波輔助酶法提取花生紅衣白藜蘆醇工藝進(jìn)行了優(yōu)化，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%、料液比(m花生紅衣∶V乙醇)為1∶25 (g/mL)、超聲時間為30 min、提取溫度為50 ℃時，白藜蘆醇的提取量為(0.854±0.025) mg/100 g。

由于長時間持續(xù)使用超聲波會導(dǎo)致分子運動速度加劇、溫度升高，可能破壞提取物的結(jié)構(gòu)與活性[15]。間歇式超聲波可在一定程度上改善這種狀況[16]，但暫未見用輔助酶法提取葡萄皮渣白藜蘆醇的報道。研究以葡萄皮渣為原料，將超聲波間歇處理與酶解提取相結(jié)合來提取白藜蘆醇。通過響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，并對葡萄皮渣白藜蘆醇進(jìn)行抗氧化性能分析，以期為實現(xiàn)具有良好生物活性的葡萄皮渣白藜蘆醇的高效提取提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

葡萄皮渣：赤霞珠，煙臺某葡萄酒有限公司；

纖維素酶：酶活5萬U/g，上海阿拉丁科技有限公司；

白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥99%，天津尖峰天然產(chǎn)物有限公司；

甲醇、乙醇等：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

數(shù)控超聲水浴鍋：CSSX-30型，常州易晨儀器制造有限公司；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：101A-2型，上海榮計達(dá)儀器科技有限公司；

高效液相色譜儀：Agilent 1200S型，美國安捷倫；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-210型，鄭州博匯精密科技有限公司；

離心機(jī)：KH19A型，浙江恒岳儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 白藜蘆醇提取 將葡萄皮渣洗凈后置于恒溫箱中于45 ℃烘干，粉碎后過40目篩。向粒度小于40目的5 g葡萄皮渣干粉中加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇—水溶液100 mL，按照試驗設(shè)計加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的纖維素酶，調(diào)節(jié)pH值為5.0后置于數(shù)控超聲水浴鍋中，在設(shè)定的溫度和功率下采用間歇的方式提取一定時間(每超聲2 min，停止2 min，計算超聲累計時間)，離心分離(4 000 r/min)、60 ℃蒸發(fā)濃縮至無液體，再用5 mL甲醇溶解，過有機(jī)濾膜后蒸發(fā)濃縮。

為了進(jìn)行比較分析，分別采用單獨酶法(無超聲波輔助)和持續(xù)超聲波法(無纖維素酶)進(jìn)行提取，其他工藝條件(pH值、時間、溫度等)與間歇式超聲波輔助酶法的相同。

1.2.2 試驗設(shè)計 在探索性試驗的基礎(chǔ)上，以白藜蘆醇得率為考察指標(biāo)，分別以超聲波功率、超聲累計時間、酶解溫度、酶液用量4個因子進(jìn)行單因素試驗，考察其對白藜蘆醇得率的影響。

(1) 超聲波功率和累計處理時間：在酶解溫度為55 ℃，酶液用量為1.4%的條件下，考察超聲波功率(200，250，300，350，400 W)和超聲累計時間(40，50，60，70，80，90 min)對白藜蘆醇得率的影響。

(2) 酶解溫度和酶液用量：在超聲波功率為300 W，超聲累計時間為60 min的條件下，考察酶解溫度(40，45，50，55，60，65 ℃)和酶液用量(0.8%，1.0%，1.2%，1.4%，1.6%)對白藜蘆醇得率的影響。

(3) 在單因素試驗的基礎(chǔ)上選取對得率影響較大的因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗。

1.2.3 得率測定與計算 稱取干燥至恒重的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，用甲醇—水溶液(V甲醇∶V水=60∶40)溶解并定容至10 mL，配制成2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，低溫保存。用標(biāo)準(zhǔn)液配制成質(zhì)量濃度分別為2.5，5.0，10，20，30，40，50 μg/mL的白藜蘆醇溶液，采用HPLC法測定各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，色譜柱為CNW Athena C18-WP，流動相為乙腈—水(V乙腈∶V水=70∶30)，流量1 mL/min，柱溫28 ℃，進(jìn)樣量20.0 μL，檢測波長306 nm。通過測定所提取物的吸光度，按式(1)計算白藜蘆醇的得率。

(1)

式中：

Y——白藜蘆醇的得率，%；

m——標(biāo)準(zhǔn)樣品液吸光度值對應(yīng)的白藜蘆醇的質(zhì)量，μg；

V1——取樣體積，mL；

V2——樣品液體積，mL；

G——樣品稱取的質(zhì)量，g；

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D——樣品溶液的稀釋倍數(shù)。

1.2.4 基本性能表征 使用掃描電鏡、傅里葉紅外光譜、X-射線衍射分析儀和差示掃描量熱分析儀對所提取白藜蘆醇的微觀形貌、晶相結(jié)構(gòu)、官能團(tuán)以及熱分解性能進(jìn)行分析。

1.2.5 抗氧化能力檢測 白藜蘆醇的抗氧化性能通過測定吸光度來進(jìn)行評價，參照文獻(xiàn)[17]中的方法對DPPH·、ABTS·和總抗氧化性能進(jìn)行測定。參照文獻(xiàn)[18]中的方法對白藜蘆醇的·OH抗氧化能力進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 超聲波功率與超聲累計時間的影響 如圖1所示：隨著超聲累計時間的增加，白藜蘆醇得率不斷升高，但大部分在累計時間超過60～70 min后增幅減緩，部分甚至出現(xiàn)下降的趨勢，其中300，350 W時的得率相對較高，且300 W試樣在累計時間為60～70 min時得率達(dá)到了最高(0.253%～0.256%)。這可能是因為超聲波的空化作用導(dǎo)致葡萄皮渣細(xì)胞破碎而使有效成分溶出所致[19]，而較大功率的超聲波能夠加快這種作用，故在提取初期和大功率超聲波的作用下胞內(nèi)的白藜蘆醇溶出較多。同時，超聲波的長時間空化作用也易加速活性成分的氧化[15,20]，故超聲波功率較大(如400 W)和超聲累計時間較長(如90 min)時均易導(dǎo)致得率下降。在試驗條件下，當(dāng)超聲波功率為300 W、超聲累計時間為60 min時，白藜蘆醇的得率較高(0.253%)。因此，后續(xù)將以此為基礎(chǔ)進(jìn)行試驗分析。

圖1 超聲波功率和累計處理時間對白藜蘆醇得率的影響Figure 1 Effects of ultrasonic power and cumulative treatment time on res yield

使用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果(表1)表明，超聲累計時間和超聲波功率對白藜蘆醇得率的影響非常顯著；R2=0.936，表明反應(yīng)體系的穩(wěn)定性好。

表1 超聲波功率與超聲累計時間對白藜蘆醇得率影響的方差分析?Table 1 Variance analysis of effect of ultrasonic power and time on res yield

2.1.2 酶解溫度和酶液用量的影響 如圖2所示：白藜蘆醇得率隨著酶液用量的增加而增加。同時，隨著酶解溫度的升高，得率也逐漸增加，大部分在50～60 ℃附近達(dá)到最高，其中酶液用量為1.4%時的得率最高，在55 ℃時達(dá)到了0.258%；但當(dāng)溫度繼續(xù)升高得率反而降低，可能是由高溫導(dǎo)致部分纖維素酶失去活性以及在較高溫度下白藜蘆醇氧化分解所致[21]。因此，合理地控制酶解溫度(55 ℃)、超聲累計時間(60 min)與酶液用量(1.4%)有利于白藜蘆醇的溶出。

圖2 酶解溫度和酶液用量對白藜蘆醇得率的影響Figure 2 Effects of enzymatic hydrolysis temperature and enzyme dosage on res yield

使用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果(表2)表明，酶解溫度和酶液用量對白藜蘆醇得率的影響非常顯著；R2=0.947，表明反應(yīng)體系的穩(wěn)定性好。

表2 酶解溫度和酶液用量對白藜蘆醇得率影響的方差分析?Table 2 Variance analysis of effect of enzymolysis temperature and enzyme dosage on res yield

2.2 響應(yīng)面試驗

2.2.1 試驗設(shè)計及結(jié)果 由單因素的分析可知，影響得率的因素主要有超聲波功率、超聲累計時間、酶解溫度和酶液用量等?？紤]到酶解較為溫和而更有利于保持白藜蘆醇的生物活性，因此在超聲波功率為300 W的條件下，分別選取超聲累計時間、酶解溫度和酶液用量3個因素，以白藜蘆醇得率為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面試驗，如表3所示。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計中的水平和編碼Table 3 Level and code of response surface experiment design

表4 響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 4 Results of response surface experiment

2.2.2 響應(yīng)面結(jié)果分析 運用Design-Expert 8.0.6軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合得到多元回歸方程：

Y=-0.029A2-0.014B2-0.026C2+0.016AB+0.018AC+0.002 5BC+0.036A+0.018B-0.038C+0.26。

(2)

如表5所示：模型的F值為9.60，P=0.003 5<0.01，非常顯著；失擬項P=0.051 1，不顯著；復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.925，接近1，說明該方程擬合度好，模型精度高。試驗中的酶解溫度、超聲累計時間和酶液用量的交互作用對反應(yīng)體系有顯著影響。

表5 模型與方差?Table 5 Model and variance

根據(jù)回歸方程(2)和表5可知，AB和AC的P值<0.05，即超聲累計時間分別與酶解溫度和酶液用量具有交互作用，且二次項A2和C2的系數(shù)為負(fù)值，表明回歸方程可求解最大值，即有最高得率。

由圖3(a)可知，在合適的酶解溫度和超聲累計時間下，得率可達(dá)到峰值，但隨著酶解溫度的提高和超聲累計時間的延長得率反而降低。這是因為較高的溫度和較長的時間會使部分酶液失活，且易導(dǎo)致提取物氧化與分解。由圖3(b)可知，在一定的酶解溫度條件下，得率隨著酶液用量的增加而提高，但達(dá)到峰值后降低。這可以解釋為：當(dāng)酶液用量不足時，酶解不徹底；而酶液用量較多時，一方面過剩的酶液不參與反應(yīng)；另一方面，反應(yīng)體系中過多的酶液所產(chǎn)生的抑制作用也將影響白藜蘆醇的析出[11]。因此，合理地控制酶解溫度、超聲累計時間與酶液用量有利于反應(yīng)體系中白藜蘆醇的溶出。與圖3(a)和圖3(b)相比，圖3(c)中由酶解溫度和酶液用量構(gòu)成的3D曲面的變化較小，表明其對得率的影響不明顯。同時，從表5可知，交互項BC的P>0.05，不顯著。由此可見，酶液用量和酶解溫度對白藜蘆醇得率的影響相對較小。

圖3 響應(yīng)面3D圖Figure 3 Response surface 3D diagram

通過對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳的工藝參數(shù)為：超聲累計時間43.46 min、酶解溫度57.27 ℃、酶液用量1.28%，白藜蘆醇的預(yù)測得率為0.284%。為了驗證該優(yōu)化工藝的穩(wěn)定性，在超聲波功率為300 W、緩沖液pH值為5.0的條件下，分別選取超聲累計時間43 min、酶解溫度57 ℃和酶液用量1.3%進(jìn)行3次驗證實驗，白藜蘆醇平均得率為0.293%，高于表4中的最高得率，與模型預(yù)測值接近，說明所建立的回歸模型對試驗具有較好的指導(dǎo)作用。

2.3 不同提取工藝得率對比分析

基于優(yōu)化后的工藝條件，按照1.2.1中的提取方法進(jìn)行試驗，對單獨酶法(酶液用量1.3%，酶解溫度57 ℃、酶解時間86 min)、持續(xù)超聲波法(功率300 W、超聲累計時間86 min，無酶液)及間歇式超聲輔助纖維素酶法的提取得率進(jìn)行比較，結(jié)果見表6。由表6可知，單獨酶法、持續(xù)超聲波法所提取白藜蘆醇的得率均小于間歇式超聲輔助纖維素酶法。這是因為在試驗條件下，超聲波進(jìn)行間歇式處理，可以降低因單次長時間處理所引起的溫度升高而導(dǎo)致白藜蘆醇的氧化；而多次短時間超聲波脈沖處理，加上纖維素酶的作用，更容易充分發(fā)揮兩者各自的優(yōu)勢，形成協(xié)同效應(yīng)。

表6 不同提取方式白藜蘆醇的得率Table 6 Resveratrol yield of different extraction methods

2.4 基本性能表征

圖4 白藜蘆醇粉末的SEM、FTIR、XRD和DSC圖Figure 4 SEM image and FTIR, XRD, DSC curves of res

2.5 抗氧化性分析

將試驗條件下所得到的白藜蘆醇與單獨酶法提取和持續(xù)超聲波法提取的試樣對部分自由基清除能力和總抗氧化能力進(jìn)行對比分析。

2.5.1 對DPPH·的清除能力 如圖5所示：3種方法提取的白藜蘆醇對DPPH·的清除率均隨著質(zhì)量濃度的增加而逐漸增加，其中采用間歇式超聲波輔助酶法提取的白藜蘆醇的效果最好，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到4.5 mg/mL時，對DPPH·的清除率達(dá)到98.7%，而單獨酶法與持續(xù)超聲波提取的白藜蘆醇對DPPH·雖然有一定的清除作用，但相比之下清除率要低很多，兩者中最高的也只有78.5%，相差近20%。

圖5 不同工藝提取的白藜蘆醇對DPPH·的清除效果Figure 5 The scavenging effect of resveratrol extracted by different processes on DPPH·

2.5.2 對ABTS·的清除能力 如圖6所示：超聲波輔助酶法獲取的白藜蘆醇在質(zhì)量濃度較低(1.5 mg/mL)時對ABTS·的清除率為94.7%，隨著質(zhì)量濃度的增加清除率減緩。而單獨酶法提取的在1.5 mg/mL時的清除率為78.1%，即使在4.5 mg/mL時也只有82.6%；持續(xù)超聲波法的在1.5 mg/mL時的清除率則更低，僅有58.2%，說明間歇式超聲波輔助酶法提取的白藜蘆醇具有較好的活性，在低濃度時對ABTS·有較好的清除效果。

圖6 不同工藝提取的白藜蘆醇對ABTS·的清除效果Figure 6 The scavenging effect of resveratrol extracted by different processes on ABTS·

2.5.3 對·OH的清除能力 如圖7所示：在試驗范圍內(nèi)，對·OH的清除能力隨著質(zhì)量濃度的增加逐漸增強(qiáng)。其中超聲波輔助酶法提取的白藜蘆醇對·OH的清除率在質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時達(dá)到了73.7%，且在18.0 mg/mL 時高達(dá)97.3%，但單獨酶法與持續(xù)超聲波法的分別只有71.3%和51.7%，效果差異較大。

圖7 不同工藝提取的白藜蘆醇對·OH的清除效果Figure 7 The scavenging effect of resveratrol extracted by different processes on ·OH

2.5.4 總抗氧化能力評價 如圖8所示：總體上隨著白藜蘆醇質(zhì)量濃度的增加吸光度不斷增加，表明總氧化能力逐漸增強(qiáng)。但使用間歇式超聲波輔助酶法提取白藜蘆醇的吸光度最高，當(dāng)質(zhì)量濃度為9.0 mg/mL時達(dá)到了2.23，均高于單獨酶法與持續(xù)超聲波法提取的樣品?？梢姴捎瞄g歇式超聲波輔助酶法提取的白藜蘆醇具有較好的生物活性。

圖8 不同工藝提取的白藜蘆醇的總抗氧化能力Figure 8 Comparison of total antioxidant properties of resveratrol extracted by different processes

上述結(jié)果表明，采用間歇式超聲波輔助酶法提取的白藜蘆醇的抗氧化性能比單獨使用一種方法提取的要高。這可以解釋為：單獨酶法提取時，由于酶解速度較慢，較長的提取時間易導(dǎo)致白藜蘆醇的氧化與分解；使用持續(xù)超聲波提取時，長時間連續(xù)超聲波處理會使提取液的溫度升高，同樣易導(dǎo)致提取物氧化；而間歇式超聲波處理則可以降低因單次長時間超聲所引起的高溫氧化。因此，在試驗條件下多次短時間超聲脈沖處理，加上纖維素酶的作用，更容易充分發(fā)揮超聲波與纖維素酶各自的優(yōu)勢，形成協(xié)同效應(yīng)。

3 結(jié)論

試驗表明，酶解溫度、酶液用量、超聲累計時間和超聲波功率等工藝參數(shù)對白藜蘆醇得率有較大影響。通過響應(yīng)面試驗對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化后得率有明顯提高，達(dá)到了0.293%。所提取的白藜蘆醇對DPPH·、ABTS·和·OH的清除能力均優(yōu)于采用單獨一種方法提取的試樣。當(dāng)白藜蘆醇質(zhì)量濃度為9.0 mg/mL時其吸光度達(dá)到了2.23，顯示出優(yōu)異的抗氧化性能。綜上，采用間歇式超聲波輔助纖維素酶提取白藜蘆醇，可在提高得率的同時改善抗氧化活性，后續(xù)將在間歇式超聲波輔助雙酶法的提取工藝等方面開展深入研究，以獲取更高得率與活性。