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    多肽熒光探針HWEHH對水中銅離子的高通量檢測

    2022-09-15 02:40:20許迪雅張海曼張雅丹
    食品與機(jī)械 2022年8期
    關(guān)鍵詞:工作液高通量多肽

    許迪雅 張海曼 張 新 張雅丹 王 芳 張 琳

    (1. 特醫(yī)食品加工湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長沙 410000;2. 中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,湖南 長沙 410000;3. 食品安全監(jiān)測與預(yù)警湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長沙 410117;4. 湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院,湖南 長沙 410117)

    銅是人體內(nèi)必不可少的微量金屬元素,其需求量僅次于鐵和鋅[1]。但體內(nèi)銅離子(Cu2+)含量過多又會對臟器造成負(fù)擔(dān),還會導(dǎo)致許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病,如阿爾茨海默癥[2]、威爾遜氏病[3]、唐氏綜合征[4]等。金屬銅被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中,而生產(chǎn)中的廢銅若未經(jīng)過處理直接排放會污染環(huán)境。動植物能夠從環(huán)境中吸收Cu2+,又通過食物鏈富集到人體[5]。此外,人體對于Cu2+的攝入還來源于飲用水。世界衛(wèi)生組織(WHO)規(guī)定,Cu2+在飲用水中的含量不能超過2 mg/L[6],成年人銅的攝取量不應(yīng)超過10~12 mg/d。目前,Cu2+的檢測方法主要分為直接檢測法和間接檢測法。直接檢測法是利用Cu2+本身的物理、化學(xué)特性進(jìn)行檢測,主要包括原子吸收法[7]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法和生物傳感器法[8]等。在利用原子吸收光譜法進(jìn)行測定時(shí),不同光源燈對應(yīng)著不同的元素,對樣品進(jìn)行測量時(shí)需要及時(shí)更換光源燈。并且原子吸收光譜法的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線線性范圍比較窄,靈敏度低和抗干擾性弱等[9]。電感耦合等離子體質(zhì)譜法檢測離子的方法簡單、速度快,但儀器價(jià)格昂貴[10]。間接檢測法主要是利用Cu2+與熒光探針的特定化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行檢測。例如:熒光光譜法、比色法、免疫分析法、酶分析法等。其中,熒光光譜法因?yàn)槠涓哽`敏度、強(qiáng)選擇性、操作簡單和響應(yīng)速度快的優(yōu)點(diǎn)[11],可以快速、大批量地檢測樣品中Cu2+的含量,近年來被廣泛關(guān)注。

    熒光探針分析法是一種建立在熒光分析光譜和探針熒光強(qiáng)度變化上的識別方法[12]。熒光分子探針技術(shù)對目標(biāo)物進(jìn)行檢測的工作機(jī)制主要包括分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移[13]、光致電子轉(zhuǎn)移[14]、熒光共振能量轉(zhuǎn)移[15]、聚集誘導(dǎo)發(fā)光[16]及激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移[17]。近年來,大量有機(jī)分子熒光探針被用于Cu2+的檢測,但有機(jī)分子熒光探針的合成過程中會使用到大量有毒有害的試劑,污染環(huán)境,且水溶性差。基于水溶性較好的多肽熒光探針因具有結(jié)構(gòu)簡單、生物相容性好等特點(diǎn)[18]受到關(guān)注。而熒光基團(tuán)標(biāo)記探針合成較為復(fù)雜,且副產(chǎn)物多。因此采用內(nèi)源性熒光的多肽熒光探針能簡化合成步驟,提高探針的水溶性,降低成本。

    高通量檢測技術(shù)是指可以一次檢測多個(gè)樣品或者對同一種樣品進(jìn)行多種檢測的技術(shù)[19],被廣泛應(yīng)用于食品安全、藥物/菌種篩選等領(lǐng)域[20]。高通量檢測多基于酶聯(lián)免疫測定技術(shù)、多重PCR技術(shù)、基因芯片檢測技術(shù)等實(shí)現(xiàn)單次多個(gè)樣品的同時(shí)檢測。其中多功能酶標(biāo)儀因?yàn)閾碛卸喾N檢測模式(吸光度、熒光強(qiáng)度、時(shí)間分辨熒光等)、操作簡單、樣品消耗量少、成本低等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于高通量檢測中。

    研究擬開發(fā)組氨酸—色氨酸—谷氨酸—組氨酸—組氨酸(HWEHH)熒光探針,其中色氨酸(W)具有強(qiáng)熒光,組氨酸(H)可以與Cu2+絡(luò)合,谷氨酸(E)可以增加多肽的水溶性和穩(wěn)定性。根據(jù)Cu2+與多肽熒光探針絡(luò)合后探針熒光強(qiáng)度的變化,實(shí)現(xiàn)對Cu2+的檢測,并結(jié)合酶標(biāo)儀實(shí)現(xiàn)多肽熒光探針對水中Cu2+的高通量檢測,為實(shí)現(xiàn)水溶液中的Cu2+快速檢測提供一種新方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    HWEHH(圖1)多肽熒光探針:分析純,探針序列由實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì),由上海強(qiáng)耀生物集團(tuán)有限公司合成并純化;

    圖1 HWEHH結(jié)構(gòu)Figure 1 The structure of HWEHH

    各金屬陽離子:分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;

    濃硫酸、濃鹽酸:分析純,成都市科隆化學(xué)品有限公司;

    4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES):分析純,美國Sigma公司;

    試驗(yàn)用水為去離子水;

    自來水:中南林業(yè)科技大學(xué)神農(nóng)樓;

    飲用水:中南林業(yè)科技大學(xué)神農(nóng)樓直飲水系統(tǒng)。

    1.2 儀器與設(shè)備

    熒光分光光度計(jì):F-4600型,日本高新技術(shù)公司;

    紫外分光光度計(jì):UV-2600型,日本島津公司;

    多功能酶標(biāo)儀:Spectra Max i3x型,上海美谷分子儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 溶液的配制 將凍干多肽探針(HWEHH)粉末直接溶于10 mmol/L NaOH溶液中,制成濃度約為1 mmol/L 的探針儲備液,并將其稀釋至2 μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液。用紫外分光光度計(jì)檢測多肽溶液的濃度。各金屬離子溶液采用其陰離子所對應(yīng)的酸配制成濃度為1 mmol/L 的離子溶液。

    1.3.2 紫外可見分光光度法 掃描范圍200~800 nm,以10 mmol/L HEPES緩沖溶液為空白背景調(diào)零,紫外分光光度計(jì)對儲備液稀釋液進(jìn)行檢測。根據(jù)朗伯比爾定律[21]按式(1)測定可溶性多肽的濃度。

    A=Σbc,

    (1)

    式中:

    A——吸光度;

    Σ——色氨酸的摩爾吸光系數(shù),5 400 L/(mol·cm);

    b——吸收池的厚度,cm;

    c——溶液的摩爾濃度,mol/L。

    1.3.3 熒光分光光度法

    (1) 測定多肽熒光探針光譜:以280 nm為激發(fā)波長,發(fā)射波長為290~450 nm,室溫下對HWEHH多肽探針溶液進(jìn)行熒光測量。狹縫設(shè)置10.0 nm,電壓500 V。對HEPES溶液、探針溶液、含有Cu2+的多肽探針溶液進(jìn)行3次熒光測量。

    (2) 溫度對探針穩(wěn)定性的影響:選取不同的溫度(25,30,35,40,45,50,55,60 ℃)孵育2 μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液10 min后進(jìn)行熒光測量,記錄不同溫度下多肽探針的熒光強(qiáng)度。

    (3) pH對多肽熒光探針的影響:使用HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)HEPES緩沖溶液的pH分別為2.0,4.0,6.0,7.4,8.0,10.0。采用不同pH緩沖溶液稀釋儲備液得2 μmol/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作液,進(jìn)行熒光測量記錄溶液的熒光強(qiáng)度,再向其中滴加Cu2+,使溶液中Cu2+最終濃度為1.5 μmol/L,計(jì)算不同pH下多肽探針的熒光變化率。

    (4) 標(biāo)準(zhǔn)曲線:

    ① 單個(gè)樣品檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線:向多肽探針溶液中滴加Cu2+進(jìn)行熒光測量,直至熒光強(qiáng)度不再變化,記錄每次滴加Cu2+的體積、濃度及熒光強(qiáng)度,繪制Cu2+標(biāo)準(zhǔn)曲線,并按式(2)計(jì)算解離常數(shù)[22]。

    ΔF=F0-FL=[(F0-Fα)/2M0]{(L+M0+Kd)-[(L+M0+Kd)2-4M0L]1/2},

    (2)

    式中:

    F0——無Cu2+存在下的熒光強(qiáng)度,AU;

    FL——Cu2+存在下的熒光強(qiáng)度,AU;

    Fα——Cu2+飽和的熒光強(qiáng)度,AU;

    M0——多肽與Cu2+結(jié)合的實(shí)際濃度,μmol/L;

    L——游離的Cu2+濃度,μmol/L;

    Kd——解離常數(shù),mol/L。

    ② 高通量樣品檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線:配置含有不同濃度Cu2+的多肽熒光探針溶液(0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.8,1.0,1.2,1.5 μmol/L),加入384孔板中,于酶標(biāo)儀中進(jìn)行熒光測量,激發(fā)波長280 nm;發(fā)射波長310~450 nm;記錄熒光強(qiáng)度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    (5) 選擇性試驗(yàn):標(biāo)準(zhǔn)工作液中滴加不同的金屬陽離子,使其最終濃度均為1.5 μmol/L,對其進(jìn)行熒光測量,再向含有不同金屬陽離子的工作液中滴加Cu2+,使Cu2+濃度為1.5 μmol/L。記錄熒光變化強(qiáng)度,并與只含Cu2+工作液的熒光變化強(qiáng)度進(jìn)行對比。

    1.4 HWEHH熒光探針檢測限的確定

    重復(fù)掃描標(biāo)準(zhǔn)工作液20次,按式(3)計(jì)算該熒光探針在該濃度下的檢測限[23]。

    LOD= 3σ/S,

    (3)

    式中:

    LOD——檢測限,μmol/L;

    σ——空白條件下掃描溶液20次的標(biāo)準(zhǔn)偏差;

    S——標(biāo)準(zhǔn)線性方程的斜率。

    1.5 實(shí)際樣品的測定

    對樣品的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測量以排除樣品自有的熒光強(qiáng)度對試驗(yàn)準(zhǔn)確性的影響。測量含有樣品的工作液的熒光強(qiáng)度,根據(jù)對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中Cu2+濃度,并進(jìn)行樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)檢測該方法的準(zhǔn)確性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 HWEHH的激發(fā)特征及Cu2+對其熒光的淬滅作用

    由圖2(a)可知,HWEHH熒光探針在280 nm處有最大吸收峰,吸光度為0.033,此時(shí)儲備液濃度為1.22 mmol/L。由圖2(b)可知,HEPES緩沖溶液在354 nm處無熒光峰,HWEHH探針溶液在354 nm處有較強(qiáng)的熒光峰。色氨酸的特征熒光峰約在360 nm[23],但是多肽中色氨酸的峰會由于周圍原子和電子的影響而發(fā)生偏移,因此HWEHH熒光探針的熒光峰的峰值位于354 nm。當(dāng)向探針溶液中加入Cu2+后,溶液在354 nm處熒光值大幅度降低,從2 136降低至900.5,表明HWEHH熒光的淬滅是由Cu2+引起的。

    圖2 HWEHH特征譜圖Figure 2 HWEHH characteristic spectrum

    2.2 溫度對HWEHH熒光探針穩(wěn)定性的影響

    由圖3可知,在試驗(yàn)范圍內(nèi),30 ℃的熒光強(qiáng)度最大,隨著溫度的升高,探針溶液的熒光強(qiáng)度峰值將會降低(由2 485降至1 877)。這是因?yàn)槿芤簻囟?30 ℃以上)越高,介質(zhì)黏度越低,分子之間的熱運(yùn)動越劇烈[24],從而增加熒光分子同溶劑分子之間的碰撞幾率。由此得出熒光探針的最佳工作溫度為30 ℃。而25,30 ℃的熒光強(qiáng)度差異率為6%,考慮工作時(shí)的檢測成本,后續(xù)所有試驗(yàn)均在25 ℃ 下進(jìn)行。

    圖3 HWEHH溶液在不同溫度下的熒光強(qiáng)度Figure 3 Fluorescence intensity of HWEHH solution at different temperatures

    2.3 pH對HWEHH熒光探針的影響

    由圖4(a)可知,當(dāng)pH為2.0~8.0時(shí),隨著pH的升高,熒光探針溶液在354 nm處的熒光強(qiáng)度也隨之升高。這是因?yàn)槿芤簆H值的變化影響熒光物質(zhì)的電離狀態(tài),從而影響熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度。由圖4(b)可知,Cu2+加入引起的多肽探針熒光變化率也會受到pH的影響,多肽熒光探針在酸性條件下與Cu2+結(jié)合較弱,熒光淬滅效果不明顯,變化率為0~0.2。增大pH,淬滅效果越來越明顯,變化率達(dá)到0.6以上,說明其靈敏度也升高。當(dāng)pH增大到7.4,8.0時(shí)變化率達(dá)到最佳,8.0之后pH越大,靈敏度隨之降低。這是因?yàn)樗嵝詶l件下,谷氨酸帶正電,與Cu2+產(chǎn)生靜電斥力,難以絡(luò)合,中性環(huán)境下,谷氨酸帶負(fù)電,與Cu2+有靜電吸引作用,使絡(luò)合更加穩(wěn)定[25]。組成多肽的氨基酸等電點(diǎn)均≤7.6,在pH 10時(shí),4個(gè)多肽分子均帶較多負(fù)電荷有斥力作用,與Cu2+的結(jié)合能力比pH 7.4,8.0的穩(wěn)定性差。通常情況下液體酸堿值大部分為中性,因此后續(xù)所有試驗(yàn)均在pH 7.4下進(jìn)行。

    圖4 不同pH下HWEHH熒光探針的熒光強(qiáng)度及熒光變化率Figure 4 Fluorescence intensity and change rate of HWEHH fluorescent probe at different pH value

    2.4 HWEHH熒光探針檢測Cu2+的標(biāo)準(zhǔn)曲線、解離常數(shù)和檢測限

    由圖5(a)可知,Cu2+對該探針的淬滅效果具有濃度依賴性。由圖5(b)可知,當(dāng)Cu2+濃度為0~1.5 μmol/L時(shí),隨著Cu2+濃度的增加,多肽探針的熒光強(qiáng)度降低,且其熒光強(qiáng)度與Cu2+呈負(fù)相關(guān),此時(shí)解離常數(shù)為7.5×10-7mol/L,絡(luò)合常數(shù)是解離常數(shù)的倒數(shù),為1.3×106L/mol,證明其絡(luò)合能力較強(qiáng)。其線性方程為Y= -1 135.085 7X+2 048.187 6(R2=0.999),檢測限為0.036 μmol/L。

    a~k中Cu2+濃度依次為:1.5,0.25,1,0.75,0.5,0.4,0.3,0.2,0.1,0.05,0 μmol/L圖5 不同濃度Cu2+的HWEHH溶液熒光光譜圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 5 Flourescence spectra standard curve of HWEHH containing different concentrations of Cu2+

    2.5 HWEHH熒光探針對Cu2+的選擇性

    由圖6(a)可知,只有Cu2+能引起探針熒光的顯著變化(0.81),其他金屬陽離子對該探針無明顯的淬滅效果(0.03~0.05)。由圖6(b)可知,當(dāng)溶液中存在其他金屬陽離子時(shí),不會對HWEHH熒光探針識別Cu2+產(chǎn)生影響。

    圖6 含有不同金屬陽離子的多肽溶液的熒光變化率Figure 6 Fluorescence change rate of HWEHH peptide solution containing different metal cations

    2.6 HWEHH高通量檢測Cu2+的標(biāo)準(zhǔn)曲線

    由圖7可知,關(guān)于Cu2+濃度的線性方程為Y=-283 958.437X+680 750.954(R2=0.981),說明可以利用多肽熒光探針法同高通量檢測技術(shù)結(jié)合來檢測食品中的Cu2+濃度。

    圖7 高通量檢測Cu2+濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 7 Standard curve of Cu2+ concentration in high-throughput detection

    2.7 實(shí)際樣品中Cu2+的測定

    自來水、飲用水在310 nm左右有水的拉曼峰,在其他位置無峰出現(xiàn),說明樣品自身在354 nm處無熒光值,不會影響HWEHH熒光探針對樣品中Cu2+濃度的檢測。由表1可知,自來水和飲用水中的加標(biāo)回收率為93.6%~101.9%,表明該熒光探針可以用于實(shí)際樣品中Cu2+含量的檢測。

    表1 加標(biāo)回收率Table 1 Standard recovery rate

    3 結(jié)論

    利用組氨酸—色氨酸—谷氨酸—組氨酸—組氨酸(HWEHH)多肽作為熒光探針,檢測了樣品中Cu2+的含量。結(jié)果表明,當(dāng)樣品中存在Cu2+時(shí),Cu2+與HWEHH絡(luò)合,阻斷多肽分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致HWEHH熒光的淬滅,使探針熒光值降低。當(dāng)熒光探針濃度為2 μmol/L時(shí),其對Cu2+有較高的選擇性,且檢測的線性范圍為0~1.5 μmol/L,線性方程為Y= -1 135.085 7X+2 048.187 6,檢出限為0.036 μmol/L。利用384孔板結(jié)合HWEHH熒光探針可實(shí)現(xiàn)對Cu2+的高通量檢測。通過對實(shí)際水樣品(自來水、飲用水)中Cu2+進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其回收率較高,可有效實(shí)現(xiàn)水溶液中Cu2+的檢測。此外,該探針與Cu2+的絡(luò)合機(jī)制沒有進(jìn)行深入研究,后續(xù)可以采取核磁共振、計(jì)算機(jī)模擬等方法對其作用機(jī)理進(jìn)行進(jìn)一步探究。

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