血清miR-215和miR-34a表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的關(guān)系*

李敏, 李海新△, 陳艷紅, 馮麗娟, 張雪陽(yáng), 楊謙

邯鄲市中心醫(yī)院 1檢驗(yàn)科， 2胸外科(河北邯鄲 056000)

肺癌為一種常見(jiàn)惡性腫瘤，也是癌癥死亡的主要原因，其發(fā)病率和病死率分別占我國(guó)全部惡性腫瘤的13%和18%[1]。非小細(xì)胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌病例的80%，有著高發(fā)病率、預(yù)后差及高病死率等特點(diǎn)[2]，NSCLC術(shù)后死亡的主要因素為復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[3]，而微小核糖核酸(microRNA，miR)與惡性腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[4]。miR-215為新近發(fā)現(xiàn)的微小RNA之一，在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、周期調(diào)控中發(fā)揮重要作用，如胃癌[5]、肝內(nèi)膽管癌[6]。miR-34a與血管生成相關(guān)，且在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)并發(fā)揮重要作用，如結(jié)腸癌[7]、肝癌[8]等。相關(guān)報(bào)道已證實(shí)，miR-34a、miR-215分別在結(jié)直腸癌和卵巢上皮性癌復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移中發(fā)揮一定作用[9-10]，但其與NSCLC復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的關(guān)聯(lián)性尚不清楚。為了解血清miR-215和miR-34a表達(dá)水平與NSCLC患者復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的關(guān)系，本次研究對(duì)此展開(kāi)分析，旨在為今后臨床治療NSCLC提供有效的參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月至2019年5月在我院確診并治療的NSCLC患者113例，根據(jù)隨訪期間是否發(fā)生復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移分為無(wú)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移組(n=54)和復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移組(n=59)，無(wú)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移組：男31例，女23例；年齡40～73歲，平均(62.23±5.12)歲；吸煙31例；腫瘤分化程度：中高分化38例，低分化16例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期39例，Ⅲa期 15例；腫瘤部位：左肺22例，右肺32例；腫瘤病理類(lèi)型：腺癌27例，鱗癌27例。復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移組：男36例，女23例；年齡42～74歲，平均(63.11±5.48)歲；吸煙37例；腫瘤分化程度：中高分化27例，低分化32例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期30例，Ⅲa期 29例；腫瘤部位：左肺25例，右肺34例；腫瘤病理類(lèi)型：腺癌33例，鱗癌26例。同期收集113例體檢健康志愿者為對(duì)照組，其中男70例，女43例；年齡41～75歲，平均(63.33±5.46)歲；吸煙64例。3組對(duì)象間性別、年齡、吸煙情況比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[倫(審)A20180107-1]。

入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《中華醫(yī)學(xué)會(huì)肺癌臨床診療指南(2018版)》中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]，經(jīng)穿刺活檢病理確診，為原發(fā)病灶；(2)擬行胸腔鏡下肺癌根治術(shù)；(3)病歷資料完整；(4)患者或家屬簽署知情同意書(shū)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤；(2)合并嚴(yán)重內(nèi)分泌疾?。?3)合并精神系統(tǒng)疾病、感染性疾病；(4)合并心、肝、腎及腦等重要臟器疾??；(5)活動(dòng)性炎癥。

剔除標(biāo)準(zhǔn)：隨訪期間失訪。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR法檢測(cè)血清miR-215和miR-34a表達(dá)情況 患者于入院次日清晨(術(shù)前)、對(duì)照組于體檢當(dāng)天采集空腹時(shí)的外周靜脈血5 mL于抗凝管內(nèi)，以3 000 r/min進(jìn)行高速離心，離心時(shí)間為10 min，將上層血清分離，于-80°冰箱中保存。用北京伊塔生物科技有限公司提供的總RNA提取試劑盒(批號(hào)YTA220)提取血清內(nèi)總RNA，用上海研卉生物科技有限公司提供的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)toyobo/FSQ-301)將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，預(yù)變性95℃/5 min，變性93℃/10 s，退火61℃/30 s，延伸72℃/15 s，40個(gè)循環(huán)。引物委托上海杏園瑞民生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。引物序列：miR-215：F:5′-CCTGTGCTGCGAAGTGGAAAC-3′，R:5′-TTCGATCTGCTCCTGGCAGG-3′，miR-34a：F:5′-CATGTAGACCAGGACCTAAGG-3′，R:5′-GGAGGTCGGTACCAGAGTG-3′。以2-ΔΔCt計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化后的miR-215和miR-34a表達(dá)水平，Ct為循環(huán)閾值，內(nèi)參為GAPDH，ΔΔCt=(Ct目的-Ct內(nèi)參)-Avg.(Ct目的-Ct內(nèi)參)。

1.2.2 隨訪 對(duì)本研究中的113例患者行胸腔鏡下肺癌根治術(shù)后予以電話和門(mén)診復(fù)查的方式進(jìn)行隨訪，從手術(shù)日隨訪至患者死亡或隨訪期滿，隨訪期為24個(gè)月，每3個(gè)月復(fù)查1次，內(nèi)容包括癥狀、體征、影像學(xué)表現(xiàn)等，以二次活檢發(fā)現(xiàn)新的腫瘤灶或轉(zhuǎn)移灶為復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，記錄復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移情況。對(duì)于隨訪中遇到不能確定的轉(zhuǎn)移灶，做PET/CT檢查進(jìn)一步核實(shí)。

2 結(jié)果

2.1 3組血清miR-215、miR-34a表達(dá)水平的比較 血清miR-215在復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)水平顯著低于無(wú)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移組和對(duì)照組，且無(wú)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移組低于對(duì)照組(P<0.05)。血清miR-34a在復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)水平顯著高于無(wú)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移組和對(duì)照組，且無(wú)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移組高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 3組血清miR-215和miR-34a表達(dá)水平

2.2 復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移組和無(wú)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移組的臨床病理參數(shù)的比較 復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移組和無(wú)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移組間性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤病理類(lèi)型、吸煙情況比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移組和無(wú)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移組間腫瘤分化程度、TNM分期比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 對(duì)比復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移組和無(wú)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移組的臨床病理參數(shù) 例(%)

2.3 NSCLC復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的影響因素分析 建立非條件logistic回歸模型，以本研究資料為樣本，以NSCLC復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移狀況為應(yīng)變量，賦值1=復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，0=否。分別進(jìn)行：(1)單因素分析：自變量指標(biāo)列示于表3，各指標(biāo)賦值參見(jiàn)表3。回歸結(jié)果：腫瘤分化程度為低分化、TNM分期為Ⅲa期、miR-215低表達(dá)、miR-34a高表達(dá)均可能為NSCLC復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素(OR>1，P<0.05)。見(jiàn)表3。(2)多因素分析： 自變量為單因素分析中呈現(xiàn)顯著的4個(gè)指標(biāo)，賦值參見(jiàn)表4。回歸過(guò)程采用逐步后退法，以進(jìn)行自變量的選擇和剔除，設(shè)定α剔除=0.10，α入選=0.05?；貧w結(jié)果：TNM高分期、腫瘤低分化及miR-215低表達(dá)、miR-34a高表達(dá)是NSCLC復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素(OR>1，P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 多因素分析NSCLC復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的影響因素

2.4 ROC曲線分析 進(jìn)一步對(duì)miR-215、miR-34a等二指標(biāo)進(jìn)行NSCLC復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)評(píng)估價(jià)值分析，結(jié)果顯示：(1)各指標(biāo)的單獨(dú)應(yīng)用：以轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組為陽(yáng)性樣本(n=59)，以無(wú)轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)組為陰性樣本(n=54)，建立ROC診斷分析模型，兩指標(biāo)均參考臨床實(shí)踐劃分成若干個(gè)組段，再以軟件擬合之ROC曲線讀取約登指數(shù)最大值點(diǎn)，對(duì)應(yīng)計(jì)算理論閾值和各項(xiàng)參數(shù)。并按實(shí)測(cè)樣本計(jì)算敏感度、特異度、準(zhǔn)確度。經(jīng)ROC分析知：該兩指標(biāo)具有較高的診斷價(jià)值，AUC分別為0.723、0.750。(2)各指標(biāo)的聯(lián)合應(yīng)用：參考SPSS軟件的聯(lián)合應(yīng)用之理論Log(P)模式，基于回歸預(yù)測(cè)模型結(jié)果，將各單獨(dú)應(yīng)用指標(biāo)的回歸系數(shù)B作為計(jì)分參數(shù)，歸一化加權(quán)計(jì)算并對(duì)應(yīng)處理各樣本資料，據(jù)以進(jìn)行聯(lián)合應(yīng)用的ROC分析和制作ROC分析曲線。結(jié)果：對(duì)miR-215、miR-34a聯(lián)合應(yīng)用對(duì)NSCLC復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)評(píng)估價(jià)值：AUC(95%CI)為0.835(0.704～0.965)，準(zhǔn)確度為0.845(98/116)。

表5 血清miR-215和miR-34a預(yù)測(cè)NSCLC復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的價(jià)值

圖1 miR-215和miR-34a預(yù)測(cè)NSCLC復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的ROC曲線

3 討論

NSCLC約占全部肺癌的80%，75%左右的患者發(fā)現(xiàn)并確診時(shí)已處于疾病中晚期，失去手術(shù)治療機(jī)會(huì)。然而，即便早期患者進(jìn)行手術(shù)治療仍具有較高復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量[12]。因此，深入研究NSCLC的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移機(jī)制并探尋有效干預(yù)治療靶點(diǎn)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)該病治療的突破，為目前諸多學(xué)者研究的焦點(diǎn)。

腫瘤分子標(biāo)志物的血清水平通常與癌癥的發(fā)生、病情發(fā)展、癌灶消退、復(fù)發(fā)等有著一定程度的相關(guān)性，因而測(cè)定腫瘤標(biāo)志物血清水平對(duì)于獲得惡性腫瘤的早期診斷、治療療效及預(yù)后情況等方面信息有著重要意義[13]。肺癌腫瘤標(biāo)志物在肺癌診斷的臨床應(yīng)用方面有一定意義，但尚未找到高敏感性和特異性單一肺癌標(biāo)志物。近年來(lái)各報(bào)道顯示[14-15]，近50%以上的miRNA定位于和腫瘤有關(guān)的染色體上，提示miRNA分子與腫瘤發(fā)生及病情發(fā)展相關(guān)。腫瘤引起的miRNA分子表達(dá)水平改變，能特異地反映在機(jī)體外周血中，故而可作為腫瘤早期診斷和預(yù)后評(píng)估的血清標(biāo)志物[16-17]。因此，研究miRNA與肺癌的關(guān)系有著重要臨床指導(dǎo)意義。miRNA是一類(lèi)長(zhǎng)約22 nt的非編碼RNA分子，可通過(guò)干擾靶mRNA穩(wěn)定性或翻譯效率對(duì)機(jī)體內(nèi)基因表達(dá)起到負(fù)性調(diào)控作用[18]。miR-34a為miRNA中的一種，是miR-34家族中的一員，大小為22個(gè)堿基，基因定位于1p36.23上，與細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等細(xì)胞生物學(xué)行為關(guān)系密切。研究顯示miR-34a能夠負(fù)向調(diào)控Notch1 mRNA和蛋白表達(dá)水平，發(fā)揮阻止MCF-7乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的效應(yīng)[19]。另有研究發(fā)現(xiàn)[9]，miR-34a是結(jié)直腸癌根治術(shù)后無(wú)病生存期的影響因素之一，能夠作為預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌根治術(shù)患者術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)及腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在分子指標(biāo)之一。有學(xué)者通過(guò)檢測(cè)miR-34a在膀胱癌患者中表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)該分子水平與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及預(yù)后相關(guān)[20]。另有研究證實(shí)[21]，miR-34a為影響喉癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，可能是喉癌診治的新靶點(diǎn)。miR-215是一個(gè)受p53誘導(dǎo)表達(dá)的miRNA，能夠調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)，該分子亦為miRNA中與腫瘤關(guān)系密切的一種，能參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、耐藥等過(guò)程，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后顯著相關(guān)。以往研究顯示基因毒性應(yīng)激可使miR-215水平增加，miR-215水平上調(diào)會(huì)引起腫瘤細(xì)胞周期停滯[22]。既往實(shí)驗(yàn)證實(shí)用射線照射N(xiāo)SCLC細(xì)胞系A(chǔ)549后，基因芯片顯示多個(gè)microRNA表達(dá)出現(xiàn)變化，其中包括miR-215[23]。

本研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者血清中miR-215呈低表達(dá)和miR-34a呈高表達(dá)，提示上述2個(gè)分子可能成為評(píng)估 NSCLC發(fā)病的腫瘤血清標(biāo)志物。此外，本研究分析了血清miR-215、miR-34a與NSCLC患者復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的關(guān)系，logistic回歸模型分析顯示除了TNM高分期、腫瘤低分化外，miR-215低表達(dá)、miR-34a高表達(dá)也是NSCLC復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素，提示miR-215和miR-34a在NSCLC復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移及預(yù)后預(yù)判中有一定的評(píng)估作用。ROC曲線顯示，miR-215及miR-34a，聯(lián)合預(yù)測(cè)NSCLC復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的AUC、敏感度、特異度及準(zhǔn)確度均較高，提示該2指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)應(yīng)用對(duì)于NSCLC復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移有較高的預(yù)判價(jià)值。進(jìn)一步分析，miR-34a表達(dá)可能通過(guò)Snail誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化而促使癌細(xì)胞侵襲遷移，繼而引發(fā)NSCLC復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[24]。既往研究報(bào)道[25]，miR-215可通過(guò)下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶16(matrix metalloproteinase 16，MMP-16)表達(dá)水平而抑制NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549增殖和侵襲，反之，miR-215表達(dá)減少則會(huì)促進(jìn)A549細(xì)胞增殖及遷移，因而推測(cè)miR-215低表達(dá)可能通過(guò)增加MMP-16合成與表達(dá)而促使NSCLC復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。

綜上所述，miR-215、miR-34a與NSCLC復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，miR-215低表達(dá)與miR-34a高表達(dá)為NSCLC復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素，兩者聯(lián)合檢查有助于預(yù)測(cè)NSCLC復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，這可為今后臨床診治NSCLC提供參考依據(jù)，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步明確。

利益相關(guān)聲明：所有作者聲明無(wú)利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說(shuō)明：李敏、李海新：確定選題、設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、實(shí)施研究、論文撰寫(xiě)；陳艷紅、馮麗娟、張雪陽(yáng)：數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)分析、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理；李海新、楊謙：論文審核、項(xiàng)目經(jīng)費(fèi)資助。