普通硅肥與納米硅肥對(duì)烤煙內(nèi)生真菌種群結(jié)構(gòu)的影響

穆耀輝，婁慧敏，程亞倩，王軍霞，鄧金華，鄭 璽，葉愛萍，黃金輝，艾綏龍，王平平，張立新

(1. 陜西省煙草公司商洛市公司，陜西 商洛 726000；2. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；3. 陜西省龍草坪林業(yè)局，陜西 楊凌 712100；4. 陜西省煙草科學(xué)研究所，陜西 西安 710000)

0 引言

硅是存在于地殼中的元素，其含量高達(dá)31%，是僅次于氧的第二大元素[1～2]。在自然界中，硅在不同地區(qū)土壤中含量不同，在不同種屬間也不同。在孫德權(quán)等人的研究中，納米硅可以被植物的根部吸收，進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部后，再被轉(zhuǎn)運(yùn)到各個(gè)細(xì)胞器，組成細(xì)胞組分或調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育等，還可通過共質(zhì)體或質(zhì)外體途徑遷移，并在植物不同組織中進(jìn)行積累[3]。孫夢(mèng)夢(mèng)等的研究中，硅元素具有許多調(diào)控作用，如調(diào)控植物抗逆性、光合作用以及對(duì)植株中鎘的化學(xué)形態(tài)和分布的調(diào)控[4]。此外，硅肥能為作物提供硅營養(yǎng)、調(diào)節(jié)土壤中的氮磷鉀等養(yǎng)分供給、增加作物抗非生物脅迫以及生物脅迫的能力，促進(jìn)植物生長，改善作物的品質(zhì)[5]。在逆境脅迫下，硅對(duì)植物生長的影響廣泛，如抗旱[6]、抗鹽[7]、抗病[8]、抗重金屬[9]、抗蟲[10]等。

植物內(nèi)生真菌是指生活在植物組織中的微生物，包括細(xì)菌和真菌，他們并不會(huì)明顯損害植物[11]。經(jīng)過多年的進(jìn)化歷程，植物內(nèi)生真菌與植物形成互利共生的關(guān)系，內(nèi)生真菌通過刺激植物產(chǎn)生某些植物激素，從而使其能夠抵御某些蟲害、病害、非生物脅迫等[12]。一些內(nèi)生真菌存在于植物組織的全部或部分生命周期，并可能保護(hù)植物宿主免受病原體、昆蟲食草動(dòng)物甚至非生物脅迫的危害，如干旱、熱、鹽度等[13～15]。

據(jù)估計(jì)，在大約30萬種陸地植物物種中，分布著超過100萬種植物內(nèi)生真菌[16]。某些內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生與其植物宿主相同或相似的活性物質(zhì)，這為這類活性物質(zhì)的提取提供了巨大的便利；也使得植物內(nèi)生真菌在尋找新藥方面得到廣泛應(yīng)用，作為抗菌劑應(yīng)用于市場(chǎng)[11,17]。目前，關(guān)于烤煙內(nèi)生真菌對(duì)其化學(xué)成分及香氣物質(zhì)等品質(zhì)的影響的研究較多，而對(duì)其內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)的影響及其影響機(jī)制的研究較少。因此，筆者以煙草為研究材料，對(duì)其葉片內(nèi)生真菌進(jìn)行提取及高通量測(cè)序，從不同水平分析對(duì)煙葉內(nèi)生真菌群落組成及結(jié)構(gòu)的影響，利用RDA分析烤煙煙葉化學(xué)成分及致香物質(zhì)與群落組成的相關(guān)性，以期明確施硅對(duì)煙草內(nèi)生真菌種群結(jié)構(gòu)的影響，進(jìn)一步為相關(guān)研究提供研究材料。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗(yàn)地

烤煙由陜西省煙草科學(xué)研究所提供，品種為云煙99，種植于陜西省商洛市洛南縣永豐鎮(zhèn)。其土壤類型為黃棕壤土，基本性質(zhì):pH=5.43，有機(jī)質(zhì)含量11.35 g/kg，速效氮、磷、鉀含量分別為52.76 g/kg，26.08 g/kg，126.00 g/kg。普通硅肥采用寶來化肥有限公司(煙臺(tái))，主要成分為硅酸鈉，硅含量15%。納米硅采用山東優(yōu)索化工科技有限公司，顆粒直徑范圍為8～15 nm，主要成分為SiO2,硅含量為30%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品處理

田間試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，肥料施用按當(dāng)?shù)貥?biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，施用量為2 250 kg/hm2處理設(shè)置分別為CK(噴施清水)、T5(0.17 kg/hm2普通硅)、T8(0.32 kg/hm2納米硅)。每個(gè)處理重復(fù)三次，小區(qū)面積91.2 m2，植煙160 株，分別于旺長期、現(xiàn)蕾期、圓頂期噴施。在成熟期采集煙株樣品，每個(gè)處理選取三片具有代表性的中部煙葉(從下向上數(shù)第十片葉)，放入冷鏈箱中，用于后續(xù)煙葉內(nèi)生真菌高通量測(cè)序。

1.3 DNA提取與高通量測(cè)序

樣品送往美吉生物公司進(jìn)行內(nèi)生真菌的高通量測(cè)序。測(cè)序前用流動(dòng)水多次進(jìn)行沖洗，確保干凈，無污物。隨后對(duì)其表面進(jìn)行消毒，使用75%乙醇浸泡1 min，1%次氯酸鈉3 min，消毒期間不斷搖晃，使消毒試劑與煙葉充分接觸，后用無菌水洗滌3 次，用第三次清洗水進(jìn)行平板涂布，確認(rèn)消毒徹底后進(jìn)行DNA的提取和高通量測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析參考謝紅煉等人的方法[18]。數(shù)據(jù)優(yōu)化使用Flash(Vertion1.2.11)、Qiime(Vertion1.9.1)、Fastp(Vertion0.19.6)進(jìn)行分析。OTU序列聚類、統(tǒng)計(jì)、注釋使用Uparse(Vertion7.0.1090)、Usearch(Vertion7)、RDP Classifier(Vertion2.11)進(jìn)行分析。隨后，再將分類好的OTU序列與真菌ITS數(shù)據(jù)庫UNITE(Vertion8)進(jìn)行比對(duì)，統(tǒng)計(jì)各樣本在不同分類水平(Domain(域)，Kingdom(界)，Phylum(門)，Class(綱)，Order(目)，F(xiàn)amily(科)，Genus(屬)，Species(種))上的物種組成。樣品Alpha多樣性分析使用分析軟件Mothur(Vertion1.30.2)進(jìn)行。通過Student’s t檢驗(yàn)(Student’s t test)來檢驗(yàn)指數(shù)組間差異。NMDS分析利用軟件Qiime(Version1.9.1)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。最后，用VIF方差膨脹因子分析篩選去掉無用的環(huán)境因子(VIF值大于10)后，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行RDA分析(R語言vegan包中RDA分析和作圖)。

2 結(jié)果與分析

2.1 硅及納米硅對(duì)烤煙煙葉內(nèi)生真菌群落多樣性的影響

由圖1可知，隨著樣品序列的增多，曲線呈先增高后逐漸趨于穩(wěn)定的狀態(tài)?？梢娫诒驹囼?yàn)中，測(cè)序序列數(shù)目選用較合理，再增加序列數(shù)目，OTU數(shù)目的變化并不是很大。在內(nèi)生真菌OTU稀釋曲線中，CK噴施清水、T5噴施硅、T8噴施納米硅，可看出噴施硅和納米硅后，內(nèi)生真菌數(shù)目逐漸下降，多樣性降低。

圖1 不同處理烤煙葉片內(nèi)生真菌OTU稀釋曲線

對(duì)烤煙內(nèi)生真菌的9 個(gè)樣本進(jìn)行高通量測(cè)序后，其原始序列數(shù)目及有效序列數(shù)目分別如表1所示。將表中有效序列進(jìn)行97%一致性聚類分析后，發(fā)現(xiàn)其OTUs在123-326之間；進(jìn)行α多樣性指數(shù)比對(duì)分析后，發(fā)現(xiàn)其Chao指數(shù)沒有顯著性差異，在124.88-195之間，相較于CK組來說，群落豐富度降低，但不顯著。通過Shannon指數(shù)來看，差異較顯著，說明噴施納米硅使群落中物種多樣性顯著高于硅。通過比較simpson指數(shù)，發(fā)現(xiàn)噴施硅及納米硅后，其數(shù)值降低，但差異不顯著?？傮w來看，在一定程度上，噴施硅及納米硅使烤煙內(nèi)生真菌的豐富度降低，多樣性增加。

表1 測(cè)序數(shù)據(jù)及α多樣性指數(shù)的統(tǒng)計(jì)

2.2 硅及納米硅對(duì)烤煙煙葉內(nèi)生真菌群落組成的影響

將OTU序列與真菌ITS庫進(jìn)行比對(duì)后，分別統(tǒng)計(jì)門、綱、目、科、屬、種水平群落組成。在門水平上，結(jié)果如圖2所示，相對(duì)豐度較高的是子囊菌門(Ascomycota)和擔(dān)子菌門(Basidiomycota)。且相較于CK來說，子囊菌門占總序列的比例有所下降，擔(dān)子菌門的有所升高。

對(duì)其進(jìn)行綱水平的分析，結(jié)果如圖3，發(fā)現(xiàn)7 類真菌，最優(yōu)勢(shì)菌綱為座囊菌綱(Dothideomycetes)，相對(duì)豐度分別是45.64%、42.24%、62.60%，可見噴施硅和納米硅后，其優(yōu)勢(shì)菌種類不變，但相對(duì)豐度改變。

對(duì)目水平進(jìn)行分析后，結(jié)果如圖4，各處理優(yōu)勢(shì)菌種類基本不變，但相對(duì)豐度改變。格孢腔菌目(Pleosporales)均占比較高，分別為36.81%、33.57%、32.62%，且格孢腔菌目是CK、T8的最優(yōu)勢(shì)菌。

圖2 不同處理烤煙葉片內(nèi)生真菌門水平上的群落組成

圖3 不同處理烤煙葉片內(nèi)生真菌綱水平上的群落組成

圖4 不同處理烤煙葉片內(nèi)生真菌目水平上的群落組成

對(duì)科水平進(jìn)行分析后，得到heatmap圖(如圖5)，可見不同處理間科水平真菌群落組成分布存在差異，豐度較CK組低的有Debaryomycetaceae、Trimorphomycetaceae、Hypocreales_fam_Incertae_sedis、Helotiaceae柔膜菌科、Cystobasidiaceae囊擔(dān)菌科、科水平未分類的銀耳目unclassified_o__Tremellales、目水平未分類的糞殼菌綱unclassified_c__Sordariomycetes、Nectriaceae叢赤殼科、Mortierellaceae被孢霉科、Xylariales_fam_Incertae_sedis、Torulaceae、Trichosporonaceae；較CK組高的有Erysiphaceae白粉菌科、Periconiaceae、科水平未分類的煤炱目unclassified_o__Capnodiales、Chaetomiaceae毛殼菌科、Halosphaeriaceae海殼菌科。說明噴施硅及納米硅后，其科水平群落組成改變。

圖5 不同處理烤煙葉片內(nèi)生真菌科水平上的群落組成

2.3 硅及納米硅對(duì)烤煙煙葉內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

由圖6可知，CK處理烤煙煙葉的優(yōu)勢(shì)屬(豐度≥1%)為Cladosporium枝孢屬(23%)、Filobasidium線黑粉酵母屬(2.05%)、Alternaria鏈格孢屬(12.23%)、Sporobolomyces擲孢酵母屬(6.16%)、Epicoccum附球霉屬(1%)、Paraphoma異莖點(diǎn)霉屬(5.11%)、Septoria殼針孢屬(1.19%)。

T5處理烤煙煙葉的優(yōu)勢(shì)屬為Cladosporium枝孢屬(6.57%)、Filobasidium線黑粉酵母屬(4.37%)、Alternaria鏈格孢屬(12.67%)、Paraphoma異莖點(diǎn)霉屬(5.26%)、Epicoccum附球霉屬(3.01%)、Dioszegia(2.85%)、Septoria殼針孢屬(1.02%)、Sporobolomyces擲孢酵母屬(7.34%)、Hannaella漢納酵母屬(1.79%)。

T8處理烤煙煙葉的優(yōu)勢(shì)屬為Cladosporium枝孢屬(10.36%)、Alternaria鏈格孢屬(12.22%)、Sampaiozyma(3.78%)、Septoria殼針孢屬(1.14%)、Vishniacozyma維希尼克氏酵母屬(1.6%)、Sporobolomyces擲孢酵母屬(4.89%)、Meyerozyma畢赤酵母屬(1.69%)、Filobasidium線黑粉酵母屬(10.6%)、Rhodotorula紅酵母屬(1.09%)、Saitozyma(1.14%)。

總體來看，與CK相比，T5、T8處理屬的種類及豐度均有不同程度的改變，其中T5、T8減少了Cladosporium枝孢屬的豐度，分別降低到了6.57%、10.36%；增加了Filobasidium線黑粉酵母屬豐度，分別增加到4.37%、10.6%。此外，T5優(yōu)勢(shì)屬增加了Dioszegia(2.85%)、Hannaella漢納酵母屬(1.79%)，T8處理優(yōu)勢(shì)屬增加了Sampaiozyma(3.78%)、Meyerozyma畢赤酵母屬(1.69%)、Vishniacozyma維希尼克氏酵母屬(1.6%)、Rhodotorula紅酵母屬(1.09%)、Saitozyma(1.14%)，減少了Paraphoma異莖點(diǎn)霉屬、Epicoccum附球霉屬?？梢姡ㄟ^施加硅和納米硅可以改變內(nèi)生真菌的豐富度和多樣性，從而改變其種群結(jié)構(gòu)。

在種水平，如圖7，CK附生真菌群落中的占比≥1%種為枝孢屬Cladosporium_delicatulum(22.98%)、異莖點(diǎn)霉屬Paraphoma_chrysanthemicola(4.99%)、線黑粉酵母屬Filobasidium_magnum(2.05%)、附球菌屬Epicoccum_nigrum(1%)、擲孢酵母屬Sporobolomyces_oryzicola(5.89%)。

圖6 不同處理烤煙葉片內(nèi)生真菌屬水平上的群落組成

T5處理的占比≥1%種為枝孢屬Cladosporium_delicatulum(6.55%)、附球菌屬Epicoccum_nigrum(3.01%)、擲孢酵母屬Sporobolomyces_oryzicola(6.74%)、異莖點(diǎn)霉屬Paraphoma_chrysanthemicola(5.16%)、線黑粉酵母屬VFilobasidium_magnum(4.34%)、Dioszegia_zsoltii_var._yunnanensis(1.85%)。

T8處理的占比≥1%種為枝孢屬Cladosporium_delicatulum(10.27%)、擲孢酵母屬Sporobolomyces_oryzicola(4.58%)、Saitozyma_podzolica(1.14%)、桑帕約氏酵母Sampaiozyma vanillica(3.78%)、維希尼克氏酵母屬vishniacozyma-carnescens(1.28%)、線黑粉酵母屬Filobasidium_magnum(10.53%)、季也蒙畢赤酵母meyerozyma-guilliermondii(1.69%)。

種水平的變化結(jié)果與屬水平相似。結(jié)果表明，噴施硅及納米硅后枝孢屬Cladosporium_delicatulum含量下降，種水平未分類的鏈格孢屬unclassified_g_alternaria含量穩(wěn)定，線黑粉酵母屬Filobasidium_magnum含量增加。此外，噴施硅后附球菌屬Epicoccum_nigrum含量增加2.01%，Dioszegia_zsoltii_var._yunnanensis含量增加1.6%。噴施納米硅后烤煙煙葉異莖點(diǎn)霉屬Paraphoma_chrysanthemicola、附球菌屬Epicoccum_nigrumV含量下降，較CK下降3.23%、0.08%。新出現(xiàn)季也蒙畢赤酵母meyerozyma-guilliermondii(1.69%)、Saitozyma_podzolica(1.14%)優(yōu)勢(shì)種。優(yōu)勢(shì)菌種改變，可見噴施硅及納米硅使得煙葉的種群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

圖7 不同處理烤煙葉片內(nèi)生真菌種水平上的群落組成

對(duì)不同處理烤煙煙葉片進(jìn)行分析，做出Venn圖，其描繪了每個(gè)樣本唯一的或在多個(gè)樣本之間共享的物種數(shù)目，并直觀地顯示了樣本之間的物種數(shù)重疊。與CK相比，T5特有物種有67種；T8有130種。隨后，對(duì)不同處理進(jìn)行NMDS分析，如圖8(c)發(fā)現(xiàn)噴施硅及納米硅后，物種的群落組成受到影響。

圖8 不同處理烤煙葉片內(nèi)生真菌群落韋恩

2.4 內(nèi)生真菌群落組成與煙葉化學(xué)成分及香氣物質(zhì)之間的相關(guān)性

對(duì)烤煙化學(xué)成分與內(nèi)生真菌進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如圖9，可見煙堿及可溶性蛋白與各處理顯著相關(guān)；而鉀、淀粉、可溶性糖與其相關(guān)性未達(dá)到顯著水平。因此，推測(cè)噴施硅及納米硅后，其內(nèi)生真菌群落水平的變化可能與其化學(xué)成分的改變有關(guān)。

在楊沫等的研究中，小芒森干白葡萄酒釀造過程中，微生物群落豐度及多樣性對(duì)醇酯類等香氣物質(zhì)的含量具有影響。其香氣物質(zhì)總含量呈增加趨勢(shì)，且酯類物質(zhì)的含量增加最為明顯[19]。在Shen Yan等人的研究中，對(duì)土壤微生物與煙草香氣成分進(jìn)行了RDA分析，檢測(cè)了40種關(guān)鍵系統(tǒng)類型微生物，發(fā)現(xiàn)其中11種與煙草香氣呈顯著相關(guān)[20]。于是，在本研究中，為了評(píng)估烤煙煙葉內(nèi)生真菌與香氣物質(zhì)之間的相關(guān)性，我們也對(duì)其進(jìn)行了RDA分析，結(jié)果如圖10所示，可以看出，總香氣物質(zhì)與各處理具有顯著相關(guān)性；美拉德反應(yīng)產(chǎn)物及類西柏烷類降解產(chǎn)物與各處理間具有相關(guān)性，但未達(dá)到顯著水平。因此，推測(cè)香氣物質(zhì)的含量變化可能與烤煙煙葉內(nèi)生真菌種群結(jié)構(gòu)的變化有關(guān)。

圖9 煙葉化學(xué)成分與烤煙煙葉內(nèi)生真菌目水平

圖10 不同處理烤煙煙葉內(nèi)生真菌目水平群落組成與

3 討論

3.1 施用硅及納米硅對(duì)烤煙煙葉內(nèi)生真菌的影響

硅在地球上的含量僅次于氧。在不同的土壤中，其含量差別較大，在不同植物種屬中的含量也不同。納米硅以其分子較小，而能夠通過質(zhì)外體途徑進(jìn)入到植株內(nèi)。在孫德權(quán)等對(duì)納米硅材料的研究中，發(fā)現(xiàn)其本身對(duì)植物沒有毒性，在一定程度上，能夠促進(jìn)植物種子萌發(fā)，也能提高植物對(duì)非生物脅迫的抵抗能力，增加抗重金屬的能力[3]。但納米硅的累積效應(yīng)也使得對(duì)其的使用存有爭議。例如，在植物的下一代中能夠檢測(cè)到納米硅的存在[21]。

在本研究中，T8處理的物種組成差異較CK與T5的較大，表明納米硅噴施后煙葉內(nèi)生真菌豐度改變，同時(shí)其種群結(jié)構(gòu)也改變，這與周家喜等人的研究結(jié)果是一致的[22]。隨后又利用生物學(xué)軟件對(duì)烤煙煙葉內(nèi)生真菌不同水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在不同水平上其優(yōu)勢(shì)菌群的豐富度不同，且種類也有變化。如T5與T8處理中，內(nèi)生真菌枝孢屬Cladosporium的豐度下降，線黑粉酵母屬Filobasidium豐度增加。在Venkateswarulu N等人的研究中，枝孢屬可以產(chǎn)生白花丹醌，而后者具有抗菌和抗病毒作用[23]。在韓龍等人的研究中，線黑粉酵母屬可以產(chǎn)生淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶、果膠酶、幾丁質(zhì)酶，而這些酶可以被分泌到胞外并降解煙葉內(nèi)的大分子有機(jī)化合物，產(chǎn)生香氣物質(zhì)[24]。此外，T5優(yōu)勢(shì)屬增加了Dioszegia(2.85%)、Hannaella漢納酵母屬(1.79%)，T8處理優(yōu)勢(shì)屬增加了Sampaiozyma(3.78%)、Meyerozyma畢赤酵母屬(1.69%)、Vishniacozyma維希尼克氏酵母屬(1.6%)、Rhodotorula紅酵母屬(1.09%)、Saitozyma(1.14%)，減少了Paraphoma異莖點(diǎn)霉屬、Epicoccum附球霉屬。而異莖點(diǎn)霉屬 Paraphoma_chrysanthemicola 可以提高植株對(duì)重金屬和黃瓜枯萎病的抗性[25]。附球霉屬 Epicoccum 菌株可以產(chǎn)生抗真菌化合物，防治真菌病害[26]。

通過筆者研究也可以明確不同條件下其優(yōu)勢(shì)菌群的變化，為進(jìn)一步提高煙草的生長發(fā)育創(chuàng)造更加有利的環(huán)境，對(duì)提高煙草產(chǎn)量和質(zhì)量及煙草中的某些化學(xué)成分提取具有某些重要意義。但對(duì)其具體的影響機(jī)制還不清楚，以后還有待在這方面進(jìn)行更加深入的研究。

3.2 內(nèi)生真菌群落組成與煙葉化學(xué)成分及香氣物質(zhì)之間的相關(guān)性

在楊永鋒等人的研究中，高碳基肥料和綠色木霉配施處理后，西柏烷類香氣物質(zhì)茄酮的含量達(dá)到60.50±2.60 ug/g，與對(duì)照及單一處理相比含量升高明顯，具有顯著性差異[27]。在龍丹等的研究中，微生物制劑對(duì)茶葉香氣具有提升作用，如包括β-葡萄糖苷酶、β-櫻草糖苷酶、半乳糖苷酶等在內(nèi)的微生物酶制劑和包括霉菌、細(xì)菌、酵母菌在內(nèi)的微生物發(fā)酵劑[28]。說明在一定程度上，微生物對(duì)烤煙香氣物質(zhì)的含量是有影響的，這與本研究的結(jié)果一致。在筆者研究中，內(nèi)生真菌的群落組成與總香氣物質(zhì)的含量具有顯著相關(guān)性。此外，在鄭堅(jiān)強(qiáng)等人的研究中，對(duì)烤煙煙葉香氣物質(zhì)生成相關(guān)的微生物進(jìn)行了分離與鑒定，獲得了降解β-胡蘿卜素生成香氣物質(zhì)的微生物，最終對(duì)分離得到的3個(gè)菌株鑒定為絲狀酵母屬菌株[29]。可見，在一定程度上，植物內(nèi)生真菌對(duì)烤煙香氣物質(zhì)是具有影響的。