殼聚糖對(duì)葡萄幼苗生理生態(tài)的影響

張皓然，范中菡，李紅春，夏 丹，陳慶華，李洪浩，徐雅欣，廖明安，林立金，胡容平

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部西南作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610066； 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，四川 成都 611130；3.眉山市彭山區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川 眉山 620860； 4.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 果蔬研究所，四川 成都 611130)

葡萄(VitisviniferaL.)在我國(guó)主要用于鮮食，也可制干、釀酒，栽培價(jià)值極高，深受各國(guó)消費(fèi)者喜愛(ài)[1]。據(jù)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局統(tǒng)計(jì)，葡萄2018年在我國(guó)種植面積達(dá)72.5萬(wàn)hm2，產(chǎn)量達(dá)1 366.7萬(wàn)t，居世界第1位[2]。盡管目前我國(guó)葡萄生產(chǎn)已取得巨大進(jìn)展，但葡萄品質(zhì)與世界頂級(jí)產(chǎn)品還存在一定差距，國(guó)際影響力和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力也有待提高[3]。

在葡萄生產(chǎn)栽培中多采用整形修剪、溫濕度調(diào)控、花期噴硼、水肥一體化技術(shù)及噴施植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等措施來(lái)提升果實(shí)品質(zhì)[4～6]。隨著科技的進(jìn)步和發(fā)展，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在葡萄生產(chǎn)應(yīng)用中也不斷增多，為了給中國(guó)葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展帶來(lái)更好的前景，可進(jìn)一步探究一種來(lái)源廣泛、成本低廉、安全高效的新型植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)產(chǎn)品。殼聚糖(CTS)又稱為脫乙酰幾丁質(zhì)，具有無(wú)毒無(wú)味、來(lái)源廣泛、環(huán)境相溶性好、易降解等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景十分廣闊[7]。周永國(guó)[8]在花生種子萌發(fā)試驗(yàn)中、El-Tantawy[9]和劉建民[10]在番茄種子試驗(yàn)中、El-Sawy[11]在大豆種子萌發(fā)等試驗(yàn)中均得出播種前殼聚糖浸種或包衣處理均有助于種子萌發(fā)的結(jié)論。陳云[12]、王佳木[13]、王燦等[14]人研究均表明，殼聚糖噴施處理可提高植株葉片葉綠素含量，使葉片光合系統(tǒng)維持較高的活性，從而提高植株的光合效率。張愛(ài)華等[15]研究表明，殼聚糖灌根配合葉面噴施處理香蕉，與未使用殼聚糖的施肥方法相比，香蕉可溶性固形物含量、果指長(zhǎng)度及果指質(zhì)量增加，產(chǎn)量顯著增加25.38%。鄧麗莉等[16]研究表明，柑橘果實(shí)采前不同時(shí)期3次噴施質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的殼寡糖，柑橘單果重和可溶性蛋白含量得到顯著提升，爛果率和落果率顯著降低，有利于果實(shí)品質(zhì)的保持。這些結(jié)果說(shuō)明，噴施殼聚糖對(duì)植物的生長(zhǎng)及生理會(huì)產(chǎn)生一定的影響，且與殼聚糖濃度有關(guān)。因此，本試驗(yàn)以葡萄幼苗為材料，分別對(duì)其噴施不同濃度殼聚糖，探討殼聚糖對(duì)葡萄幼苗生理生態(tài)的影響，篩選出有利于葡萄幼苗生長(zhǎng)的殼聚糖濃度，以期為殼聚糖在葡萄生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試葡萄幼苗品種為‘夏黑’，材料來(lái)源于四川省崇州市四川農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研發(fā)基地夏黑葡萄園(北緯30°33′46″，東經(jīng)103°39′36″)，試驗(yàn)使用一年生扦插苗。供試殼聚糖購(gòu)買于南京熙美諾生物科技有限公司，脫乙酰度為75%，分子量為75 kDa。 供試土壤為潮土，土壤pH值為7.71，有機(jī)質(zhì)含量為15.29 g/kg，全氮含量為0.85 g/kg，全磷含量為11.88 g/kg，全鉀含量為15.38 g/kg，堿解氮含量為87.99 mg/kg，速效磷含量為55.78 mg/kg，速效鉀含量為41.96 mg/kg，水溶性鈣含量為21.32 mg/kg，水溶性鎂含量為2.845 mg/kg，水溶性鉀含量為1.626 mg/kg，水溶性鈉含量為2.938 mg/kg，測(cè)定方法參照《土壤農(nóng)化分析》[17]。

1.2 試驗(yàn)方法

2018年葡萄冬季修剪時(shí)收集生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)一致、無(wú)病蟲(chóng)害的一年生葡萄枝條，沙藏保存；2019年2月將枝條取出，扦插于裝有珍珠巖的50孔高底穴盤中(育苗所用珍珠巖含水量2%～6%)，在晝夜21～23℃的人工氣候室中育苗。2月下旬，將供試土壤拍碎、混勻，過(guò)5 mm篩后，稱取3.0 kg裝入塑料盆(直徑×高：15 cm×18 cm)中，從底部托盤灌水，使盆中土壤完全濕潤(rùn)，備用。3月中下旬，從育好的葡萄扦插苗中選擇生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害且長(zhǎng)勢(shì)基本一致的一年生葡萄扦插苗(株高約15 cm，1個(gè)芽)，洗凈附著在根上的基質(zhì)，并移栽至塑料盆中。每盆移栽3株葡萄幼苗。葡萄幼苗置于光照培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)，光照培養(yǎng)室設(shè)置為：白天(24±0.5)℃，夜晚(10±0.5)℃，光照/暗各12 h，光照度為200 μmol/m2/s。待葡萄幼苗緩苗15 d后，對(duì)葡萄幼苗整株分別噴施濃度為0、1、2、4和6 g/L的殼聚糖溶液(配制方法：稱取12 g的水溶性殼聚糖，用清水定容至2 L，不斷攪拌2 h至溶液完全溶解透明，再稀釋制得濃度為分別1、2、4和6 g/L的殼聚糖溶液)，以噴施去離子水為對(duì)照(0 g/L)，共5個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，每盆葡萄為一個(gè)重復(fù)，共15盆葡萄幼苗。從2019年4月8日起，每隔7天噴1次，每次每個(gè)處理共噴施60 mL殼聚糖溶液，共噴施3次。每次噴施均在上午9:00-10:00進(jìn)行，噴施時(shí)將殼聚糖溶液均勻的噴布于葡萄幼苗正反葉面及莖桿上，以葉面濕潤(rùn)不滴液為度，且將不同濃度殼聚糖處理隔開(kāi)，防止不同濃度殼聚糖的交叉影響。將噴施殼聚糖溶液后的盆栽葡萄幼苗繼續(xù)置于光照培養(yǎng)室培養(yǎng)。葡萄幼苗的管理按標(biāo)準(zhǔn)盆栽管理方式進(jìn)行：各盆(間距約15 cm)隨機(jī)擺放并不定期隨機(jī)調(diào)換位置，根據(jù)葡萄幼苗的需水情況及時(shí)澆水，確保土壤濕潤(rùn)，同時(shí)注意雜草的清除和病蟲(chóng)害的防治。

1.3 項(xiàng)目測(cè)定

最后一次處理后10 d，于5月9日，將葡萄幼苗分為根系、莖桿和葉片3部分，分別用自來(lái)水洗凈，再用蒸餾水沖洗3次，于110℃殺青15 min，75℃烘干至恒重后，分別稱取干重。采集葡萄幼苗從上往下第三或第四片功能葉，取2.0 g于具塞試管中，加10 mL乙醇-丙酮混合液(體積比1∶>1)浸泡葉片，加蓋暗處24 h，至葉片完全變白，于663 nm、645 nm 和470 nm 處比色，分別計(jì)算葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量和類胡蘿卜素含量，方法參照熊慶娥[18]。采用LI-6400便攜式光合作用測(cè)定儀測(cè)定葡萄幼苗完全展開(kāi)第二葉的凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)、蒸騰速率(Tr)、葉溫下蒸氣壓虧缺值(Vpdl)。測(cè)定時(shí)間上午10∶>00～11∶>30，測(cè)定過(guò)程中光強(qiáng)約1 000 μmol/m2/s，空氣溫度(28±2)℃，空氣CO2濃度變化范圍(400±10) μmol/L。采集葡萄幼苗從上往下第3或第4片功能葉(0.2 g)，用pH 7.8磷酸緩沖液8 mL研磨、低溫離心，上清液即為酶粗提液。用氮藍(lán)四唑法、愈創(chuàng)木酚法、高錳酸鉀滴定法分別測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性，用G-250-牛血清蛋白顯色法測(cè)定可溶性蛋白含量，用硫代巴比妥酸(TBA)顯色法測(cè)定丙二醛(MDA)含量，磺基水楊酸比色法測(cè)定脯氨酸(Pro)含量，蒽酮-乙酸乙酯比色法測(cè)定可溶性糖含量，具體步驟參照熊慶娥《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》[19]。采集葡萄幼苗從上往下第3或第4片功能葉(0.1 g)，測(cè)定葉片電導(dǎo)率。測(cè)定方法為浸泡法，用DDS-307A型電導(dǎo)率儀測(cè)定浸提液電導(dǎo)率，并計(jì)算相對(duì)電導(dǎo)率[19]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0進(jìn)行方差分析(Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較)。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖對(duì)葡萄幼苗生物量的影響

由表1可知，噴施不同濃度殼聚糖后，葡萄幼苗各部分生物量均顯著高于對(duì)照，隨殼聚糖濃度的增加呈先增加后減少的趨勢(shì)，且皆在濃度為4 g/L時(shí)達(dá)最大值。由此可知，適當(dāng)濃度的殼聚糖噴施處理可顯著提高葡萄幼苗各部分生物量，且均以4 g/L處理最佳，濃度過(guò)高促生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)逐漸降低。

表1 不同濃度殼聚糖對(duì)葡萄幼苗生物量的影響

2.2 殼聚糖對(duì)葡萄幼苗光合色素含量的影響

由表2可知，葡萄幼苗葉片葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量均在殼聚糖濃度為1～4 g/L時(shí)隨濃度升高而增加，在濃度為4 g/L時(shí)達(dá)到最高值，葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素分別比對(duì)照增加了35.95%(P<0.05)、44.31%(P<0.05)、9.22%(P<0.05)。當(dāng)殼聚糖濃度上升至6 g/L時(shí)葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量又逐漸降低，甚至低于對(duì)照，但較對(duì)照差異均不顯著。經(jīng)不同濃度殼聚糖處理后，葡萄幼苗葉片類胡蘿卜素含量從高到低排序?yàn)椋? g/L≈2 g/L>6 g/L≈1 g/L>0 g/L，在濃度為4 g/L時(shí)較對(duì)照顯著增加了30.93%(P<0.05)。

表2 不同濃度殼聚糖對(duì)葡萄幼苗光合色素含量的影響

2.3 殼聚糖對(duì)葡萄幼苗光合特性的影響

分析表3可見(jiàn)，Pn大小總體表現(xiàn)為：4 g/L>2 g/L>6 g/L>1 g/L>0 g/L。Gs在殼聚糖濃度為4 g/L時(shí)較對(duì)照差異顯著，較對(duì)照增加了7.8%(P<0.05)，而濃度為1、2和6 g/L時(shí)與對(duì)照無(wú)顯著差異。殼聚糖濃度為2 g/L時(shí)Ci最高，殼聚糖濃度為1 g/L時(shí)Ci最低，較對(duì)照降低5.29%(P<0.05)。殼聚糖處理后葡萄幼苗葉片Tr總體呈現(xiàn)增高趨勢(shì)，各處理間差異不顯著，但對(duì)Vpdl有一定影響，Vpdl隨噴施殼聚糖濃度升高呈不斷降低的趨勢(shì)，在殼聚糖濃度為6 g/L時(shí)達(dá)最低，較對(duì)照降低了11.59%(P<0.05)。

表3 不同濃度殼聚糖對(duì)葡萄幼苗光合參數(shù)的影響

2.4 殼聚糖對(duì)葡萄幼苗抗氧化酶活性的影響

分析表4可見(jiàn)，噴施殼聚糖后的葡萄幼苗葉片SOD、POD和CAT活性均顯著增高，且均隨著殼聚糖濃度的增大活性不斷增強(qiáng)，在殼聚糖濃度為6 g/L時(shí)三種酶活性達(dá)到最大值，此濃度下SOD、POD和CAT酶活性分別是對(duì)照的1.80倍、2.17倍和3.20倍。在殼聚糖濃度為4 g/L時(shí)SOD、POD和CAT酶活性分別為對(duì)照的1.79倍、1.91倍和2.94倍。即使在較低濃度(1～2 g/L)下，三種抗氧化酶活性較對(duì)照仍有所增加且差異顯著。

表4 不同濃度褪黑素對(duì)葡萄幼苗抗氧化酶活性的影響

2.5 殼聚糖對(duì)葡萄幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和相對(duì)電導(dǎo)率的影響

由表5可知，不同濃度殼聚糖處理后‘夏黑’葡萄幼苗葉片各滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和相對(duì)電導(dǎo)率均在殼聚糖濃度為6 g/L 時(shí)達(dá)最大值，其中MDA較對(duì)照增加49.81%(P<0.05)，可溶性蛋白含量達(dá)最高值9.54 mg/g，相對(duì)電導(dǎo)率較對(duì)照增加了47.67%(P<0.05)。就Pro含量而言，在殼聚糖濃度為4 g/L時(shí)達(dá)到最高值，較對(duì)照增加了2.52 ug/g。

表5 不同濃度殼聚糖對(duì)葡萄幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和相對(duì)電導(dǎo)率的影響

2.6 殼聚糖對(duì)葡萄幼苗可溶性糖含量的影響

分析表6可知，未經(jīng)殼聚糖處理的葡萄幼苗各部分可溶性糖含量總體表現(xiàn)為：葉片>莖桿>根系。在1 g/L殼聚糖處理后，仍是葉片含量最高，根系含量最低。當(dāng)濃度達(dá)2 g/L時(shí)根系、莖桿可溶性糖含量顯著增高，葉片含量顯著降低17.76%(P<0.05)。濃度為4 g/L時(shí)根系和莖桿可溶性糖含量達(dá)最大值，分別較對(duì)照增加了31.93%(P<0.05)和30.42%(P<0.05)。

表6 不同濃度殼聚糖對(duì)葡萄幼苗可溶性糖含量的影響

3 討論

已有研究表明，殼聚糖能在短時(shí)間內(nèi)促進(jìn)植物毛細(xì)根的生長(zhǎng)，而發(fā)達(dá)的根系有利于植物更好的進(jìn)行水分和養(yǎng)分的吸收[19]。此外，殼聚糖也能夠通過(guò)增強(qiáng)植株的光合能力，提高植株的抗逆性，來(lái)保障植株進(jìn)行正常的生長(zhǎng)發(fā)育。在本試驗(yàn)中，殼聚糖(1、2、4和6 g/L)處理后葡萄幼苗各部分生物量均顯著高于對(duì)照，且隨濃度的升高，促進(jìn)效果呈先增加后降低的趨勢(shì)，在殼聚糖濃度為4 g/L時(shí)各部分及整株生物量均達(dá)最大值，繼續(xù)增大濃度至6 g/L時(shí)促進(jìn)效果開(kāi)始下降。由此說(shuō)明，低濃度的殼聚糖可促進(jìn)葡萄幼苗根系、莖桿和葉片的生長(zhǎng)，使植株生長(zhǎng)健壯，而高濃度殼聚糖促進(jìn)效果會(huì)降低，如若繼續(xù)增大噴施濃度可能會(huì)不利于植株生長(zhǎng)發(fā)育。這與楊峰[20]的殼聚糖對(duì)蘋果幼苗生長(zhǎng)的影響與濃度有關(guān)的研究結(jié)果較為相似：在一定范圍內(nèi)隨殼聚糖濃度增加其促進(jìn)效應(yīng)增強(qiáng)，當(dāng)殼聚糖濃達(dá)100 mg/L時(shí)，蘋果幼苗生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)最好，各項(xiàng)生理生長(zhǎng)指標(biāo)最佳，但濃度超過(guò)100 mg/L時(shí)殼聚糖作用效果不再增大。

光合作用是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素，而植物進(jìn)行光合作用的主要色素是葉綠素，其含量在一定程度上能反映植物同化物質(zhì)的能力，可以作為衡量光合能力的重要指標(biāo)[21]。光合參數(shù)則可以反映植株光合作用的強(qiáng)弱，如植物凈光合速率與光合有效輻射之間的定量關(guān)系是揭示植物光合生理過(guò)程對(duì)環(huán)境響應(yīng)的基礎(chǔ)[22]。在本試驗(yàn)中，經(jīng)不同濃度殼聚糖處理后葉片葉綠素含量和凈光合速率等光合參數(shù)較對(duì)照均顯著增加，且在濃度為4 g/L時(shí)達(dá)最大值。分析原因，可能是殼聚糖可以促進(jìn)葉綠素合成過(guò)程中的谷氨酸合成，并促使谷氨酸向隨后各物質(zhì)如原葉綠素酸的轉(zhuǎn)化保持相對(duì)協(xié)調(diào)平衡，從而使葉綠素代謝更為快速有效地進(jìn)行。也有可能是殼聚糖可增強(qiáng)碳、氮代謝酶的活性以及光合作用的明暗反應(yīng)，提高暗反應(yīng)固氮效率和防止光呼吸作用造成的CO2的損失，來(lái)達(dá)到調(diào)節(jié)初級(jí)光化學(xué)、刺激光合作用的目的。至于殼聚糖濃度達(dá)6 g/L時(shí)葉片葉綠素及部分光合參數(shù)降低，原因可能是殼聚糖濃度較大時(shí)，其粘度大、易成膜，噴在葉面上后，葉片被一層薄膜包圍，不僅影響其氣孔開(kāi)度，這層薄膜同時(shí)還具有反光作用，會(huì)降低葉片對(duì)光子的捕捉，影響其光合作用。

植物在正常生理?xiàng)l件下，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生O2-、H2O2和OH-等活性氧，但同時(shí)這些活性氧又會(huì)被植物自身清除，使植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡，這種平衡主要由植物體抗氧化酶系統(tǒng)調(diào)控[23]。SOD、POD 和CAT是植物體內(nèi)存在的一組有效清除細(xì)胞內(nèi)活性氧的酶系統(tǒng)，對(duì)保護(hù)細(xì)胞膜的完整性和防御活性氧對(duì)細(xì)胞膜的傷害具有重要作用[24]。在本試驗(yàn)中，噴施殼聚糖后葡萄幼苗的抗氧化酶活性顯著增高，說(shuō)明殼聚糖能使葡萄幼苗體內(nèi)活性氧處于動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)，并增強(qiáng)葡萄幼苗植株的內(nèi)部調(diào)節(jié)能力和對(duì)外界脅迫的抵抗力。有研究者得出相似結(jié)論，并分析其機(jī)理，主要是因?yàn)闅ぞ厶悄軌蛘T導(dǎo)SOD、POD 和 CAT 等抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而提高了抗氧化酶的活性[25～26]。

可溶性蛋白、脯氨酸和MDA是植物體內(nèi)的重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物的逆境脅迫中發(fā)揮著重要作用，在一定程度上可以反映植株內(nèi)部器官的抗逆性[27]。陳惠萍等[19]發(fā)現(xiàn)殼聚糖類物質(zhì)可提高作物中部分滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，李光玉等[28]人也發(fā)現(xiàn)水溶性殼聚糖可使植株幼苗葉片的可溶性總糖含量和超氧化物酶活性顯著增加，顯著提高植株的抗旱性。在本試驗(yàn)中，經(jīng)殼聚糖處理后葡萄幼苗可溶性蛋白、可溶性糖和可溶性固形物含量也均增加。殼聚糖濃度為6 g/L時(shí)MDA和脯氨酸含量增加，原因可能是殼聚糖濃度過(guò)高濃度殼聚糖阻礙了葡萄幼苗的光合作用和呼吸作用，植株受到脅迫，導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂，細(xì)胞膜透性增強(qiáng)，細(xì)胞保護(hù)系統(tǒng)發(fā)生改變，電解質(zhì)外滲增加，MDA含量和電導(dǎo)率增加。

4 結(jié)論

噴施殼聚糖能促進(jìn)葡萄幼苗生長(zhǎng)，同時(shí)在一定程度上也增強(qiáng)了植株抗逆性，使其在養(yǎng)分吸收和競(jìng)爭(zhēng)資源方面更具優(yōu)勢(shì)，濃度為4 g/L時(shí)效果最佳。