抗除草劑大豆GE-J12實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立

曹英芳 趙新 劉雙 李瑞環(huán) 劉娜 徐石勇 高芳瑞 馬卉蘭青闊 檀建新 王永

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，保定 071001；2.天津農(nóng)業(yè)科學(xué)院種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究所，天津 300381；3.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所，合肥 230041）

大豆是一種理想的優(yōu)質(zhì)植物蛋白食物［1］，是食品和飼料中蛋白質(zhì)的重要來源［2-3］，在我國(guó)膳食結(jié)構(gòu)［4］中占有重要地位。近年來，全球大豆的需求量呈上升趨勢(shì)［5］，預(yù)計(jì)未來大豆需求量將持續(xù)上升。我國(guó)轉(zhuǎn)基因大豆研發(fā)起步較晚，但其種植面積約占總轉(zhuǎn)基因作物種植面積的50%［6-7］，發(fā)展前景巨大。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的研究與產(chǎn)業(yè)化是農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)高速發(fā)展的重要組成部分［8］，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的飛速發(fā)展［9-10］，轉(zhuǎn)基因作物及其衍生食品的安全問題［11-12］受到人們的關(guān)注。我國(guó)建立了符合國(guó)情并與國(guó)際接軌的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全標(biāo)準(zhǔn)體系［13］，對(duì)轉(zhuǎn)基因?qū)嵤┒繕?biāo)識(shí)管理制度，為我國(guó)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理提供了有力的技術(shù)保障［14］，因此亟需建立快速、精準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因成分定量檢測(cè)方法。

目前國(guó)內(nèi)外轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)技術(shù)主要以蛋白質(zhì)和核酸檢測(cè)為主。蛋白質(zhì)在加工中易喪失抗原活性，所以蛋白質(zhì)檢測(cè)方法對(duì)于轉(zhuǎn)基因初產(chǎn)品較為適用。以核酸檢測(cè)為主的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)引物的設(shè)計(jì)要求較高，耗材昂貴；普通PCR技術(shù)只能定性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因食品；數(shù)字PCR技術(shù)耗材昂貴；基因芯片技術(shù)成本高、數(shù)據(jù)分析復(fù)雜；而實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)可用于轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)的定性或定量檢測(cè)，具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、污染少等優(yōu)點(diǎn)，且在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)上已得到廣泛應(yīng)用。熒光PCR技術(shù)是在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)［15］，通過采集到的熒光信號(hào)與拷貝數(shù)關(guān)系［16］，生成可視化的曲線，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)反應(yīng)過程［17］，實(shí)現(xiàn)了從定性到定量的飛躍［18］。本研究采用的TaqMan水解探針法，與普通PCR技術(shù)相比，該方法主要用作轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的定量分析，從而來確定基因轉(zhuǎn)錄水平，也可用作轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的定性分析［19］。根據(jù)轉(zhuǎn)化體和內(nèi)標(biāo)基因特異性序列設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和試樣同時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品模板拷貝數(shù)與Ct值之間的線性關(guān)系，分別繪制轉(zhuǎn)化體和內(nèi)標(biāo)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過轉(zhuǎn)化體和內(nèi)標(biāo)基因拷貝數(shù)比值確定轉(zhuǎn)基因含量。

GE-J12是中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研發(fā)的轉(zhuǎn)G2-EPSPS基因和GAT基因的抗除草劑轉(zhuǎn)基因大豆新品系，對(duì)除草劑草甘膦具有較高的耐受性。目前，國(guó)內(nèi)外還未見到抗除草劑大豆GE-J12的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的定量檢測(cè)。本研究根據(jù)抗除草劑大豆GE-J12品系外源基因插入位點(diǎn)5'端轉(zhuǎn)化體特異性序列設(shè)計(jì)引物和探針，經(jīng)特異性、準(zhǔn)確度、精密度和重復(fù)性測(cè)試，確定方法的檢測(cè)極限和定量極限，以期建立轉(zhuǎn)G2-EPSPS基因和GAT基因的抗除草劑大豆GE-J12品系的定量檢測(cè)方法，為農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)和產(chǎn)權(quán)保護(hù)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)所用轉(zhuǎn)G2-EPSPS基因和GAT基因抗除草劑大豆GE-J12及其受體材料Jack由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供；其他轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因油菜、轉(zhuǎn)基因水稻、轉(zhuǎn)基因棉花、其他非轉(zhuǎn)基因大豆混樣均購置于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心。

1.1.2 主要試劑 TIANGEN高效植物基因組DNA提取試劑盒，購自天根生化科技有限公司；TaKaRa 2×Premix Ex Taq（probe q PCR），購自TaKaRa；其他試劑（分析純），購自TaKaRa。

1.1.3 儀器設(shè)備 BIO-RAD CFX96實(shí)時(shí)熒光PCR儀，購自BIO-RAD；ND-1000紫外可見分光光度儀，購自基因有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 隨機(jī)取GE-J12和受體Jack的種子各100粒，研磨混勻，取100-200 mg，應(yīng)用TIANGEN高效植物基因組DNA提取試劑盒提取DNA。獲得的基因組DNA，經(jīng)ND-1000紫外可見分光光度儀，檢測(cè)DNA質(zhì)量，所有基因組DNA的OD260/OD280在1.8-2.0之間，濃度在50 ng/μL-100 ng/μL 之間。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)抗除草劑大豆GE-J12品系外源基因插入位點(diǎn)5'端轉(zhuǎn)化體特異性序列設(shè)計(jì)引物和探針，具體信息見表1，引物和探針均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物和探針Table 1 Primers and probes used in this study

1.2.3 特異性檢驗(yàn) 分別以1.1.1中材料提取并稀釋到25 ng/μL的DNA為模板，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR常用反應(yīng)體系和程序，對(duì)設(shè)計(jì)的引物探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3個(gè)平行，測(cè)試引物探針特異性。

1.2.4 引物濃度和體系反應(yīng)程序優(yōu)化 設(shè)置52、54、56、58、60和 62℃共 6個(gè)退火溫度和 0.10、0.20、0.25、0.30、0.40和0.50 μmol/L共6個(gè)引物濃度，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，選擇擴(kuò)增曲線峰型成“S”型且擴(kuò)增效率較高的曲線，確定退火溫度和引物濃度。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建 將提取的轉(zhuǎn)基因大豆GE-J12基因組DNA（25 ng/μL）稀釋至20%、4%、0.8%、0.16%、0.032%、0.006 4%進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用7個(gè)濃度梯度的DNA（含100%）為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因大豆GE-J12特異性序列標(biāo)準(zhǔn)曲線，以實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆GE-J12的相對(duì)定量分析。

1.2.6 準(zhǔn)確度、精確度和重復(fù)性測(cè)試 GE-J12大豆和其受體材料粉末按照5%、3%、1%的質(zhì)量百分比進(jìn)行混合，采用 1.2.4中建立的優(yōu)化后的反應(yīng)體系和程序進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。每次設(shè)3個(gè)平行，通過多次測(cè)試的測(cè)量值與真實(shí)值之間符合程度和測(cè)量值之間的符合程度，評(píng)價(jià)測(cè)試方法的準(zhǔn)確度和精確度。

1.2.7 檢測(cè)極限和定量極限測(cè)試 根據(jù)農(nóng)業(yè)部2259號(hào)公告-5-2015的規(guī)定，轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法的檢測(cè)極限（LOD）應(yīng)不高于目標(biāo)濃度的1/20，定量極限（LOQ）應(yīng)不高于目標(biāo)濃度的1/10。根據(jù)1.2.5中的擴(kuò)增結(jié)果數(shù)據(jù)分析得出LOD和LOQ。

2 結(jié)果

2.1 特異性測(cè)試

只有以GE-J12 DNA為模板時(shí)，出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，以大豆受體Jack、其他轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因油菜、轉(zhuǎn)基因水稻、轉(zhuǎn)基因棉花和其他非轉(zhuǎn)基因大豆混樣為模板時(shí)，均未出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，如圖1，表明本檢測(cè)方法的特異性良好。

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Specific detection results via real-time fluorescence quantitative PCR

2.2 引物濃度和體系反應(yīng)程序優(yōu)化

退火溫度在58℃條件下，擴(kuò)增曲線呈“S”型，熒光信號(hào)值最高，確定退火溫度為58℃，如圖2。圖中3號(hào)和4號(hào)的擴(kuò)增曲線Ct＜36，根據(jù)經(jīng)濟(jì)原則選擇3號(hào)，確定引物和探針終濃度分別為0.5 μmol/L和 0.25 μmol/L。

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系優(yōu)化結(jié)果Fig.2 Optimization results of real-time fluorescent quantitative PCR system

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建及線性度

本方法在模板含量為0.006 4%-100%范圍內(nèi)線性度為0.992，擴(kuò)增效率為101.5%，如圖3。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立Fig.3 Standard curve establishment

2.4 準(zhǔn)確度、精確度和重復(fù)性測(cè)試

通過轉(zhuǎn)基因大豆GE-J12轉(zhuǎn)化體特異性序列和內(nèi)源基因Lectin的拷貝數(shù)的lg值的比值，對(duì)5%、3%和1%樣品進(jìn)行定值，測(cè)試結(jié)果與真實(shí)值平均偏差為2.87%、6.87%、16.67%，均≤25%，符合定量方法建立要求，具體結(jié)果如表2。

表2 樣品定值結(jié)果Table 2 Results of sample setting

2.5 定量限和檢出限測(cè)試

以模板含量為0.032%和0.006 4%擴(kuò)增時(shí)，均有典型擴(kuò)增曲線，其中模板含量為0.006 4%時(shí)，18次擴(kuò)增有14次出現(xiàn)擴(kuò)增曲線。所以采用0.032%模板含量，進(jìn)行了60次重復(fù)試驗(yàn)，Ct值的平均值為34.95，最大值為35.50，最小值為34.40，確定本檢測(cè)方法的檢出限LOD為0.032%，如圖4。

圖4 轉(zhuǎn)基因大豆GE-J12實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢出限測(cè)試Fig.4 Detection limit via real-time fluorescence quantitative PCR for genetically modified soybean GE-J12

分別以0.16%和0.032%的DNA為模板，進(jìn)行了3次重復(fù)擴(kuò)增試驗(yàn)，SD值分別為0.14-0.20和0.37-0.67，RSD值分別為0.43%-0.59%和1.04%-1.89%，隨著模板濃度的降低，擴(kuò)增結(jié)果Ct值的SD和RSD增大。確定本檢測(cè)方法的定量限LOQ為0.16%，具體結(jié)果如表3。

表3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR靈敏度及可重復(fù)性測(cè)試Table 3 Sensitivity and repeatability test of real-time fluorescence quantitative PCR

3 討論

一般通過檢測(cè)外源基因，判斷其是否為轉(zhuǎn)基因食品。目前，普通PCR技術(shù)可用于轉(zhuǎn)基因定性檢測(cè)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)可用于轉(zhuǎn)基因定量及定性檢測(cè)，數(shù)字PCR技術(shù)可用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的定量檢測(cè)。李瑞環(huán)等［20］建立了轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆ZH10-6多重PCR檢測(cè)方法，該方法易造成交叉污染、假陽性，并且存在靈敏度不高、操作繁瑣和特異性低、耗時(shí)耗資、不能定量檢測(cè)等缺點(diǎn)。冀志庚等［21］采用SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆中外源基因拷貝數(shù)，該方法不具有特異性，反應(yīng)中的引物二聚體或非特異性擴(kuò)增也會(huì)發(fā)生熒光。邢珍娟等［22］建立了二重?zé)晒釶CR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因成分方法用于轉(zhuǎn)基因成分篩查；汪小福等［23］建立的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米進(jìn)行檢測(cè)，均為基于TaqMan探針法的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，該技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高，操作簡(jiǎn)便，能夠克服普通PCR的缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因成分的定量分析。

通過對(duì)多重PCR技術(shù)、SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)和TaqMan探針法的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)比較發(fā)現(xiàn)，最后一種方法對(duì)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)更適合，且在轉(zhuǎn)基因定量檢測(cè)中應(yīng)用廣泛。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)和數(shù)字PCR方法是目前被國(guó)際認(rèn)可的主要轉(zhuǎn)基因成分定量檢測(cè)方法。Ko?ir等［24］對(duì)大豆內(nèi)標(biāo)基因和外源基因建立數(shù)字PCR技術(shù)進(jìn)行單重和雙重方法。本研究后續(xù)針對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆GE-J12將建立基于數(shù)字PCR技術(shù)的絕對(duì)定量，此技術(shù)可實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量，具有更高的靈敏度，無需標(biāo)準(zhǔn)品，不需要通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線來定量，操作更加簡(jiǎn)便，應(yīng)用前景廣泛。

轉(zhuǎn)基因大豆GE-J12是中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研發(fā)的轉(zhuǎn)基因大豆新品系。當(dāng)前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)還未見到抗除草劑大豆GE-J12的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的定量檢測(cè)。本研究采用的基于TaqMan探針法的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆GE-J12進(jìn)行定量檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果均符合2259號(hào)公告-5-2015的規(guī)定。該方法可用于轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆GE-J12轉(zhuǎn)化體特異性序列含量的精準(zhǔn)定量，為大豆GE-J12的檢測(cè)提供了新方法；為該轉(zhuǎn)基因大豆品系商品化后，轉(zhuǎn)化體的安全評(píng)價(jià)、行政監(jiān)管和知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)提供重要的技術(shù)支撐。

4 結(jié)論

本研究建立了基于TaqMan法的轉(zhuǎn)基因大豆GEJ12實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，確定了上、下游引物和探針的濃度分別為0.5 μmol/L、0.5 μmol/L和0.25 μmol/L，退火溫度為58℃，在RSD小于25%的情況下檢出限為0.032%，定量限為0.16%，線性度為0.992。