基于水稻原生質(zhì)體的染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)優(yōu)化及應(yīng)用

石佳 朱秀梅 薛夢雨 余超 魏一鳴 楊鳳環(huán) 陳華民

（中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所 植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193）

植物轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育和響應(yīng)外界環(huán)境刺激等方面發(fā)揮著重要的作用［1-2］，轉(zhuǎn)錄因子通過與DNA啟動子相結(jié)合進而調(diào)控下游靶基因的表達，從而發(fā)揮各種重要的生物學調(diào)控功能。因此，挖掘、驗證轉(zhuǎn)錄因子的靶基因是解析其生物學功能機制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究蛋白與DNA互作的常用方法有凝膠遷移阻滯試驗［3］、酵母單雜交系統(tǒng)［4］和熒光素酶報告系統(tǒng)［5］，這些方法都屬于體外方法，且更適用于具體蛋白和DNA作用的驗證，并不適合用于大規(guī)模篩選未知DNA序列。建立在蛋白質(zhì)和DNA交聯(lián)基礎(chǔ)上的染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（chromatin immunoprecipitation，ChIP）［6-7］則是探索體內(nèi)蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物結(jié)合情況的重要技術(shù)手段。其原理是在活細胞狀態(tài)下用甲醛交聯(lián)固定蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，然后將染色質(zhì)隨機破碎為一定長度范圍內(nèi)的小片段，通過免疫學方法沉淀此復(fù)合體，特異性的富集與目的蛋白結(jié)合的DNA片段，繼而通過對目的片段進行純化與檢測，獲得與蛋白質(zhì)相互作用的DNA信息及調(diào)控基因信息［8］。近年來，隨著此技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，尤其是與DNA芯片技術(shù)（ChIP-chip）和高通量測序（ChIP-seq）相結(jié)合，可以一次性得到目的蛋白在整個基因組上的結(jié)合分布，并得到目的蛋白的精確結(jié)合位點以及結(jié)合基序等信息［9］，因此染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)逐漸成為分析表觀修飾和挖掘特定轉(zhuǎn)錄因子靶基因的強有力手段。

然而，ChIP試驗操作繁瑣，對目的DNA片段的富集高度依賴特異性抗體，容易出現(xiàn)假陰性/假陽性，重復(fù)性差等缺點，且在植物相關(guān)研究中，通常是利用過表達目的基因的轉(zhuǎn)基因植株作為研究材料，但構(gòu)建轉(zhuǎn)基因材料耗時耗力，且有些蛋白在植物體內(nèi)積累豐度較低，這些都對實驗的順利開展和圓滿完成帶來了不利因素。

植物轉(zhuǎn)錄因子NF-YA（nuclear factor Y subunit A，NF-YA核因子A亞基）與NF-YB和NF-YC共同組成異源三聚轉(zhuǎn)錄復(fù)合體NF-Y（又名血紅素激活蛋白，HAP；CCAAT結(jié)合因子，CBF）。NF-Y復(fù)合體廣泛存在于真核生物中，通過與CCAAT-box特異結(jié)合調(diào)控目的基因的表達。CCAAT-box是存在于25%以上的真核生物基因啟動子的一種順式作用元件，調(diào)節(jié)啟動子的活性［10］。NF-YA主要通過脫落酸（ABA）途徑調(diào)控植物對非生物和生物脅迫的響應(yīng)［11-13］。研究表明NF-YA基因在調(diào)節(jié)植物耐旱性［14］、氮素吸收利用［15］、根瘤發(fā)育［16］、脫落酸（ABA）響應(yīng)［17］和開花時間［18］等方面具有重要功能。

本研究在水稻原生質(zhì)瞬時表達系統(tǒng)中，通過對甲醛交聯(lián)固定和免疫沉淀核酸的超聲波破碎等影響該試驗成功的關(guān)鍵因素進行優(yōu)化，建立了基于水稻原生質(zhì)體的染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（chromatin immunoprecipitation system based on rice protoplasts，ChIP-RP），并以水稻轉(zhuǎn)錄因子OsNF-YA4為例，通過ChIP-RP技術(shù)完成了OsNF-YA4調(diào)控靶基因的富集驗證。此技術(shù)體系一方面可以最大限度地縮短樣品準備時間，另一方面水稻原生質(zhì)體表達系統(tǒng)更接近于水稻體內(nèi)環(huán)境，目的蛋白表達容易，干擾少，目的蛋白所占比重更大，不必再進行細胞核蛋白的分離，可以有效提高ChIP效果。本研究利用優(yōu)化后的水稻原生質(zhì)體染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)驗證了轉(zhuǎn)錄因子OsNF-YAs對下游基因的富集作用，表明ChIPRP是一個可以用于水稻轉(zhuǎn)錄因子靶基因挖掘的技術(shù)體系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與耗材 構(gòu)建載體所需Primer Star MAX、rTaq mix等PCR試劑購于TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶、T4連接酶購于北京NEB公司。大腸桿菌Trans-T1購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。鼠源抗Myc標簽單克隆ChIP級別抗體購自Abcam（英國）。Magna ChIPTMProtein A+G Magnetic Beads 購自德國merck millipore 公司。MinElute PCR Purification Kit購自德國QIAGEN公司。超聲破碎儀XC96-11N購自南京新辰生物科技有限公司。染色質(zhì)免疫共沉淀試驗所需的Lysis buffer、RIPA ChIP buffer、RIPA buffer、LiCl wash buffer、TE buffer均參考 Para 等［19］描述的方法進行配制。

1.1.2 材料 水稻品種日本晴（Oryza sativa L.japonica.cv.Nipponbare）為實驗室所保存，所用載體質(zhì)粒pRTV-Ubi-3Myc由中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所寧約瑟［20］課題組饋贈。

1.2 方法

1.2.1 水稻的培養(yǎng) 挑選顆粒飽滿的水稻種子置于20 mL錐形瓶，加入75%酒精，搖晃1 min，倒掉酒精；加入40%次氯酸鈉，搖晃30 min消毒，倒掉次氯酸鈉；用滅菌蒸餾水清洗3-5次，將吸干表面水分的種子平鋪于1/2 MS（Murashige & Skoog basal medium with vitamins 2.21 g/L，蔗糖20 g/L，植物凝膠0.3 g/L）培養(yǎng)基，置于28℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)10 d左右。

1.2.2 融合Myc標簽的NF-YA4表達載體的構(gòu)建 以水稻cDNA為模板，采用引物NF-YA4-F：5'-ATAGAGCTCATGGAGTCGAGGCCGGGGGG-3'；NFYA4-R：5'- TATGGTACCTGTTTCCTTCTGTAGGAGC TG-3'擴增OsNF-YA4基因，經(jīng)過SacI和KpnI雙酶切后，將其插入經(jīng)過同樣雙酶切的pRTV-Ubi-3Myc載體，獲得pRTV-NF-YA4-3Myc重組載體。

1.2.3 原生質(zhì)體的制備與轉(zhuǎn)化［21-22］按照原生質(zhì)體制備方法分離提取4×107細胞，用40% PEG4000（40%（W/V）PEG4000，0.1 mol/L CaCl2，5 mmol/L MES，0.2 mol/L D-mannitol）介導(dǎo)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。

1.2.4 原生質(zhì)體瞬時表達OsNF-YA4蛋白水平的檢測 1 000×g離心收集原生質(zhì)體，沉淀用100 μL Tris-HCl buffer（50 mmol/L Tris-HCl pH7.5，150 mmol/L NaCl，0.1% Triton X-100，4 mol/L Urea，1 mmol/L PMSF） 懸 浮，4℃，13 300 r/min離 心 10 min，取上清加入5 × Loading buffer煮沸10 min。Western blot檢測在不同時間點NF-YA4蛋白的積累水平［14］。一抗采用抗Myc標簽的單克隆抗體（Gene Script）（稀釋度為1∶5 000），二抗采用山羊抗小鼠IgG抗體（華興博創(chuàng)）（稀釋度為1∶10 000）。

1.2.5 甲醛對原生質(zhì)體狀態(tài)的影響 設(shè)置0.1%、0.3%、0.7%、1%等不同濃度甲醛分別處理原生質(zhì)體細胞10 min，125 mmol/L甘氨酸處理5 min終止交聯(lián)，通過顯微鏡觀察細胞狀態(tài)，利用血球計數(shù)板統(tǒng)計64個視野下的細胞數(shù)目，計算處理后細胞數(shù)目占初始數(shù)目的百分比，數(shù)據(jù)為3次生物學重復(fù)所得。

1.2.6 DNA超聲破碎時間的篩選 取甲醛固定好的原生質(zhì)體細胞，加入1 mL Lysis buffer，渦旋混勻，置于2 mL離心管中進行超聲破碎。超聲破碎儀功率39%，超聲時間設(shè)置為3 s，超聲間隔時間設(shè)置為9.9 s，超聲總時長分別設(shè)置為5 min、10 min、15 min、20 min、30 min。超聲破碎后4℃，13 300 r/min離心10 min，取上清65℃過夜解交聯(lián)并消化蛋白，酒精沉淀DNA，2% DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段化效果。

1.2.7 免疫共沉淀

1.2.7.1 染色質(zhì)樣品的預(yù)處理 將超聲破碎后的染色質(zhì)樣品溶于5 mL RIPA ChIP buffer，4℃，13 300 r/min離心10 min，取上清于新的10 mL離心管。吸取500 μL染色質(zhì)作為10% input對照，凍于- 20℃。在剩余染色質(zhì)中加入20 μL protein A/G beads，4℃低溫混合處理樣品1 h，去除可與protein A/G beads非特異性結(jié)合的蛋白。

1.2.7.2 抗原抗體的特異性結(jié)合 將預(yù)處理的樣品等分為兩份，一份加與10 μg Myc標簽抗體結(jié)合的磁珠，標記為ChIPs+，一份加不與抗體結(jié)合的磁珠標記為ChIPs-，兩組處理同時置于4℃低溫，緩慢混合孵育處理6-8 h以形成磁珠-抗體-抗原蛋白-目的DNA免疫復(fù)合物。

1.2.7.3 磁珠-抗體-抗原蛋白-目的DNA免疫復(fù)合物的清洗 為減少非特異性結(jié)合，磁力架分離磁珠和染色質(zhì)，依序用以下每種溶液清洗兩次，一次快洗，一次慢洗（4℃低溫洗5 min）。清洗溶液有：RIPA buffer，LiCl wash buffer，TE buffer。第一次 TE buffer后，ChIPs+樣品與ChIPs-樣品分別取200 μL，利用Western blot檢測免疫沉淀效果。

1.2.7.4 解交聯(lián)與DNA純化［23］磁力架捕獲磁珠，并除凈 TE buffer。加入 250 μL Elution buffer，65℃孵育15 min，用來洗脫抗體和染色質(zhì)的復(fù)合物。磁力架分離把上清轉(zhuǎn)移至一個新的離心管。重復(fù)洗脫步驟，加入新的250 μL Elution buffer，65℃孵育30 min。把兩次洗脫液混合在一起，總體積為500 μL。每管加入 25 μL 4 mol/L NaCl，10 μL RNase A，37℃孵育2 h然后65℃孵育4 h以上至過夜以解交聯(lián)。

在離心管中加入 10 μL 0.5 mol/L EDTA，20 μL 1 mol/L Tris-HCl pH6.5，1 μL proteinase K（20 mg/mL），45℃孵育1.5 h以降解蛋白。利用QIAGEN公司的MinElute PCR Purification Kit回收所富集目的DNA片段，Nano Drop ND-1000儀定量檢測DNA濃度后-20℃保存。

1.2.8 相關(guān)基因啟動子CCAAT序列預(yù)測及富集DNA的特異性分析 Plant CARE軟件（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）［24］預(yù) 測NRTs相關(guān)基因啟動子序列中CCAAT序列的數(shù)目及位置（表1）。以 OsNRT1.1、OsNRT2.1、OsNRT2.2、OsNAR2.1為研究對象設(shè)計引物（表2），以染色質(zhì)免疫沉淀純化后的DNA（ChIPs+，ChIPs-，input）為模板，利用RT-qPCR檢測染色質(zhì)免疫共沉淀所富集DNA的特異性。以input為內(nèi)參，按照2-ΔΔCt法計算，其中 ΔΔCt =（CtChIPs+- Ctinput）-（CtChIPs-- Ctinput），Ct為熒光閾值。

表1 NRTs基因啟動子區(qū)域調(diào)控元件的預(yù)測Table 1 Prediction of regulatory elements in the promoter region of NRTs genes

表2 RT-qPCR驗證所需的引物序列Table 2 Required primer sequences for RT-qPCR validation

2 結(jié)果

2.1 OsNF-YA4瞬時表達載體的構(gòu)建

利用SacI和KpnI 同時酶切OsNF-YA4基因和pRTV-Ubi-3Myc，回收連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌Trans-T1，構(gòu)建pRTV-NF-YA4-3Myc融合表達載體（圖1），挑選陽性菌落克隆送華大基因測序，測序結(jié)果表明，OsNF-YA4基因的重組表達載體pRTV-NFYA4-3Myc無堿基突變和移碼，說明pRTV-NF-YA4-3Myc載體構(gòu)建成功。

圖1 pRTV-NF-YA4-3Myc載體示意圖Fig.1 Schematic diagram of pRTV-NF-YA4-3Myc vector

2.2 OsNF-YA4蛋白積累水平的變化

染色質(zhì)免疫沉淀效果與目的蛋白的表達量有著緊密的聯(lián)系。水稻原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化是一個瞬時表達的過程，根據(jù)孵育時間的不同，蛋白表達水平會有所變化，為確定OsNF-YA4融合蛋白在水稻原生質(zhì)體中積累水平較高的時間，分別在轉(zhuǎn)化后 12 h、18 h、24 h、36 h，1 000 ×g離心收集細胞，提取蛋白，采用anti-Myc單抗進行Western blot檢測OsNFYA4蛋白表達量。結(jié)果如圖2所示，轉(zhuǎn)化后12 h時，OsNF-YA4蛋白積累最多，隨著時間延長蛋白積累水平呈下降趨勢，轉(zhuǎn)化后36 h，蛋白水平明顯降低。因此，確定在水稻原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后12 h進行甲醛固定處理。

圖2 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后OsNF-YA4蛋白表達水平的檢測Fig.2 Expressions detection of OsNF-YA4 protein after protoplast transformed

2.3 甲醛交聯(lián)濃度的篩選

甲醛處理可以固定蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合，是染色質(zhì)免疫沉淀至關(guān)重要的一步。通常采用1%甲醛真空壓滲來處理植物材料，鑒于原生質(zhì)體本身比較脆弱易破，首先采用不同濃度甲醛處理原生質(zhì)體細胞，顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)。結(jié)果表明不同的甲醛濃度都對原生質(zhì)體的狀態(tài)造成一定的影響，隨著甲醛濃度的升高，原生質(zhì)體細胞活性也隨之降低（表3）。0.1%甲醛處理后，原生質(zhì)體的細胞活性為93%，影響相對輕微；1%甲醛濃度處理后，原生質(zhì)體的細胞活性下降為48%，約一半細胞已破碎，難以保證正常的細胞生理功能。綜合甲醛處理的重要性和原生質(zhì)體的細胞活性，選取0.7%甲醛來處理水稻原生質(zhì)體細胞，交聯(lián)固定10 min。

表3 不同甲醛終濃度對原生質(zhì)體細胞活性的影響Table 3 Effects of different final concentrations of formaldehyde on protoplasmic cell activity

2.4 染色質(zhì)超聲波破碎時間的篩選

染色質(zhì)片段大小在很大程度上影響了ChIP的實驗效果，通常在100 bp-500 bp之間為好，因此需要利用超聲破碎儀對染色質(zhì)進行片段化處理。通過設(shè)置不同的超聲時長破碎染色質(zhì)，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段化效果。結(jié)果表明隨著超聲時長的增加，DNA片段逐漸變?。▓D3-A）。當超聲時長為5 min時，部分DNA片段被打斷至1 000 bp左右，片段較大；當超聲時長為15 min和20 min時，DNA片段長度集中在100 bp-500 bp之間，符合后續(xù)實驗要求；當超聲時長為30 min時，大部分DNA片段已被破碎至200 bp左右，表明超聲過度（圖3-A）。在相同條件下，超聲時間過長，蛋白容易降解，所以確定超聲時長為15 min。超聲15 min后，將染色質(zhì)免疫共沉淀中的input樣品解交聯(lián)后，用2%瓊脂糖凝膠檢測，結(jié)果表明，DNA片段在100 bp-500 bp之間，主帶在250 bp左右，符合后續(xù)高通量測序要求（圖3-B）。

圖3 OsNF-YA4蛋白ChIPs富集DNA的超聲破碎時間優(yōu)化（A）和效果檢測（B）Fig.3 Optimization of ultrasonic fragmentation time on OsNF-YA4 ChIPs-enriched DNA（A）and validation of the fragmentation（B）

2.5 染色質(zhì)免疫共沉淀效果的檢測和富集DNA特異性的分析

ChIPs+樣品與ChIPs-樣品在第一次TE Buffer清洗后，吸取總樣品的20%，加5×Loading buffer，Western blot檢測免疫沉淀效果，結(jié)果如圖4-A所示，利用anti-Myc單抗可以檢測到ChIPs+樣品中NF-YA4融合蛋白的條帶，而在ChIPs-樣品中未檢測出條帶，說明免疫沉淀效果較好。ChIPs+樣品、ChIPs-樣品和input樣品經(jīng)過解交聯(lián)，消化蛋白質(zhì)，獲得已純化的DNA樣品。

圖4 染色質(zhì)免疫共沉淀效果的檢測（A）和所富集DNA的特異性分析（B）Fig.4 Detection of the effect of chromosome immunoprecipitation（A）and specificity analysis of enriched DNA（B）

生物信息學分析發(fā)現(xiàn)NRT 家族成員啟動子區(qū)域分布著若干 OsNF-YAs 結(jié)合的CCAAT 序列（表1），推測轉(zhuǎn)錄因子 OsNF-YAs 可通過與 NRTs基因啟動子區(qū)域的 CCAAT結(jié)合，從而調(diào)控 NRT 家族成員的表達。所以以ChIP富集DNA為模板，OsNRT1.1、OsNRT2.1、OsNRT2.2、OsNAR2.1基因啟動子中含有CCAAT序列的片段為研究對象，OsNAR2.1基因啟動子中不含CCAAT序列的片段為陰性對照，RT-qPCR檢測染色質(zhì)免疫共沉淀所富集DNA特異性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ChIPs+樣品相對ChIPs-樣品，基因OsNRT1.1、OsNRT2.1、OsNRT2.2、OsNAR2.1 啟動子中含有CCAAT序列的片段富集倍數(shù)從5倍到50倍不等，OsNAR2.1基因啟動子中不含CCAAT序列的片段無明顯富集，說明成功富集到轉(zhuǎn)錄因子NF-YA4特異性結(jié)合的DNA片段。

3 討論

蛋白質(zhì)與DNA互作相關(guān)研究一直是表觀遺傳學領(lǐng)域的研究熱點，ChIP作為研究蛋白質(zhì)與DNA互作的傳統(tǒng)手段，在動植物中得到了廣泛應(yīng)用。然而，高特異性的蛋白抗體和高豐度的蛋白積累是植物材料ChIP的主要限制因素。構(gòu)建穩(wěn)定遺傳的過表達植物材料可以在很大程度上突破上述問題對ChIP技術(shù)的限制，然而，構(gòu)建穩(wěn)定遺傳材料耗時耗力。利用植物材料進行ChIP時，通常還要提取細胞核蛋白以避免植物中過多雜蛋白的干擾。此外，植物材料的次生代謝物和細胞壁會干擾甲醛交聯(lián)效果，甲醛交聯(lián)對ChIP結(jié)果的影響較大。甲醛處理的時間太短或甲醛濃度過低，會導(dǎo)致蛋白質(zhì)和DNA形成的復(fù)合物交聯(lián)不牢固，很容易在超聲時分離；甲醛固定的時間太長，會使目的蛋白的抗原決定簇被屏蔽，不能和抗體有效結(jié)合，引起免疫沉淀效果降低［25］；甲醛濃度過高，葉綠素不易降解，導(dǎo)致與葉綠體連在一起的細胞核中的染色質(zhì)難以純化［26］。植物細胞壁的存在阻礙了甲醛的穿透，不易利用ChIP-seq識別植物轉(zhuǎn)錄因子的靶基因結(jié)合位點，當交聯(lián)劑到達完整植物細胞的細胞核時，瞬時的轉(zhuǎn)錄因子相互作用可能已經(jīng)停止［19］。

為規(guī)避以上不利因素，本文建立了基于水稻原生質(zhì)體瞬時表達系統(tǒng)的染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（chromatin immunoprecipitation based on rice protoplast transient expression system，ChIP-RP）。通過不同濃度梯度甲醛對原生質(zhì)體細胞活性的影響，發(fā)現(xiàn)0.7%甲醛終濃度對細胞活性傷害相對較小，也可以滿足DNA與蛋白質(zhì)的交聯(lián)效果。原生質(zhì)體提取過程中剔除了植物細胞壁和絕大多數(shù)干擾蛋白，可以將交聯(lián)的原生質(zhì)體直接震蕩破碎，超聲處理，避免了細胞核蛋白的提取步驟。染色質(zhì)免疫共沉淀過程中，超聲破碎細胞染色質(zhì)的程度對試驗成功至關(guān)重要。超聲不徹底會引起染色質(zhì)蛋白復(fù)合物過大，抗體不易富集，影響后續(xù)試驗；超聲過度會引起蛋白降解或蛋白抗原表位被破壞，影響后續(xù)免疫沉淀過程［27］。一般認為DNA打斷片段在100 bp-500 bp之間，主帶在250 bp左右符合后期的高通量測序建庫要求。我們采用不同時長超聲破碎，結(jié)果表明超聲功率39%，3 s運行，9.9 s間歇，超聲15 min是水稻原生質(zhì)體染色質(zhì)破碎最適條件。

OsNF-YAs作為轉(zhuǎn)錄因子可以與CCAAT序列特異結(jié)合，從而通過調(diào)控NRT家族基因的表達而發(fā)揮其生物學功能。我們以O(shè)sNF-YA4為目標蛋白，通過ChIP-RP技術(shù)免疫沉淀了OsNF-YA4結(jié)合的DNA序列，qRT-PCR檢測說明含CCAAT序列的片段得到了明顯的富集，其中OsNRT2.1啟動子片段富集高達50多倍，而不含CCAAT的對照片段則沒有富集，表明OsNF-YA4富集到的DNA具有明確的特異性。

4 結(jié)論

本研究通過對水稻原生質(zhì)體瞬時表達、甲醛交聯(lián)濃度、超聲破碎條件等關(guān)鍵條件的優(yōu)化，建立了基于水稻原生質(zhì)體的染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)體系（ChIP-RP），并通過水稻轉(zhuǎn)錄因子OsNF-YA4免疫沉淀富集到DNA的特異性驗證了ChIP-RP的適用性。本技術(shù)體系可用于快速篩選和挖掘水稻轉(zhuǎn)錄因子直接調(diào)控的靶基因，為解析水稻轉(zhuǎn)錄因子的分子機制提供了極大的便利。