染色質(zhì)免疫共沉淀測序技術(shù)研究進展

陳桂芳 楊佳怡 高運華 任歌

（1.中國計量科學(xué)研究院，北京 100029；2.沈陽化工大學(xué)，沈陽 110142）

組蛋白修飾和轉(zhuǎn)錄因子對基因表達(dá)具有重要的調(diào)控作用。在真核細(xì)胞中，DNA纏繞著由H2A、H2B、H3、H4構(gòu)成的核心組蛋白八聚體形成核小體，通過連接DNA串聯(lián)形成染色質(zhì)。組蛋白修飾的發(fā)生將影響組蛋白與DNA的親和性，改變?nèi)旧|(zhì)的可及性，進而影響基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子識別并結(jié)合基因上游區(qū)域特定DNA序列，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。染色質(zhì)免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）利用目的蛋白特異性抗體，與可溶性染色質(zhì)免疫共沉淀，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA。與芯片技術(shù)相結(jié)合的ChIP-chip（chromatin immunoprecipitation-chip）是利用表面覆蓋已知序列的核苷酸探針的芯片，對染色質(zhì)免疫共沉淀捕獲的DNA進行核酸雜交，通過傳感器檢測堿基互補配對產(chǎn)生的熒光信號，進一步分析目的蛋白結(jié)合位點［1］。ChIP-chip檢測覆蓋率受限于芯片上預(yù)先設(shè)定的DNA序列，存在分辨率低、靈敏度有限，對探針設(shè)計要求高等局限性［2］。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展以及測序成本不斷降低，染色質(zhì)免疫共沉淀與測序相結(jié)合的ChIP-seq被廣泛使用。研究人員利用生物信息學(xué)工具對高通量測序生成的大量數(shù)據(jù)進行分析，通過將測序序列比對到全基因組，定位轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、組蛋白修飾的區(qū)域［3］。近年來，ChIP-seq被越來越廣泛地用于擬南芥、水稻及其他植物的基因表達(dá)調(diào)控研究中。

ChIP-seq通常需要數(shù)百萬個細(xì)胞，染色質(zhì)免疫共沉淀和測序文庫制備包含多個實驗步驟，免疫共沉淀可能受到非特異性結(jié)合的影響，產(chǎn)生背景噪音，文庫中DNA中GC含量過高或過低，將導(dǎo)致PCR擴增偏倚，進而影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。研究人員利用流式細(xì)胞術(shù)、微流控芯片等技術(shù)分離少量細(xì)胞或單細(xì)胞，優(yōu)化染色質(zhì)片段化、免疫共沉淀以及測序文庫構(gòu)建等實驗流程；通過特異性抗體引導(dǎo)將MNase或Tn5轉(zhuǎn)座酶間接結(jié)合到目的蛋白，并在蛋白結(jié)合位點附近使染色質(zhì)斷裂，替代了ChIP-seq染色質(zhì)片段化和免疫共沉淀操作，簡化實驗操作流程。在上述基礎(chǔ)上，實現(xiàn)少量細(xì)胞或單細(xì)胞水平的ChIP-seq檢測。本文簡述了ChIP-seq原理，詳細(xì)介紹其數(shù)據(jù)分析方法，討論近年來發(fā)展的ChIP-seq優(yōu)化方法和衍生技術(shù)，分析并比較不同方法的特點，總結(jié)了植物轉(zhuǎn)錄因子和組蛋白修飾在生物鐘調(diào)控、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、光信號途徑、脅迫響應(yīng)等方面研究與應(yīng)用。

1 ChIP-seq原理及數(shù)據(jù)分析

1.1 ChIP-seq原理

組蛋白修飾主要發(fā)生在組蛋白的N端，核小體組蛋白被DNA環(huán)繞，兩者結(jié)合較穩(wěn)定。轉(zhuǎn)錄因子一般具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，識別靶基因并以序列特異性方式結(jié)合DNA，轉(zhuǎn)錄因子與DNA相互作用通常是動態(tài)的［4-5］。根據(jù)目的蛋白與DNA結(jié)合特性，ChIP中制備染色質(zhì)片段的方式不同，主要包括甲醛交聯(lián)染色質(zhì)免疫共沉淀（formaldehyde cross-linking and sonication followed by chromatin immunoprecipitation，X-ChIP）和非交聯(lián)染色質(zhì)免疫 共 沉 淀（native chromatin immunoprecipitation，N-ChIP）［6-7］。甲醛能交聯(lián)固定蛋白與DNA，X-ChIP通過甲醛交聯(lián)與超聲處理形成可溶性染色質(zhì)片段，利用特異性抗體沉淀目的蛋白與DNA復(fù)合物，通過解交聯(lián)、蛋白酶消化等分離純化DNA，常用于檢測轉(zhuǎn)錄因子與DNA的相互作用［7］。微球菌核酸酶（micrococcal nuclease，MNase）兼具核酸內(nèi)切酶和核酸外切酶活性，主要作用于核小體之間的連接DNA（linker DNA）。N-ChIP一般無需甲醛交聯(lián)，MNase使染色質(zhì)在連接DNA區(qū)域斷裂，形成以核小體為單元的染色質(zhì)片段，酶切后采用組蛋白修飾特異性抗體進行免疫共沉淀并分離純化DNA，常用于組蛋白修飾的檢測［8-9］。

通過超聲或酶切斷裂的DNA帶有凸出的粘性末端，為連接具有平末端的測序接頭，在構(gòu)建文庫過程中，需要對DNA進行末端修復(fù)。延伸DNA 3'端直至與5'端平齊，隨后對5'和3'末端分別進行磷酸化和加dA修飾，獲得具有5'磷酸化和3' dA的DNA片段，進一步連接測序接頭［4，10］。圖1顯示了ChIP-seq基本流程：通過超聲或酶切進行染色質(zhì)片段化，利用特異性抗體免疫共沉淀目的蛋白和DNA，分離純化的DNA經(jīng)末端修復(fù)、連接測序接頭，通過PCR擴增構(gòu)建文庫、測序并分析［11］。

圖1 ChIP-seq基本流程Fig.1 Major steps of ChIP-seq

1.2 ChIP-seq數(shù)據(jù)分析

ChIP-seq數(shù)據(jù)分析是通過將測序序列比對到參考基因組，識別富集區(qū)域內(nèi)具有顯著信號的峰、定位目的蛋白結(jié)合位點［12-13］。ChIP-seq數(shù)據(jù)分析基本流程包括：預(yù)處理及質(zhì)量控制、序列比對、峰識別、可視化及高級分析等［14］。研究人員開發(fā)了多種基于不同算法的軟件工具對高通量測序數(shù)據(jù)進行處理。其中，Linux系統(tǒng)的Conda和基于R語言的Bioconductor是開放式軟件平臺，具有ChIP-seq數(shù)據(jù)分析的大量工具和軟件包［15］。

1.2.1 ChIP-seq數(shù)據(jù)分析軟件及算法 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制包括質(zhì)量評估和預(yù)處理。測序中，每個堿基具有一個質(zhì)量值Q-score（Q-score= -log10e，e為測序錯誤率），用于衡量測序準(zhǔn)確度，如Q30表明堿基識別發(fā)生錯誤的概率為0.1%，Q20指堿基識別發(fā)生錯誤的概率為1%。通過FastQC軟件對測序的原始讀長（raw reads）進行質(zhì)量評估，一般使用質(zhì)量值大于20或30的堿基占總體堿基的百分比（Q20或Q30）來評估測序數(shù)據(jù)質(zhì)量。接頭序列、擴增不均勻等將影響測序數(shù)據(jù)質(zhì)量，這些情況可利用FastQC查看［16］。根據(jù)質(zhì)量評估結(jié)果，可選擇TrimGalore、Picard以及SAMTools等工具進行預(yù)處理，去除低質(zhì)量堿基、接頭序列以及PCR擴增重復(fù)（PCR duplicates）等，獲得較高質(zhì)量的數(shù)據(jù)（clean data）［17］。

序列比對通過將測序序列比對到參考基因組（或序列已知的基因組）進行定位［18］。高通量測序?qū)a(chǎn)生大量的短序列數(shù)據(jù)，包含許多重復(fù)序列。絕大多數(shù)的序列比對算法構(gòu)建索引數(shù)據(jù)庫，通過索引篩選短序列在基因組中候選位置，減少搜索空間，提高比對效率［19］。根據(jù)建立索引數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)方法的不同，短序列比對軟件主要分為兩類：基于哈希表（Hash table）數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)和基于BWT壓縮算法的索引數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)（Burrows Wheeler transform，BWT）［20-22］。 哈 希表數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)序列比對過程中，測序讀段（reads）將以種子序列（seed）為單元生成序列集合，排列種子序列并建立索引數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)進行比對［14，23］。該方法也可以對參考基因組生成種子序列，建立索引數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)。BWT算法通過掃描短序列識別堿基重復(fù)的序列，將重復(fù)序列排列在一起，進一步壓縮索引數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)并重排列，以利于快速搜索和比對。目前，較為常用的短序列比對軟件有Bowtie2、BWA、SOAP2和MAQ，不同的比對軟件在比對數(shù)目、運行時間、內(nèi)存消耗等方面各具優(yōu)勢和不足［24］。較短讀長為單元時，可能的匹配區(qū)域很多，種子序列位點定位效率將降低，在進行序列比對過程中，基于Hash table數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)的MAQ難以實現(xiàn)準(zhǔn)確比對；基于BWT算法的比對工具有Bowtie2、BWA、SOAP2等，該算法的重排列利于短讀長在基因組中候選位點進行快速搜索和比對［25］。測序堿基的深度與基因組覆蓋率成正比例相關(guān)，隨測序深度增加，基因組覆蓋率增加，數(shù)據(jù)量更大。在HPV全基因組測序數(shù)據(jù)比對分析中，研究者采用上述4種工具將部分HPV測序數(shù)據(jù)與已知HPV基因組數(shù)據(jù)庫進行比對，結(jié)果表明BWT算法的比對效率和計算速度優(yōu)于Hash table算法［26］。

ChIP-seq數(shù)據(jù)分析中的重要環(huán)節(jié)是峰識別（peak calling）。峰（peak）被定義為基因組上reads富集的區(qū)域，峰識別是通過掃描比對到基因組上的短序列數(shù)據(jù)，進行樣本數(shù)據(jù)和對照組數(shù)據(jù)的比較，識別富集區(qū)域［14］。MACS算法通過滑動窗口（sliding window）掃描，基于泊松分布模型統(tǒng)計顯著的峰［27］。MACS采用具有固定大小的滑動窗口移動，可能產(chǎn)生窗口邊緣識別模糊的問題。QuEST算法基于連續(xù)覆蓋掃描，通過高斯核密度函數(shù)對reads富集密度進行評估，其中reads所在位置為窗口中心，具有最高密度值［28-29］。MACS通過計算全基因組范圍內(nèi)每個檢測峰（peak）顯著性P值，進一步分析差異peak，鑒定具有統(tǒng)計顯著性的差異蛋白質(zhì)結(jié)合位點，為較常用的峰識別工具［29］。

基于不同的需求，后續(xù)的數(shù)據(jù)處理和分析方法有所不同，如DNA序列特征的Motif分析、目的蛋白結(jié)合位點在基因組不同區(qū)域的偏好性分析、預(yù)測結(jié)合位點關(guān)聯(lián)基因功能的GO注釋及預(yù)測基因調(diào)控通路的Pathway分析等［30-31］。圖2顯示ChIP-seq數(shù)據(jù)分析流程及軟件。

圖2 ChIP-seq數(shù)據(jù)分析流程及軟件Fig.2 Protocol for computational analysis of ChIP-seq data and software

1.2.2 ChIP-seq常見數(shù)據(jù)格式及可視化 數(shù)據(jù)格式對于合理組織數(shù)據(jù)存儲，有效降低存儲空間以及加快下游分析速度至關(guān)重要。圖3顯示了ChIP-seq數(shù)據(jù)常見格式、格式轉(zhuǎn)變軟件及可視化方法。fasta和fastq格式是存儲核酸序列的常用格式，為二進制文本。其中，fastq格式包含短讀序列和質(zhì)量分?jǐn)?shù)等信息［32］。為方便后續(xù)分析，可利用sratoolkit軟件將測序原始數(shù)據(jù)格式轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)的fastq格式。SAM和BAM格式專用于存儲參考序列的比對序列，是由基因組序列比對得到的輸出格式［33］。BAM數(shù)據(jù)格式具有索引功能，為SAM格式的二進制，通過SAMTools軟件可將SAM文件轉(zhuǎn)換為BAM，有利于降低儲存空間。UCSC基因瀏覽器可以讀取BAM格式的數(shù)據(jù)，實現(xiàn)快速瀏覽［34］。儲存轉(zhuǎn)錄因子、組蛋白修飾等結(jié)合位點在全基因組上的信號分布情況的數(shù)據(jù)格式為BedGraph（Bed）格式。該格式包含有染色體名稱、染色體起始位點以及檢出信號值。將MACS軟件輸出Bed格式文件轉(zhuǎn)化為bigwig文件，上傳到UCSC或IGV瀏覽器以實現(xiàn)數(shù)據(jù)可視化［35-36］。其他可視化工具有基于R語言的ChIPseeker和基于Python的deepTools等。

圖3 ChIP-seq數(shù)據(jù)格式及可視化Fig.3 Standard data formats and visualization tools for ChIP-seq

2 基于ChIP-seq的優(yōu)化技術(shù)

ChIP-seq需要大量細(xì)胞，面對稀少樣本，收集足夠多的細(xì)胞存在困難。免疫共沉淀過程，可能受到甲醛交聯(lián)，非特異性結(jié)合的影響［37］。DNA片段中GC含量過高或過低，將導(dǎo)致PCR擴增偏倚，影響測序質(zhì)量［38］。近年來研究人員針對上述問題進行優(yōu)化并提出相應(yīng)的技術(shù)。

2.1 基于細(xì)胞分離優(yōu)化的ChIP-seq技術(shù)

流式細(xì)胞分選（fluorescence activated cell sorting，F(xiàn)ACS）是利用鞘液包裹細(xì)胞形成樣品流，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞攜帶的熒光信號，由分選器將特定的細(xì)胞從樣本中分離出來。Amour等［39］通過FACS將細(xì)胞分離到含有裂解緩沖液的反應(yīng)池中，進行細(xì)胞核分離與MNase酶切，提出基于MNase酶切的非交聯(lián)免疫共沉淀ChIP-seq技術(shù)（nultra low input micrococcal nuclease-based native ChIP，ULI-NChIP），該技術(shù)適用于微量樣品建庫測序。該方法利用連續(xù)裝置簡化實驗操作流程、減少分離純化過程的洗滌次數(shù)，降低樣品損失，利于在少量細(xì)胞中進行ChIP-seq 實驗［40］。

微流控芯片通過產(chǎn)生非連續(xù)的液滴包裹單個細(xì)胞，實現(xiàn)單細(xì)胞分離［41］。Rotem等［42］基于液滴微流控芯片建立scChIP-seq（single-cell ChIP-seq）：在具有多通道結(jié)構(gòu)的芯片上，細(xì)胞裂解緩沖液包裹著標(biāo)簽序列與單細(xì)胞懸液匯聚并通過油相，形成“油包水”液滴，液滴內(nèi)發(fā)生細(xì)胞裂解反應(yīng)，隨后與含MNase的凝膠微珠融合進行染色質(zhì)片段化，進一步對數(shù)千個單細(xì)胞獨立建庫。scChIP-seq具有高度集成化、自動化優(yōu)勢，但微流控芯片使用成本較高，且微流控液滴操作對實驗人員有較高技術(shù)要求。

2.2 基于酶切優(yōu)化的ChIP-seq技術(shù)

lambda核酸外切酶、RecJf核酸外切酶具有5'-3'外切酶活性，分別作用于雙鏈DNA和單鏈DNA，水解核苷酸之間的磷酸二酯鍵。Ho和Pugh將兩種核酸外切酶引入到X-ChIP實驗，提出ChIP-exo（ChIP combined with lambda exonuclease digestion）［43-44］。在特異性抗體沉淀目的蛋白與DNA交聯(lián)復(fù)合物之后，通過lambda核酸外切酶消化，使雙鏈DNA斷裂末端最大程度的靠近蛋白，減少背景干擾，提高蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)域分析的準(zhǔn)確性。進一步解交聯(lián)、分離純化DNA，利用RecJf核酸外切酶消化單鏈DNA，減少背景噪音。ChIP-exo核酸外切酶處理，有利于提高檢測轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的分辨率［2，44］。

2.3 基于免疫共沉淀優(yōu)化的ChIP-seq技術(shù)

染色質(zhì)免疫共沉淀實驗過程中，通常使用磁珠富集抗體、蛋白和DNA復(fù)合物，但難以避免非特異性結(jié)合的影響［37］。Zhu等［45］基于微流控芯片優(yōu)化ChIP實驗操作流程，提出MOW ChIP-seq（microfluidic oscillatory washing-based ChIP-seq）。將超聲處理的染色質(zhì)載入芯片，采用偶聯(lián)有目的蛋白特異性抗體的磁珠富集可溶性片段。通過控制芯片上微量流道內(nèi)樣品與磁珠的流動速度，促進兩者混合均勻，提高免疫磁珠的捕獲效率。另外利用微流控振蕩輔助，降低非特異性結(jié)合，提高結(jié)果準(zhǔn)確度。MOW ChIP-seq通過結(jié)合免疫磁珠、微流控芯片對樣品進行分離與富集，具有試劑和樣品消耗量少、自動化等優(yōu)勢［37］。

2.4 基于測序文庫優(yōu)化的ChIP-seq技術(shù)

ChIP-exo增加的酶切步驟以及多次洗滌，使用于建庫的起始DNA量減少，需要增加PCR循環(huán)擴增數(shù)，可能導(dǎo)致過多的重復(fù)序列［46］。在ChIP-exo基礎(chǔ)上，He等［47］設(shè)計含特異性序列的測序接頭，通過DNA自環(huán)化（self-circularization）方法優(yōu)化建庫，提 出 ChIP-nexus（ChIP experiments with nucleotide resolution through exonuclease，unique barcode and single ligation）。建庫過程中，將帶有限制性內(nèi)切酶BamH I酶切位點序列的測序接頭連接到DNA，利用環(huán)化連接酶將DNA自身環(huán)化。環(huán)化DNA通過BamH I酶切處理，其斷裂產(chǎn)物兩端將帶有測序接頭，利于直接擴增建庫。ChIP-nexus通過分子內(nèi)自身環(huán)化進行接頭連接構(gòu)建文庫，其連接效率比ChIP-seq中DNA連接酶的連接效率更高，有利于降低建庫DNA需求量。

擴增構(gòu)建測序文庫過程中，高GC含量DNA片段易產(chǎn)生擴增偏倚，擴增體系中的引物二聚體將造成背景信號［48］。Adli等［49］對文庫構(gòu)建方案優(yōu)化，并提出Nano-ChIP-seq。在PCR擴增建庫過程中，使用發(fā)夾結(jié)構(gòu)引物，減少引物二聚體。針對高GC含量序列，使用Phusion高保真DNA聚合酶，并優(yōu)化緩沖液和擴增循環(huán)次數(shù)。此外，在引物序列中引入限制性內(nèi)切酶BciV I的酶切位點序列，擴增產(chǎn)物在內(nèi)切酶作用下產(chǎn)生3'A突出末端，利于直接連接測序接頭。研究表明，利用Nano-ChIP-seq建庫方案可從少量細(xì)胞中進行ChIP-seq檢測［49-50］。表1比較了上述ChIP-seq優(yōu)化技術(shù)。

表1 ChIP-seq優(yōu)化技術(shù)比較Table 1 Comparison of optimization techniques of ChIP-seq

3 CUT&RUN、CUT&Tag及CoBATCH技術(shù)

ChIP包含細(xì)胞裂解、細(xì)胞核提取、染色質(zhì)制備以及免疫共沉淀等多個連續(xù)步驟，需要的細(xì)胞量較大，常規(guī)ChIP-seq很難進行少量細(xì)胞或單細(xì)胞水平的檢測［51］。最近，研究人員利用目的蛋白特異性抗體使MNase或Tn5轉(zhuǎn)座酶“靶向”作用于目的蛋白結(jié)合位點附近的染色質(zhì)，提出CUT&RUN、CUT&Tag等方法。與ChIP-seq相比較，這些方法無需獲取可溶性染色質(zhì)進行免疫共沉淀，具有實驗流程簡單、耗時短等優(yōu)勢，可以在少量細(xì)胞或單細(xì)胞水平進行檢測。

3.1 CUT&RUN技術(shù)

Schmid等［52］建立了以酶“靶向”切割染色質(zhì)的 方 法：ChIC（chromatin immunocleavage）。 為 使MNase選擇性地作用于目的蛋白結(jié)合區(qū)域，研究者利用對抗體具有親和力的Protein A融合MNase（pAMN），通過抗體結(jié)合pA-MN融合蛋白將MNase間接結(jié)合到目的蛋白。在ChIC實驗中，首先利用螯合劑EDTA、EGTA等抑制MNase酶活性，將細(xì)胞與含有目的蛋白特異性抗體、pA-MN的緩沖液反應(yīng)后，用Ca2+激活MNase，使其在特定位點斷裂DNA。2016年，Skene等［51］將ChIC與高通量測序技術(shù)結(jié)合，提出CUT&RUN。

CUT&RUN中，特異性抗體先與目的蛋白結(jié)合，進一步與pA-MN反應(yīng)，募集pA-MN到結(jié)合位點。在0℃下保持較低的酶活性，抗體固定酶后，采用Ca2+激活MNase使其在目的蛋白結(jié)合位點附近作用于染色質(zhì)開放區(qū)域，酶切后染色質(zhì)片段釋放，進一步建庫測序［51，53］。研究者利用伴刀豆球蛋白A（concanavalin A，Con A）能與細(xì)胞的多糖、糖蛋白特異結(jié)合特性，將Con A包被在磁珠表面，固定細(xì)胞或細(xì)胞核，以利于洗滌。2018年，Skene等［54］對CUT&RUN實驗優(yōu)化，通過洋地黃皂苷（digitonin）增加細(xì)胞膜通透性，釋放酶切染色質(zhì)片段到細(xì)胞外，由于未被切割的染色質(zhì)仍留在細(xì)胞內(nèi)，有利于降低背景噪音。2019年，Hainer等［55］利用流式細(xì)胞分選將單個細(xì)胞分離到多孔板中進行CUT&RUN實驗，提出可對極少量細(xì)胞進行檢測的ULI-CUT&RUN（ultra-low input CUT&RUN）。

3.2 CUT&Tag及CoBATCH技術(shù)

Tn5轉(zhuǎn)座子由核心序列和兩末端序列組成。Tn5轉(zhuǎn)座酶可以與Tn5轉(zhuǎn)座子的末端序列結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物具有“剪切-粘貼”（cut and paste）催化活性，兩者協(xié)同完成Tn5轉(zhuǎn)座子末端序列的切割和轉(zhuǎn)移。在Tn5轉(zhuǎn)座復(fù)合體作用下，轉(zhuǎn)座子末端DNA的磷酸二酯鍵被水解并產(chǎn)生3'- OH羥基末端，隨后Tn5轉(zhuǎn)座酶進攻目標(biāo)DNA形成9 bp的切口，同時轉(zhuǎn)座子羥基末端與目標(biāo)DNA的磷酸基團之間形成共價鍵，從而將轉(zhuǎn)座子序列插入到目標(biāo)DNA［56］。由于這一特性，Tn5轉(zhuǎn)座酶可將測序接頭序列隨機插入染色質(zhì)開放區(qū)域，進行DNA片段化和測序接頭連接［57］。Schmidl等［58］首先將 Tn5轉(zhuǎn)座酶工具與ChIP相結(jié)合，代替ChIP-seq構(gòu)建測序文庫中的末端補平、3'末端加A等處理，提出ChIPmentation。其中，測序接頭和Tn5轉(zhuǎn)座酶組裝形成轉(zhuǎn)座復(fù)合物，與X-ChIP獲得的目的蛋白結(jié)合DNA反應(yīng)，進行接頭連接。

2019年，Kaya-Okur等［59］參考 CUT&RUN的實驗流程，將帶有測序接頭的Tn5轉(zhuǎn)座酶與Protein A融合（pA-Tn5），利用pA-Tn5替換pA-MN，提出CUT&Tag。特異性抗體結(jié)合目的蛋白后，進一步與pA-Tn5反應(yīng)，利用Mg2+激活Tn5轉(zhuǎn)座酶活性進行染色質(zhì)切割與接頭連接。Tn5轉(zhuǎn)座酶建庫有利于減少損失，與CUT&RUN比較，CUT&Tag的樣本需求量更小。2020年，Bartosovic等［60］將液滴微流控技術(shù)與CUT&Tag相結(jié)合，進行單細(xì)胞建庫測序，提出 scCUT&Tag（single-cell Cut&Tag）。 表2比 較 了CUT&RUN、CUT&Tag與 ChIP-seq。

表2 CUT&RUN、CUT&Tag與ChIP-seq比較Table 2 Comparison of CUT&RUN，CUT&Tag and ChIP-seq

標(biāo)簽組合（combinatorial indexing）建庫是利用不同的barcode序列為不同樣品的DNA進行組合標(biāo)簽標(biāo)記，通過一次建庫可區(qū)別成千上萬單細(xì)胞，利于提高單細(xì)胞測序的通量，獲得更多單細(xì)胞信息［61］。2019年，Wang等［62］基于標(biāo)簽組合和pA-Tn5提出 CoBATCH（combinatorial barcoding and targeted chromatin release）。通過流式細(xì)胞儀和微孔板進行單個細(xì)胞的分選和分離，采用帶有T5/T7組合標(biāo)簽的pA-Tn5對染色質(zhì)進行轉(zhuǎn)座酶切割和標(biāo)簽標(biāo)記，進一步對帶有不同標(biāo)簽的DNA建庫與測序。CoBATCH利用組合標(biāo)簽區(qū)分不同樣本來源的細(xì)胞，同時組合標(biāo)簽增加了測序文庫的復(fù)雜度，利于進行高通量的單細(xì)胞檢測。

4 在植物基因表達(dá)調(diào)控研究中的應(yīng)用

研究人員使用ChIP-seq檢測植物轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點、組蛋白修飾分布，已廣泛應(yīng)用于生物鐘調(diào)控、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、光信號途徑、脅迫響應(yīng)等研究［63-65］。CUT&RUN和CUT&Tag方法具有流程簡單、良好的可重復(fù)性、需要的細(xì)胞數(shù)量少等優(yōu)勢，近年來，被初步應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)錄因子、組蛋白修飾H3K27me3和 H3K4me3 等研究［66-68］。

4.1 植物轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點相關(guān)研究

植物的生長發(fā)育除了受自身遺傳因素的調(diào)控外，還受到環(huán)境脅迫、內(nèi)源激素變化等影響。轉(zhuǎn)錄因子在植物的生物鐘調(diào)控、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長和代謝等過程中發(fā)揮重要作用［69-70］。GRF7（growthregulating factor 7）是水稻（Oryza sativa）生長調(diào)節(jié)因子類轉(zhuǎn)錄因子，Chen等［71］選用不同發(fā)育時期的水稻幼穗進行ChIP-seq檢測，發(fā)現(xiàn)OsGRF7與細(xì)胞色素P450基因OsCYP714B1和生長素響應(yīng)基因OsARF12啟動子中的ACRGDA motif結(jié)合，激活基因轉(zhuǎn)錄，參與赤霉素的合成和生長素的信號傳導(dǎo)途徑，調(diào)控幼穗發(fā)育。生物鐘是影響生物晝夜節(jié)律的重要因素，CAA1（circadian clock-associated 1）是擬南芥（Arabidopsis thaliana）生物鐘重要轉(zhuǎn)錄因子，PRRs家族基因參與生物鐘調(diào)控，Kamioka等［69］通過ChIP-seq發(fā)現(xiàn)CCA1直接結(jié)合在基因PRR5的啟動子區(qū)域，抑制PRR5表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)CCA1與PRR9、PRR7、PRR5等基因啟動子上多個motif結(jié)合，包括G-box、EEs、CT重復(fù)、TCP等，調(diào)控生物鐘周期。光是調(diào)控植物生長和發(fā)育的重要環(huán)境因素，F(xiàn)HY3（far-red elongated hypocotyl 3）是擬南芥光信號轉(zhuǎn)錄因子，Ouyang等［72］利用ChIP-seq在遠(yuǎn)紅光條件下鑒定到FHY3結(jié)合在基因FHY1和ELF4啟動子的FBS motif（CACGCGC），激活基因表達(dá)，促進光敏色素A在細(xì)胞核的積累，進而調(diào)控光信號途徑；并發(fā)現(xiàn)FHY3與葉綠體分裂相關(guān)基因ARC5啟動子區(qū)域的FBS motif結(jié)合，激活其轉(zhuǎn)錄，進而影響葉綠體發(fā)育。葉夾角是影響株型與作物產(chǎn)量的重要農(nóng)藝性狀，油菜素內(nèi)酯（brassinosteroid，BR）是植物重要的促生長類激素。BR促進細(xì)胞伸長與分裂，對水稻葉夾角發(fā)育有影響，Guo等［68］通過CUT&RUN分析發(fā)現(xiàn)，水稻bHLH（basic-helix-loop-helix）轉(zhuǎn)錄因子家族的OsbHLH98，結(jié)合水稻BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因BUL1的啟動子上的G-box、E-box等motif，抑制基因表達(dá)，調(diào)控水稻葉夾角發(fā)育。

4.2 植物組蛋白修飾及分布相關(guān)研究

在植物發(fā)育過程中，除了轉(zhuǎn)錄因子激活或抑制基因表達(dá)的作用外，染色質(zhì)組蛋白翻譯后修飾通過影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)來調(diào)控基因的表達(dá)。組蛋白修飾H3K27me3抑制基因轉(zhuǎn)錄，Wu等［73］通過ChIP-seq發(fā)現(xiàn)在高氮素條件下水稻分蘗抑制基因D14和OsSPL14啟動子區(qū)域的H3K27me3富集水平顯著升高。進一步研究表明，水稻分蘗期氮素應(yīng)答關(guān)鍵蛋白NGR5通過與PRC2相互作用，將PRC2招募到D14和OsSPL14的啟動子上催化H3K27me3修飾并抑制基因表達(dá)，進而調(diào)控氮濃度對水稻氮素吸收和分蘗發(fā)生的影響。Nishio等［74］以鼠耳芥（Arabidopsis halleri）為材料，通過ChIP-seq分析組蛋白修飾H3K27me3對其季節(jié)性和晝夜節(jié)律基因表達(dá)的影響，并與組蛋白修飾H3K4me3進行比較。發(fā)現(xiàn)H3K27me3具有季節(jié)性的可塑性與晝夜節(jié)律穩(wěn)定性，H3K27me3的信號變化晚于H3K4me3出現(xiàn)，在環(huán)境變化中進行長期的基因表達(dá)調(diào)控。

研究者將CUT&RUN、CUT&Tag用于植物組蛋白修飾分析，并與ChIP-seq進行比較。Zheng等［66］利用流式細(xì)胞儀分選擬南芥胚乳細(xì)胞核，通過CUT&RUN分析發(fā)現(xiàn)胚乳細(xì)胞周期中有絲分裂間期的相關(guān)基因被H3K27me3修飾，H3K27me3影響親本等位基因的差異表達(dá)與胚乳發(fā)育。與ChIP-seq相比較，CUT&RUN檢測所需細(xì)胞數(shù)量更少。Tao等［67］將CUT&Tag用于對棉纖維細(xì)胞基因組及外顯子、內(nèi)含子、啟動子等區(qū)域組蛋白修飾H3K4me3的分布特征分析，發(fā)現(xiàn)H3K4me3顯著富集在基因啟動子上（轉(zhuǎn)錄起始位點上游1-2 kb）。使用相同數(shù)量細(xì)胞進行CUT&Tag和ChIP-seq檢測，發(fā)現(xiàn)CUT&Tag分析結(jié)果具有較好重復(fù)性，顯示出更高分辨率和更低的背景信號，所需實驗時間更短。

5 總結(jié)與展望

ChIP-seq已被廣泛用于轉(zhuǎn)錄因子和組蛋白修飾研究。近年來，研究人員將流式細(xì)胞分選、微流控芯片與ChIP-seq相結(jié)合，優(yōu)化細(xì)胞分離、染色質(zhì)片段化、免疫共沉淀以及測序文庫構(gòu)建等關(guān)鍵步驟并提出優(yōu)化方法。CUT&RUN、CUT&Tag利用“靶向”酶切和Tn5轉(zhuǎn)座酶建庫，簡化實驗流程。在上述基礎(chǔ)上，使得ChIP-seq在少量細(xì)胞或在單細(xì)胞水平的檢測成為可能。其他測序技術(shù)在轉(zhuǎn)錄因子和組蛋白修飾研究中具有重要作用：微球菌核酸酶測序MNase-seq（micrococcal nuclease sequencing） 利 用MNase切割染色質(zhì)，獲取核小體DNA建庫測序，繪制核小體定位圖譜［75］。MNase-seq與ChIP-seq聯(lián)合將利于分析目的蛋白結(jié)合位點附近的核小體定位狀態(tài)。染色質(zhì)轉(zhuǎn)座酶可及性測序ATAC-seq（assay for transposase-accessible chromatin with high throughput sequencing）利用Tn5轉(zhuǎn)座酶進行染色質(zhì)切割與接頭連接，檢測染色質(zhì)開放區(qū)域［76］。ATAC-seq結(jié)合ChIP-seq可進一步分析轉(zhuǎn)錄因子、組蛋白修飾對染色質(zhì)開放性的影響。ChIP-seq與轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（RNA-seq）的聯(lián)合分析，有利于進一步確認(rèn)轉(zhuǎn)錄因子以及組蛋白的修飾對于基因表達(dá)的調(diào)控作用。

隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，ATAC-seq、RNA-seq，CUT&RUN、CUT&Tag等均可以實現(xiàn)單細(xì)胞水平的檢測。進行單細(xì)胞的組學(xué)分析，克服細(xì)胞異質(zhì)性對有效信號的“干擾”問題，有利于珍稀樣品的準(zhǔn)確分析。將ChIP-seq納入多組學(xué)聯(lián)合分析，幫助更全面的理解細(xì)胞內(nèi)蛋白與DNA相互作用，具有重要的研究意義。