哺乳動物DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1和DNMT3結(jié)構(gòu)與功能的研究進(jìn)展

王晨晨 張凡麗 陳珮琪 翁思瑤 王慧芳 崔小娟，2

（1.湖南科技大學(xué)生命科學(xué)與健康學(xué)院，湘潭 411201；2.湖南科技大學(xué)經(jīng)濟(jì)作物遺傳改良與綜合利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湘潭 411201）

DNA甲基化是表觀遺傳修飾的重要方式，在基因表達(dá)調(diào)控、基因組印跡、X染色體失活等事件中發(fā)揮了關(guān)鍵作用［1-4］。哺乳動物DNA甲基化主要由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）催化甲基從S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）轉(zhuǎn)移至胞嘧啶第5位碳原子上。哺乳動物DNMTs家族成員主要包括DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B和 DNMT3L， 其 中，DNMT1、DNMT3A和DNMT3B具有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性，因此，該綜述主要針對DNMT1、DNMT3A和DNMT3B展開討論。

DNMTs的結(jié)構(gòu)和功能與機(jī)體組織器官的生長發(fā)育密切相關(guān)，例如，哺乳動物的減數(shù)分裂過程高度依賴于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶實(shí)現(xiàn)甲基化模式的重塑［5］。在骨折愈合的過程中，DNMT3B缺失誘發(fā)軟骨發(fā)育缺陷，CXCL12和OPN等血管生成因子表達(dá)水平顯著降低，阻礙血管生成、骨重塑等事件的發(fā)生［6］。在腫瘤細(xì)胞中，腫瘤抑制因子啟動子高甲基化抑制抑癌基因的表達(dá)，或癌細(xì)胞整體低甲基化誘導(dǎo)基因組不穩(wěn)定，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生［7-9］。因此，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶在個體發(fā)育和疾病發(fā)生中發(fā)揮了重要作用，本文將對哺乳動物DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、DNA甲基化的動態(tài)調(diào)節(jié)以及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶在個體發(fā)育和疾病發(fā)生中的作用等方面進(jìn)行綜述，旨在對DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的深入研究和應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 DNMTs的結(jié)構(gòu)特征

DNMTs由N端調(diào)控域、C端MTase（methyltransferase catalytic domain，MTase）結(jié)構(gòu)域和GK重復(fù)序列3部分組成［10］。N端調(diào)控域包含多個功能結(jié)構(gòu)域，對DNMTs的轉(zhuǎn)錄抑制、細(xì)胞核定位、位點(diǎn)特異性結(jié)合以及酶活性調(diào)節(jié)至關(guān)重要［3，11-16］。DNMT1的N末端主要包括DNMT1相關(guān)蛋白1結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNMT1-associated protein 1 binding domain，DMAPD）、增殖細(xì)胞核抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域（proliferating cell nuclear antigen binding domain，PBD）、復(fù)制叉靶向序列（replication foci targeting sequence，RFTS）、CXXC 鋅 指結(jié)構(gòu)域和兩個相鄰的溴鄰?fù)唇Y(jié)構(gòu)域（bromo-adjacent homology，BAH）［16-17］（ 圖1）。DMAPD 是 DMAP1結(jié)合結(jié)構(gòu)域，DMAP1是TIP60-p400組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的組成部分，對于維持胚胎干細(xì)胞的多能性至關(guān)重要［13］。PBD是PCNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，有助于DNMT1與DNA復(fù)制叉結(jié)合，PBD缺失導(dǎo)致DNA復(fù)制后甲基化延遲［14，16］。復(fù)制叉靶向序列RFTS引導(dǎo)DNMT1結(jié)合到DNA復(fù)制叉位置，進(jìn)而與含有PHD和RING指的泛素樣結(jié)構(gòu)域（ubiquitin-like with PHD and Ring finger domains 1，UHRF1）互作，通過UHRF1的SRA結(jié)構(gòu)域識別并結(jié)合半甲基化的CpG位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)DNA甲基化的維持，在缺乏底物的情況下，RFTS將封閉催化中心，實(shí)現(xiàn)DNMT1自抑制機(jī)制［16，18-20］。CXXC 識別未甲基化 CpG 位點(diǎn)，通過與RFTS結(jié)合或者在DNA與DNMT1之間插入一段高酸性氨基酸序列（CXXC-BAH1自抑制連接子），阻斷DNMT1的活性位點(diǎn)，抑制從頭甲基化［3，18，21］。BAH 結(jié) 構(gòu) 域 包 括 BAH1 和 BAH2，BAH1通過長接頭片段與CXXC相連形成自抑制連接子，有助于CXXC、RFTs介導(dǎo)的DNMT1自抑制，BAH2參與DNMT1的定位和維持甲基轉(zhuǎn)移酶活性，其與MTase結(jié)構(gòu)域中的靶向識別結(jié)構(gòu)域（Target recognition domain，TRD）相互作用參與酶活性的調(diào)節(jié)［3，19］。與 DNMT1 不同，DNMT3A 和 DNMT3B 的N端包含PWWP（Pro-Trp-Trp-Pro）和ADD（ATRXDNMT3-DNMT3L）結(jié)構(gòu)域，而DNMT3L和DNMT3C的N端只有ADD結(jié)構(gòu)域［22］（圖1）。PWWP能識別并結(jié)合甲基化的組蛋白，介導(dǎo)DNMT3A/3B與染色質(zhì)結(jié)合［5，23-25］。DNMT3A 的 PWWP 突變和缺失導(dǎo)致小鼠異常超甲基化并表現(xiàn)出生長滯后，DNMT3B與靶基因的結(jié)合也需要 PWWP 參與［5，26-27］。ADD能特異性結(jié)合未甲基化的H3K4（H3K4me0），調(diào)節(jié)酶的催化活性［15，28-29］。ADD結(jié)構(gòu)域可與自身催化結(jié)構(gòu)域相互作用，阻斷DNA的結(jié)合，產(chǎn)生自抑制，而與H3K4me0結(jié)合可以破壞ADD結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域之間的互作，自抑制被解除［15，29-30］。

圖1 小鼠DNMTs蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)域Fig.1 Conserved domains of mouse DNMTs protein family

C末端MTase結(jié)構(gòu)域是DNMTs催化甲基轉(zhuǎn)移的核心區(qū)域。MTase結(jié)構(gòu)域包含10個不同的基序，其中6個（I、IV、VI、VIII、IX、X）在進(jìn)化上高度保守，并且在催化過程中有直接作用［10，31］。I、II、III是SAM結(jié)合位點(diǎn)，I、X是輔助因子結(jié)合位點(diǎn)，IV（PCN）、VI（ENV）、VIII（RxRxR）是底物催化位點(diǎn)［10，31］。PCN中的Cys殘基對靶堿基進(jìn)行親核攻擊，ENV中的Glu殘基與翻轉(zhuǎn)堿基相互作用，并將胞嘧啶定位在活性位點(diǎn)，RxRxR中的Arg殘基與酶-堿基復(fù)合物的脫質(zhì)子化有關(guān)［11-12，31-32］。VIII和 IX 之間的一段保守程度較低的區(qū)域被稱為靶向識別結(jié)構(gòu)域（TRD），負(fù)責(zé)底物DNA上甲基化位點(diǎn)的識別［33］。DNMT1的C端單獨(dú)存在時沒有活性，BAH2與TRD的相互作用可能會導(dǎo)致MTase結(jié)構(gòu)域的錯誤折疊［34-35］。DNMT3A和DNMT3B的C端單獨(dú)存在時有活性，且比全長蛋白質(zhì)的酶活性更高，其催化活性可能受N端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的變構(gòu)調(diào)節(jié)［12，36］。

GK重復(fù)序列是一段賴氨酸-甘氨酸二肽重復(fù)序列，在進(jìn)化上高度保守，負(fù)責(zé)將N端調(diào)控域和C端MTase結(jié)構(gòu)域的連接［10］。目前的結(jié)構(gòu)研究表明，GK重復(fù)序列不參與酶和DNA相互作用，但GK重復(fù)序列具有去泛素化酶USP7（ubiquitin-specific protease7）的結(jié)合位點(diǎn)，兩者結(jié)合后，阻止DNMT1的泛素化和降解，在DNMT1介導(dǎo)的維持DNA甲基化中起調(diào)節(jié)作用［37］。研究還表明，GK重復(fù)序列可能參與小鼠ES細(xì)胞中DNMT1介導(dǎo)的父本印跡控制區(qū)的從頭甲基化，說明DNMT1在必要情況下也可參與從頭甲基化［19］。

2 DNMTs與DNA甲基化動態(tài)調(diào)節(jié)

DNA甲基化包括維持甲基化和從頭甲基化（圖2）。維持甲基化依賴于DNA復(fù)制過程，識別半甲基化CpG位點(diǎn)，催化甲基轉(zhuǎn)移到新合成DNA鏈的CpG位點(diǎn)的胞嘧啶碳原子上［12，16］。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1主要負(fù)責(zé)維持甲基化，需要UHRF1、H3K9me2/3等的協(xié)同作用，UHRF1可以將DNMT1招募到半甲基化CpG位點(diǎn)，H3K9me2/3介導(dǎo)UHRF1與染色質(zhì)結(jié)合，UHRF1依賴于組蛋白修飾與DNMT1互作來實(shí)現(xiàn)維持甲基化的功能［38-40］。從頭甲基化是指在未甲基化的CpG位點(diǎn)建立新的甲基化，主要在未分化細(xì)胞中表達(dá)，發(fā)生在胚胎發(fā)育和配子形成時期［41-42］。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A和DNMT3B主要負(fù)責(zé)從頭甲基化，PWWP結(jié)構(gòu)域通常識別并結(jié)合H3K9me2/3，參與DNA甲基化、組蛋白修飾、DNA修復(fù)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多個與染色質(zhì)相關(guān)的生物學(xué)過程，ADD結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合未甲基化的H3K4，誘導(dǎo)構(gòu)象發(fā)生改變以刺激酶的活性［3，15，24，28，31］。DNA去甲基化途徑分為被動去甲基化和主動去甲基化［2，43］（圖3）。被動去甲基化過程中，參與維持甲基化的DNMT1/UHRF1缺失，或參與從頭甲基化的DNMT3A/3B減少，細(xì)胞發(fā)生快速去甲基化，基因組甲基化水平顯著降低［2，38，40］；主動去甲基化過程中，10-11易位甲基化胞嘧啶雙加氧酶（ten-eleven translocation methyl cytosine dioxygenases，TETs） 家族蛋白可將5-甲基胞嘧啶（5mC）氧化為5-羥甲基胞嘧啶（5hmC），5hmC可進(jìn)一步被氧化為5-甲酰胞嘧啶（5fC）和5-羥基胞嘧啶（5caC），TET1/2/3缺失小鼠細(xì)胞中 5mC 水平升高［2，16，44］。進(jìn)一步的研究表明，5fC和5caC可在胸腺嘧啶DNA糖苷酶TDG（thymine DNA glycosylase，TDG）的作用下參與堿基切除修復(fù)（base excision repair，BER）途徑，最終形成未被修飾的胞嘧啶［16，45-47］。

圖2 DNA甲基化模式的建立和維持Fig.2 Establishment and maintenance of DNA methylation patterns

圖3 DNA甲基化的動態(tài)調(diào)節(jié)Fig.3 Dynamic regulation of DNA methylation

3 DNMTs的生物學(xué)功能

DNA甲基化是一種涉及個體發(fā)育和疾病發(fā)生的表觀遺傳過程［17，48-49］。DNA甲基化與去甲基化的動態(tài)平衡對機(jī)體的正常運(yùn)轉(zhuǎn)是必需的，這種平衡狀態(tài)被破壞會造成DNA甲基化模式紊亂，機(jī)體可能面臨早期胚胎發(fā)育異常、生殖細(xì)胞發(fā)生缺陷、學(xué)習(xí)記憶能力受損、疾病發(fā)生等問題［16，31，49-57］。

3.1 DNMTs與個體發(fā)育

DNMTs活性的改變導(dǎo)致早期胚胎發(fā)育缺陷［1，41，58-59］。研究發(fā)現(xiàn)，胚胎干細(xì)胞 DNMT1 缺失，基因組發(fā)生去甲基化，導(dǎo)致細(xì)胞快速死亡［59-60］。DNMT3A突變小鼠胚胎發(fā)育幾乎不受影響，但出生時表現(xiàn)出矮小表型，并在 4 周齡時死亡［1，26-27，41］。去除DNMT3B小鼠染色體著絲粒處小衛(wèi)星重復(fù)序列去甲基化，并在妊娠后期死亡［1，58-59］。另外，早期胚胎發(fā)育過程中印跡基因甲基化的維持和X染色體的失活也與 DNMTs有關(guān)［4，61］。DNMT1 在卵母細(xì)胞和早期胚胎發(fā)育時期特異性表達(dá)，在維持印跡基因甲基化形式中發(fā)揮重要作用［61-62］。X染色體失活（X chromosome inactivation，XCI）使雄性（XY）和雌性（XX）之間的X染色體得到劑量補(bǔ)償，防止雌性體內(nèi)的兩個X等位基因同時發(fā)揮作用，從而維持雌性體細(xì)胞正常的生長發(fā)育［63-66］。長鏈非編碼RNA Xist（X-inactive specific transcript，Xist）的激活是XCI發(fā)生的重要原因，甲基化的Xist不能被轉(zhuǎn)錄，因此活性X染色體通常表現(xiàn)出高甲基化［4，66］。

DNMTs還參與原始生殖細(xì)胞（Primordial germ cells，PGCs）甲基化的消除和隨后性別特異性生殖細(xì)胞甲基化模式的建立［16-17］。研究表明，維持甲基化缺失是PGCs基因組去甲基化的主要原因，DNMT1和UHRF1參與PGCs中活性DNA的去甲基化［2，38］。在PGCs增殖和遷移過程中，UHRF1蛋白質(zhì)水平下調(diào)，DNMT1不能準(zhǔn)確定位到復(fù)制叉，維持DNA 甲基化減弱，PGCs發(fā)生去甲基化［2，38-40］。生殖細(xì)胞特異性的甲基化標(biāo)記使精子或卵子建立性別特異性甲基化模式［16-17，66］。研究表明，DNMT3A和DNMT3L負(fù)責(zé)配子發(fā)生過程中印跡區(qū)域的從頭甲基化，DNMT3A或DNMT3L缺失導(dǎo)致DNA甲基化印跡缺失，并顯示整個基因組的低甲基化［1］。在UHRF1存在的特定條件下，DNMT1具有從頭甲基轉(zhuǎn)移酶活性［67］。Stella（也稱為Dppa3或PGC7）通過抑制DNMT1和UHRF1介導(dǎo)的異常從頭甲基化來保護(hù)卵母細(xì)胞甲基化水平，Stella缺失導(dǎo)致卵母細(xì)胞甲基化水平升高，阻礙合子基因組激活［68-69］。

3.2 DNMTs與疾病

3.2.1 DNMTs與癌癥 癌癥也稱為惡性腫瘤，腫瘤細(xì)胞在惡性轉(zhuǎn)化過程中通常表現(xiàn)出異常的DNA甲基化模式，具有全基因組低甲基化和局部高甲基化的特點(diǎn)［48，70-71］。腫瘤細(xì)胞的全基因組低甲基化，主要發(fā)生在基因編碼區(qū)和衛(wèi)星重復(fù)區(qū)，可能導(dǎo)致有絲分裂重組、拷貝數(shù)缺失和染色體重排［48，72］。局部高甲基化主要發(fā)生在抑癌基因啟動子區(qū)域，研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞中DNMT1、DNMT3B過表達(dá)分別導(dǎo)致ISL、BRCA1啟動子高甲基化［73-74］。胃癌細(xì)胞中DNMT3A、DNMT3B過表達(dá)使ADAMTS9、MGMT、CNR1等抑制因子啟動子甲基化水平升高［75-76］。DNMT1、DNMT3A和DNMT3B在酒精性肝病組織和肝細(xì)胞癌中均上調(diào)［77-78］。以上研究表明，抑癌基因啟動子高甲基化導(dǎo)致的基因表達(dá)沉默可能是癌癥發(fā)生的重要原因。由于DNA甲基化異常具有重要的致病作用，因此靶向DNMTs的表觀遺傳療法為癌癥患者提供了新的治療途徑［51-52，55，79-81］。

3.2.2 DNMTs與神經(jīng)系統(tǒng)疾病 DNMTs參與動物的學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)系統(tǒng)退行性改變，大腦神經(jīng)元的低甲基化與成人神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生退行性改變有關(guān)［49，82］。研究發(fā)現(xiàn)，帕金森?。≒arkinson Disease，PD）、阿爾茲海默癥（Alzheimer disease，AD）患者DNA甲基化紊亂，DNMT1功能缺失可能是PD、AD等神經(jīng)退行性疾病出現(xiàn)異常甲基化的基礎(chǔ)［49，83］。研究表明，有絲分裂后神經(jīng)元中的DNMT3A是正常記憶形成所必需的，在情景記憶中具有特殊作用［84］。DNMT3B的多態(tài)性可以調(diào)節(jié)環(huán)境對認(rèn)知能力的影響，促紅細(xì)胞素可以改善SAMP8小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力［85-86］。研究還發(fā)現(xiàn)，恐懼記憶重現(xiàn)使負(fù)面情緒遷延不愈，限制了抑郁癥、焦慮癥、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙等多種精神疾病的治療，而DNMT3A過表達(dá)可以阻止恐懼記憶重現(xiàn)，顯著提高治療效果［87］。

3.2.3 DNMTs與其他疾病 除了癌癥和神經(jīng)系統(tǒng)疾病，DNMTs還與代謝疾病、腎臟疾病、關(guān)節(jié)疾病等其他疾病有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，DNMT1和DNMT3參與脂肪酸或炎性細(xì)胞因子誘導(dǎo)的DNA甲基化變化，脂肪細(xì)胞DNMT1的缺失會引起脂肪細(xì)胞肥大和葡萄糖穩(wěn)態(tài)缺陷，導(dǎo)致肥胖、II型糖尿病及心血管疾病的產(chǎn)生［88-90］。慢性腎臟病中TGF-β信號誘導(dǎo)DNMT1、DNMT3A異常上調(diào)，導(dǎo)致Klotho啟動子超甲基化，而阻斷TGF-β信號或DNMT1、DNMT3A活性可以維持腎臟Klotho水平，有效緩解慢性腎臟病和腎臟纖維化［91-93］。骨關(guān)節(jié)炎小鼠過氧化物酶體增殖物激活 受 體（Peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）明顯下調(diào)，DNMT1/DNMT3A異常增多和PPARγ高甲基化可能是PPARγ被抑制的主要原因，PPARγ去甲基化可減輕小鼠骨關(guān)節(jié)炎程度［94］。

4 總結(jié)與展望

近年來，DNMTs及DNMT-底物復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的解析促進(jìn)了我們對DNMT1維持甲基化和DNMT3從頭甲基化的理解。DNMT1中RFTs、CXXC結(jié)構(gòu)域和DNMT3中ADD結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的自抑制機(jī)制保證了各自甲基轉(zhuǎn)移酶的活性。但在一定條件下，DNMT1可以參與從頭甲基化，DNMT3也可以參與維持甲基化，無催化活性的DNMT3B亞型還可作為其他甲基轉(zhuǎn)移酶的輔助因子參與從頭/維持甲基化。DNMTs參與DNA甲基化的動態(tài)調(diào)節(jié)，主要體現(xiàn)在DNA復(fù)制過程中DNA甲基化的維持、從頭甲基化的建立和去甲基化三個方面，如何通過多種調(diào)控機(jī)制維持細(xì)胞的DNA甲基化動態(tài)平衡值得進(jìn)一步探索。DNMT3A參與記憶形成與調(diào)節(jié)，異常DNA甲基化在多種疾病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，靶向DNMTs的小分子藥物有望成為相關(guān)難治疾病的新療法。然而，DNMTs在作用機(jī)制方面仍面臨許多問題，例如，DNMTs的N-末端結(jié)構(gòu)域是如何協(xié)調(diào)酶活性和基因組靶向性的？生殖細(xì)胞發(fā)生過程中印跡基因和性別特異性DNA的甲基化模式的建立是由什么決定的？以DNMTs為靶點(diǎn)的小分子藥物是如何發(fā)揮作用的？個體因素是否對藥效有影響？這些問題仍需要進(jìn)一步研究，而對DNMTs結(jié)構(gòu)和功能的研究將有助于DNA甲基化調(diào)控機(jī)制的闡明。