小果雪兔子揮發(fā)油及多糖組成分析

＊劉瑜 高潭

（西藏農(nóng)牧學(xué)院 食品科學(xué)學(xué)院 西藏 860000）

引言

揮發(fā)油是一類重要的植物次生代謝產(chǎn)物，研究表明，揮發(fā)油具有發(fā)散解表、芳香開竅、清熱解毒、解暑祛穢、理氣止痛、祛風(fēng)除濕、祛寒溫里、活血化瘀、殺蟲抗菌等功能[1]，是人們關(guān)注的熱點，在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景[2]。天然多糖是自然界最豐富的一類生物大分子復(fù)合物，也是重要的生物高分子化合物和重要的信息分子。多糖及其復(fù)合物分布廣泛，它們參與了細胞各種生命活動的調(diào)節(jié)，具有多種多樣的生物學(xué)功能，如免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用[3-7]，已廣泛用于醫(yī)藥和食品行業(yè)。

小果雪兔子屬菊科鳳毛菊屬雪兔子亞屬植物，是通稱雪蓮的一種，為我國名貴中草藥，因其良好的藥用價值，一直是人們研究的重點。關(guān)于雪蓮藥用化學(xué)成分研究較多的有天山雪蓮、雪兔子、新疆雪蓮、綿頭雪蓮、水母雪蓮、星狀雪兔子和叢株雪兔子等，其化學(xué)成分含有黃酮類、生物堿、內(nèi)酯、甾醇、多糖及揮發(fā)油等多種成分[8-11]，關(guān)于小果雪兔子的相關(guān)研究未見報道，本文以小果雪兔子為研究材料，對其揮發(fā)油和多糖進行初步分析，以期為小果雪兔子的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1.實驗材料與方法

(1)實驗材料

小果雪兔子：采自在西藏日喀則崗巴縣，干燥后粉碎備用。

(2)儀器與試劑

GCMS-QP2010S氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津），F(xiàn)A1004型電子天平（上海恒平）；HH.S21-6電子恒溫水浴鍋（上海博迅）；Avanti JXN-26離心機(德國貝克曼)；Genesys180分光光度計（美國賽默飛）。

葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、肌醇（購自中國藥品生物制品鑒定所）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

(3)小果雪兔子揮發(fā)油的提取

將5.00g小果雪兔子樣品置于500mL圓底燒瓶中，加入100mL蒸餾水，利用水蒸汽蒸餾法提取揮發(fā)油，提取時間為3h。餾出液以乙醚萃取后，經(jīng)無水硫酸鈉干燥，揮去乙醚，得具微香氣味的淡黃色揮發(fā)油成分，用1mL二氯甲烷溶解備用。

(4)小果雪兔子揮發(fā)油的GC-MS分析

色譜條件：色譜柱：RTX-5MS（30m×0.25mm，0.25μm）彈性石英毛細管柱；進樣口溫度：280℃；升溫程序：50℃保持4min，以8℃/min升至150℃，保持6min，然后以10℃/min的速度升到300℃，保持15min；載氣（He）流速1mL/min，進樣量0.1μL；分流比：25:1。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源；電子能量70eV；傳輸線溫度250℃；離子源溫度250℃；質(zhì)量掃描范圍m/z40～550。

(5)小果雪兔子多糖的提取

稱取小果雪兔子樣品10.00g，按1:10的比例加入蒸餾水，80℃水提3h，過濾，重復(fù)3次，合并濾液，濾液濃縮至原體積的1/10。4000r/min離心5min，去除雜質(zhì)，上清液加95%工業(yè)酒精，使乙醇終濃度達80%，4℃醇析12h，4000r/min離心10min，去除上清液，依次用95%工業(yè)酒精、無水乙醇、丙酮洗滌一次，離心，真空干燥，得小果雪兔子粗多糖。

(6)小果雪兔子總糖含量測定

①標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品5.20mg，加適量蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移到50mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，得濃度為0.104mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，加蒸餾水補至1.0mL，分別加入6%的苯酚溶液1mL和濃硫酸2.5mL，以隨行試劑為空白液，在水浴鍋中煮沸15min取出，冷卻15min后，于490nm波長測其吸光值，并以490nm吸光值對葡萄糖含量（μg）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程y=0.0053x+0.0043（R2=0.9969）。

②小果雪兔子粗多糖總糖含量測定

稱取小果雪兔子粗多糖4.90mg，用蒸餾水定容至50mL。精密量取1.0mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法測定490nm波長處吸光值。

(7)單糖組成分析

①單糖標(biāo)準(zhǔn)品的乙?；揎?/p>

將單糖標(biāo)準(zhǔn)品（葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖、鼠李糖及內(nèi)標(biāo)肌醇于試管中）；加入1mL 0.1mol/L Na2CO3，30℃干燥箱保溫50min；加KBH 450mg，室溫放置1.5h；25%乙酸中和KBH4，并用陽離子交換樹脂除鹽；用甲醇除酸至中性；將干燥物85℃真空加熱2h；加入0.5mL無水吡啶和0.5mL無水乙酸酐，90℃保溫1h，干燥；加入1mL無水二氯甲烷溶解，離心待測。

②樣品的預(yù)處理

小果雪兔子粗多糖（10mg）經(jīng)2mol/L三氟乙酸120℃封管水解3h，用無水乙醇蒸除三氟乙酸至中性；水解產(chǎn)物的乙酰化修飾方法同單糖標(biāo)準(zhǔn)品。

③氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析（GC/MS）

色譜條件：色譜柱：RTX-5MS（30m×0.25mm，0.25μm）彈性石英毛細管柱；進樣口溫度：280℃；升溫程序：120℃保持2min，以5℃/min升至195℃，保持4min，然后以4℃/min的速度升到220℃，保持3min；再以30℃/min的速度升到300℃，保持5min；載氣（He）流速1mL/min，進樣量0.1μL；分流比：25:1。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源；電子能量70eV；傳輸線溫度250℃；離子源溫度200℃；質(zhì)量掃描范圍m/z40～550。

2.結(jié)果與分析

(1)小果雪兔子揮發(fā)油含量

經(jīng)1.3中提取出小果雪兔子揮發(fā)油0.034g，得率為0.68%。

(2)小果雪兔子揮發(fā)油化學(xué)成分分析

按照色譜-質(zhì)譜條件對提取的揮發(fā)油進行分析，共分離出45種化學(xué)成分，各色譜峰相應(yīng)的質(zhì)譜圖經(jīng)人工解析及NIST05s譜庫檢索，鑒定出14種個化合物，用峰面積歸一法計算出各成分的相對質(zhì)量百分含量（圖1、圖2和表1）。結(jié)果顯示，小果雪兔子揮發(fā)油主要以酯類、有機酸類、烷烴類、醇類化合物為主，所鑒定化學(xué)成分占揮發(fā)油色譜峰面積的20.8%。其主要成分為正十一烷酸（3.19%）、正十九烷酸（1.87%）、正二十二烷（1.18%）、正二十三烷（1.91%）、正二十四烷（2.06%）、正十七烷（4.82%）、正二十五烷（2.87%）、正三十四烷（1.96%）、鄰苯二甲酸單（2-乙基己基）酯（1.17%）等。

表1 小果雪兔子成分GC/MS分析結(jié)果

圖1 小果雪兔子揮發(fā)油GC/MS總離子流圖-1（保留時間20～33min）

圖2 小果雪兔子揮發(fā)油GC/MS總離子流圖-2（保留時間35～44min）

從小果雪兔子揮發(fā)油中鑒定出的14種化合物中，主要的活性成分有α-杜松醇和六氫假紫羅蘭酮。Chang S T[12]研究表明α-杜松醇具有強烈的殺螨活性。古喬云[13]發(fā)現(xiàn)α-杜松醇具有抑菌活性，可以有效抑制金色葡萄球菌、抗藥性金黃色葡萄球菌和糞腸球菌。六氫假紫羅蘭酮在生物體內(nèi)則用于維生素E和維生素K的合成。本研究的實驗結(jié)果表明小果雪兔子揮發(fā)油具有一定的殺菌、殺蟲活性，為小果雪兔子揮發(fā)油的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

(3)小果雪兔子粗多糖含量測定

利用苯酚-硫酸法測定小果雪兔子粗多糖樣品中總糖含量，結(jié)果為54.81%。

(4)小果雪兔子粗多糖單糖組成分析

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定粗多糖樣品中單糖組成，小果雪兔子粗多糖樣品的單糖組成信息由標(biāo)準(zhǔn)單糖總離子流程圖中各峰的保留時間和質(zhì)譜信息綜合分析得到，結(jié)果見圖3和表2，由表可知，小果雪兔子多糖樣品主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖6種單糖組成，其摩爾比例為3.97:7.33:2.91:1:5.45:7.03。

圖3 小果雪兔子粗多糖單糖組成GC/MS總離子流程圖

表2 小果雪兔子粗多糖單糖組成

通過本研究，我們得到了小果雪兔子粗多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖組成，從實驗結(jié)果可知，該粗多糖中不含有帶電荷單糖，不便使用離子交換的方式純化該粗多糖，只能利用該粗多糖中各多糖組分分子量的差異不同進行凝膠層析。

3.結(jié)論

從小果雪兔子揮發(fā)油中鑒定出的14種化合物中，存在具有強烈殺螨作用的α-杜松醇和具有抑菌作用的六氫假紫羅蘭酮，說明小果雪兔子揮發(fā)油具有一定的殺菌、殺蟲活性，為小果雪兔子揮發(fā)油的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。小果雪兔子粗多糖中主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖6種單糖組成，其摩爾比例為3.97:7.33:2.91:1:5.45:7.03，研究結(jié)果將為小果雪兔子多糖的純化和結(jié)構(gòu)分析奠定基礎(chǔ)。