microRNA-10調(diào)控PTEN基因在促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖和遷移的作用*

劉玉蘭 何鳳屏 郭偉強(qiáng) 劉英 黃從云 李定云 黃亮 陳曉旋

胰腺癌是世界上最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一[1]。近年來(lái)，隨著我國(guó)人民的生活節(jié)奏加快及飲食結(jié)構(gòu)的改變，胰腺癌發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)。目前的腫瘤標(biāo)志物CEA 和CA-199 聯(lián)合檢測(cè)對(duì)胰腺癌診斷的靈敏度僅為45%左右[2]，特別需要一種敏感性和特異性高的標(biāo)志物。microRNA（miRNA）是一類(lèi)非編碼小分子的18～24 個(gè)核苷酸的單鏈RNA。miRNA 通過(guò)降解或抑制mRNA 的翻譯來(lái)抑制靶基因的表達(dá)[3]。miRNA 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到調(diào)控靶基因的重要作用[4]。張力蛋白同源物基因（PTEN）是腫瘤抑制基因，具有脂質(zhì)和蛋白雙重磷酸活性，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、生存、凋亡、血管生成、細(xì)胞遷移和侵襲等方面發(fā)揮重要作用[5]。PTEN在腫瘤中表達(dá)下調(diào)或者發(fā)生缺失突變時(shí)，可激活PI3K/Akt 信號(hào)通路，從而引起腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移[6]。

miRNA 能在腫瘤組織內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，還能穩(wěn)定存在于血清、血漿、全血中[7-9]，可作為一種無(wú)創(chuàng)的腫瘤診斷標(biāo)志物。Liu 等[10]研究發(fā)現(xiàn)miRNA在胰腺癌患者循環(huán)血中的表達(dá)明顯上調(diào)，但是，miRNA-10 調(diào)控PTEN 促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖和遷移的作用機(jī)制未見(jiàn)有報(bào)道。因此，本文通過(guò)研究miRNA-10 調(diào)控PTEN 在胰腺癌的表達(dá)、與病理分期的相關(guān)性以及生物學(xué)功能，為預(yù)測(cè)患胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后監(jiān)測(cè)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 在粵北人民醫(yī)院肝膽外科選取2017 年3 月-2019 年9 月住院并病理診斷證實(shí)為胰腺癌的患者80 例作為研究組，所有患者術(shù)前均未接受放射治療、化學(xué)藥物、免疫治療。另選取同期健康體檢者80 例作為對(duì)照組。（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理確診為胰腺癌；②未經(jīng)任何放療、化療等治療。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤病史；②家族遺傳性糖尿病。本研究已通過(guò)汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2 試劑及儀器 總RNA 提取試劑盒、qRT-PCR試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒由上海生工生物工程股份有限公司提供，miRNA-10 和PTEN 試劑盒與內(nèi)參U6上下游引物由廣州銳博生物有限公司提供。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)使用BIO-RAD CFX96 型儀器（美國(guó)BIO-RAD 公司）。

1.3 方法

1.3.1 采集樣本 所有研究對(duì)象靜脈采血3 mL，采用EDTA 抗凝劑，在3 300 r/min 下離心16 min，然后，選取血漿，放置于Eppendorf 管，在10 ℃的環(huán)境下，進(jìn)行15 000 r/min 離心7 min，去除雜質(zhì)和細(xì)胞碎片，將血漿于-80 ℃冰箱保存及以備。選取胰腺原發(fā)腫瘤組織及距離腫瘤邊緣至少5 cm 的癌旁正常組織，在12 min 內(nèi)放置液氮保存。取液氮保存胰腺組織約500 mg，研磨至極細(xì)碎末狀，加入1 mL Trizol，用于提取總RNA。

1.3.2 總RNA 提取 在凍存的血漿進(jìn)行復(fù)溫，嚴(yán)格按照提取RNA 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。采用紫外分光光度儀測(cè)定所提取RNA 的濃度及純度，其A260/A280 比值應(yīng)在1.5～2.0 間，用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中的特異性反轉(zhuǎn)錄引物和合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄體系20 μL，逆轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。

1.3.4 qPCR 反應(yīng) qPCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.5 胰腺癌細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1 細(xì)胞加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培 養(yǎng) 液10 mL，4 ℃以800 r/min 離 心5 min，棄去上清液，重懸后將細(xì)胞加入RPMI 1640 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)傳代。（1）四甲基偶氮唑鹽（4-methylcyclohexanone，MTT）法檢測(cè)細(xì)胞增殖[10]：分別以每孔103細(xì)胞密度將3 組人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1 細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板，以培養(yǎng)液為空白對(duì)照，分別培養(yǎng)1、2、3、4 d。每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜150 μL，振蕩、室溫孵育10 后，測(cè)定波長(zhǎng)493 nm 處各孔吸光度（A 值）。繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線是根據(jù)時(shí)間擬為橫坐標(biāo)，根據(jù)A 值擬為縱坐標(biāo)。（2）克隆形成實(shí)驗(yàn)：以100、200、400 個(gè)細(xì)胞的密度分別將3 組人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1 細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，靜止培養(yǎng)2 周。當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)（≥50 個(gè)細(xì)胞的為一個(gè)克?。?，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液。平板克隆形成率=形成克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。（3）劃痕實(shí)驗(yàn)：收集各組細(xì)胞，以5×103/L 密度接種于96 孔板中，待細(xì)胞融合約90%，用槍頭沿著與皿底垂直方向劃痕，PBS 洗滌3 次，加入無(wú)血清培養(yǎng)基，放置在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱24 h 后，觀察細(xì)胞遷移軌跡，拍照記錄。

1.4 靶基因的預(yù)測(cè) 應(yīng)用生物信息學(xué)軟件TargetScan 6.2、miRDB 和PicTar 預(yù)測(cè)miRNA-10 的靶基因，發(fā)現(xiàn)PTEN 基因可能為其潛在的靶基因。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Spearman 分析CRC 患者血清miRNA-10 與PTEN 表達(dá)水平的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 研究組，男50 例，女30 例；年齡37～68 歲，平均（57.91±5.36）歲；根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）和國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）胰腺癌TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)[10]：Ⅰ期3 例，Ⅱ期27 例，Ⅲ期28 例，Ⅳ期22 例。對(duì)照組，男45 例，女35 例；年齡45～65 歲，平均（56.39±5.24）歲。兩組性別、年齡比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 兩組血漿中miRNA-10 和PTEN mRNA 的表達(dá)水平比較 經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)，結(jié)果顯示研究組血漿中miRNA-10 mRNA 表達(dá)水平為（5.37±1.48），高于對(duì)照組的（0.46±0.24），PTEN mRNA表達(dá)水平為（0.34±0.13），低于對(duì)照組的（7.86±1.64），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=23.69，P=0.000；t=29.18，P=0.000）。

2.3 研究組組織中miRNA-10、PTEN mRNA 表達(dá)與病理特征及臨床分期的關(guān)系 不同TNM 分期患者miRNA-10、PTEN mRNA 表達(dá)水平：Ⅰ期為（2.26±1.09）、（0.83±0.47），Ⅱ期 為（3.17±1.83）、（0.58±0.31），Ⅲ期 為（5.04±2.06）、（0.29±0.16），Ⅳ期為（6.13±2.47）、（0.29±0.16）。不同TNM 分期患者miRNA-10 和PTEN mRNA 表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=820，P=0.000；F=1 170，P=0.000）。

2.4 miRNA-10 和PTEN mRNA 在胰腺癌患者血漿中表達(dá)的相關(guān)分析 miRNA-10 和PTEN mRNA 在胰腺癌患者血漿中表達(dá)呈線性負(fù)相關(guān)（r=-0.716，P<0.01）。

2.5 miRNA-10 在胰腺癌患者血漿和組織中表達(dá)的相關(guān)分析 胰腺癌患者血漿中miRNA-10 的表達(dá)與癌組織中的miRNA-10 表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.938，P<0.01）。

2.6 miRNA-10 過(guò)表達(dá)對(duì)PANC-1 細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 MTT 法檢測(cè)結(jié)果顯示，miRNA-10 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h 的A 值（10.92±1.68、19.85±2.43、25.07±3.52、33.49±4.82）均高于對(duì)照組（2.432±0.261、4.471±0.343、4.896±0.392、4.765±0.384），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.008，P=0.047；t=12.609，P=0.006；t=31.387，P=0.000；t=42.698，P=0.000），見(jiàn)圖1。

圖1 轉(zhuǎn)染miRNA-10 mimics分別在不同時(shí)間的PANC-1細(xì)胞生長(zhǎng)

2.7 miRNA-10 過(guò)表達(dá)對(duì)PANC-1 細(xì)胞增殖的影響 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示：miRNA-10轉(zhuǎn)染2 周后，miRNA-10 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆數(shù)為（380±84）個(gè)，明顯高于對(duì)照組（70±17）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=36.26，P=0.000）。

2.8 miRNA-10 和PTEN 對(duì)PANC-1 細(xì)胞遷移的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染miRNA-10 分別在24、48 h 的PANC-1 細(xì)胞中，miRNA-10 劃痕間距為（168.29±8.92）和（141.36±4.86）μm，與對(duì)照組的（375.43±19.25）和（368.62±17.71）μm比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=18.293，P=0.000；t=16.897，P=0.000）；PTEN 組為（368.34±18.34）和（359.37±18.38）μm，與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.113，P=0.910；t=0.209，P=0.834），見(jiàn)圖2。

圖2 miRNA-10和PTEN對(duì)PANC-1細(xì)胞遷移的影響

3 討論

由于miRNA-10 在多種惡性腫瘤組織中的表達(dá)具有促癌基因的活性，主要通過(guò)對(duì)下游靶分子轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控發(fā)揮生物效應(yīng)[12]。miRNA-10 的表達(dá)與乳腺癌、肺癌、肝癌等惡性腫瘤的發(fā)病有密切關(guān)系[13]，特別是miRNA-10 在調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖和遷移這一方面起到至關(guān)重要的作用。國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)miRNAs 在胰腺癌患者的表達(dá)上調(diào)[14]，但是目前胰腺癌的發(fā)病機(jī)制仍未清楚。為了進(jìn)一步研究miRNA-10 在胰腺癌中的作用機(jī)制，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)胰腺癌患者血漿和組織中miRNA-10 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)血漿miRNA-10 與胰腺癌病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，隨著腫瘤惡性度的升高，miRNA-10 表達(dá)逐步增高，在胰腺癌伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者miRNA-10 表達(dá)明顯增高，并與分化程度相關(guān)，miRNA-10 的表達(dá)水平在低分化腫瘤組織中高于高分化者。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)miRNA-10 的表達(dá)在胰腺癌患者的血清中與癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.938）。國(guó)外學(xué)者也發(fā)現(xiàn)miRNA-10 表達(dá)水平與治愈率和生存率呈負(fù)相關(guān)，上述的研究結(jié)果表明了血漿miRNA-10 的表達(dá)水平在胰腺癌的發(fā)展及惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，可作為胰腺癌患者預(yù)后評(píng)價(jià)的指標(biāo)。

miRNA 通過(guò)調(diào)控結(jié)合靶基因而發(fā)揮作用，miRNA-10的靶基因 有PTEN，RECK，TIMP-3，SPRY1、PI3K/AKT、Wnt/β-catenin[15]。有研究認(rèn)為PTEN 是miRNA-10的靶基因，miRNA-10 高表達(dá)能促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[16]。Lee 等[17]采用敲除PTEN 基因發(fā)現(xiàn)增加腫瘤細(xì)胞的惡性程度，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。Jiang 等[18]研究胰腺癌患者的PTEN 基因突變?cè)谀[瘤Ⅲ分期患者居多，隨著腫瘤浸潤(rùn)深度增加其預(yù)后就較差。本課題組通過(guò)對(duì)多種靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)張力蛋白同源物基因（PTEN）可能是miRNA-10 的下游靶點(diǎn)，PTEN 是腫瘤抑制基因，具有脂質(zhì)和蛋白雙重磷酸活性，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、生存、凋亡、血管生成、細(xì)胞遷移和侵襲等方面發(fā)揮重要作用。PTEN 在腫瘤中表達(dá)下調(diào)或者發(fā)生缺失突變時(shí)，可激活PI3K/Akt 信號(hào)通路，從而引起腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移。

PTEN 基因是目前發(fā)現(xiàn)的具有磷酸激酶活性的抑癌基因，人類(lèi)許多惡性腫瘤中存在著PTEN 功能的失活，并與腫瘤進(jìn)展有密切相關(guān)[19]。Zhang等[20]檢測(cè)胰腺癌癌組織PTEN 蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與癌旁正常組織（對(duì)照組）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），提示PTEN 蛋白表達(dá)下調(diào)在胰腺癌癌的發(fā)生過(guò)程中起到極為不良的事件。因此，PTEN 表達(dá)水平下調(diào)提示在一定的程度上促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤轉(zhuǎn)移。結(jié)合本研究發(fā)現(xiàn)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)PTEN mRNA 的表達(dá)量，隨著病情進(jìn)展，胰腺癌細(xì)胞增殖越活躍、分化程度越低，惡性程度就越高、PTEN mRNA 的表達(dá)呈下降趨勢(shì)，提示PTEN 表達(dá)下調(diào)與胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖有密切相關(guān)，Ⅰ期和 Ⅱ期分別與Ⅲ期和 Ⅳ期比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01和P<0.001）。近期Zou等[21]研究表明ncRNACASC2 上調(diào)PTEN 的活性，抑制PI3K-Akt 通路的作用，通過(guò)改善細(xì)胞和細(xì)胞間質(zhì)的相互作用，減弱腫瘤細(xì)胞的侵襲性。本研究結(jié)果也顯示，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組PTEN mRNA 明顯低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P<0.001）。在T 分期的Ⅰ期→Ⅳ期胰腺癌組織PTEN mRNA 表達(dá)逐步下降（P<0.001）。以上結(jié)果表明在高侵襲、高轉(zhuǎn)移性的胰腺癌組織中的表達(dá)明顯降低或無(wú)表達(dá)，提示PTEN 表達(dá)的下調(diào)可能是腫瘤的侵襲程度和轉(zhuǎn)移增加的主要原因之一，促進(jìn)胰腺癌發(fā)展和轉(zhuǎn)移的作用。因此，PTEN 基因在一定程度上反映胰腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力等生物學(xué)行為特征[22]?？傊?，隨著病情進(jìn)展，患者的生存率下降，預(yù)示著患者預(yù)后極差。

Ma 等[23]研究表明miRNA-10 通過(guò)調(diào)控通路提高細(xì)胞轉(zhuǎn)移蛋白的表達(dá)水平而影響腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。Aguennouz 等[24]研究指出miRNA-10 與細(xì)胞轉(zhuǎn)移蛋白是相關(guān)聯(lián)基因，具有促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤侵襲的作用，設(shè)想在胰腺癌中也會(huì)存在這種效應(yīng)。本研究對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)表明：在miRNA-10的細(xì)胞轉(zhuǎn)染加速PANC-1 細(xì)胞生長(zhǎng)；在細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)證實(shí)miRNA-10 過(guò)表達(dá)對(duì)PANC-1 細(xì)胞的增殖具有明顯促進(jìn)的影響；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染 miRNA-10 的PANC-1 細(xì)胞遷移能力高于PTEN 組和對(duì)照組。國(guó)外研究顯示miRNA-10 在細(xì)胞株和腫瘤組織呈高表達(dá)水平，并與患者的生存率成反比，提示miRNA-10 與腫瘤浸潤(rùn)有密切相關(guān)[25]。本文采用qPCR 技術(shù)檢測(cè)胰腺癌患者血漿和組織中miRNA-10 的表達(dá)明顯上調(diào)，并發(fā)現(xiàn)血漿miRNA-10 與胰腺癌病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，隨著腫瘤惡性度的升高，miRNA-10 表達(dá)逐步增高，病理分期Ⅲ、Ⅳ期明顯高于Ⅰ、Ⅱ期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。上述研究結(jié)果表明血漿miRNA-10 的水平可作為胰腺癌患者預(yù)后評(píng)價(jià)的指標(biāo)。本研究通過(guò)采用劃痕實(shí)驗(yàn)研究miRNA-10 mimic 調(diào)控PTEN 在胰腺癌PANC-1 細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖能力水平，提示了miRNA-10 有很強(qiáng)的促進(jìn)胰腺癌PANC-1 細(xì)胞的遷移能力，表明miRNA-10 高表達(dá)和PTEN 低表達(dá)均能夠明顯增加腫瘤細(xì)胞的遷移，這可能是由于miRNA-10 下調(diào)PTEN 基因，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力。本文結(jié)果顯示miRNA-10 在胰腺癌患者血漿中的表達(dá)水平明顯高于健康對(duì)照組；PTEN 基因在胰腺癌患者血漿中的表達(dá)水平明顯低于健康對(duì)照組。兩者在胰腺癌患者血漿的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.916），表明miRNA-10 負(fù)性調(diào)控PTEN 表達(dá)可能在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展及惡化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，miRNA-10 可以促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖和調(diào)控細(xì)胞凋亡過(guò)程，提示miRNA-10 在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，PTEN 可能是miRNA-10 作用靶點(diǎn)，miRNA-10 的作用是通過(guò)負(fù)性調(diào)控PTEN 基因參與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移，為胰腺癌的輔助診斷提供一個(gè)新的檢測(cè)指標(biāo)，也為胰腺癌基因治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。