褪黑素和TGF-β信號通路與滋補(bǔ)肝腎中藥治療PD分子機(jī)制的關(guān)聯(lián)性*

宋芳 張倩 孫小慧 畢研艷 張念平 焉兆利

帕金森?。≒arkinson disease，PD）是常見的神經(jīng)退行性疾病，其病理改變?yōu)橹心X黑質(zhì)多巴胺（dopamine，DA）能神經(jīng)元喪失、神經(jīng)元胞漿內(nèi)含有α-突觸核蛋白（α-synuclein，α-syn）的路易小體形成。臨床表現(xiàn)為靜止性震顫、肌肉強(qiáng)直、運(yùn)動遲緩、姿勢步態(tài)異常等運(yùn)動障礙癥狀，以及認(rèn)知和行為障礙、自主神經(jīng)功能紊亂和睡眠障礙等非運(yùn)動障礙癥狀[1]。

藥物是目前治療PD 的主要手段，這些藥物大多數(shù)為DA 能藥物（如左旋多巴，L-DOPA），它們可通過增加紋狀體內(nèi)DA 水平起到治療作用。這些藥物早期可以很好地控制癥狀，但隨著時(shí)間的推移，由于非生理性DA 濃度波動、脫靶效應(yīng)，這些藥物逐漸失去療效并產(chǎn)生很多副作用[2]。中藥具有多途徑、多靶點(diǎn)的作用機(jī)制，治療PD 有獨(dú)特優(yōu)勢。臨床上主要是通過辨證論治，應(yīng)用不同類型的中藥方劑治療PD。盡管中醫(yī)界對PD 的病機(jī)和證型尚存爭論，但眾多醫(yī)家認(rèn)為肝腎陰虛是PD 的病理基礎(chǔ)和核心病機(jī)，又是PD 的主要證型[3]。根據(jù)此證型使用不同的滋補(bǔ)肝腎中藥（如補(bǔ)腎養(yǎng)肝熄風(fēng)方、左歸丸加減、熄風(fēng)定顫丸等）治療PD，均取得了良好的臨床效果[4-7]。但滋補(bǔ)肝腎中藥治療PD 的分子機(jī)制仍不完全清楚，進(jìn)行這方面研究具有重要意義，可以為藥物研發(fā)、辨證論治提供依據(jù)。

1 滋補(bǔ)肝腎中藥治療PD的理論依據(jù)

中醫(yī)認(rèn)為PD 屬顫病、顫振、震顫等范疇，又稱振掉、內(nèi)風(fēng)，《素問·五常政大論》曰：“掉眩巔疾”“其病動搖”“掉振鼓栗”[8]。多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為顫病病位在腦，主要與肝、腎等臟腑功能失調(diào)有關(guān)，如《素問·至真要大論》云：“諸風(fēng)掉眩，皆屬于肝”，《赤水玄珠·顫振門》注：“顫振者，非寒噤鼓慄，乃木火上盛，腎陰不充”[9]。顫病主要發(fā)生于老年人，年老肝腎自虧，腎水不能滋養(yǎng)肝木，木燥而生風(fēng)致顫。此外，腎主藏精，精生髓，腦為髓之海，故腎精不足，可致髓海失充，神機(jī)失用，肢體失控，出現(xiàn)肢體震顫、拘攣?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實(shí)肝腎陰虛是PD 的基礎(chǔ)，是其發(fā)病的根本病機(jī)，肝腎陰虛貫穿于PD 患者的整個(gè)疾病過程[6]。故在PD 治療上應(yīng)當(dāng)注重填精益髓，滋肝補(bǔ)腎，應(yīng)用滋補(bǔ)肝腎中藥可以緩解患者的臨床癥狀。

2 肝陰、腎陰可能與褪黑素（melatonin，MLT）和TGF-β通路存在聯(lián)系

MLT 是松果體在夜間分泌的一種神經(jīng)激素，易通過血腦屏障，有抗氧化、抗炎癥反應(yīng)、神經(jīng)保護(hù)、抑制生殖系統(tǒng)發(fā)育、延緩衰老、調(diào)節(jié)骨骼生長、調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律等作用[10-11]。王劍等[12]提出MLT 的生理功能與腎陰功能相似：MLT 分泌量晝少夜多，冬季高于夏季，與中醫(yī)“夜主陰，晝主陽”“腎主冬”理論相符；隨年齡增長MLT 分泌下降，與中醫(yī)理論“人至四十而陰氣自半”相符；MLT 對神經(jīng)系統(tǒng)有鎮(zhèn)靜作用，符合中醫(yī)理論“陰主靜”的闡釋；青春期前MLT 抑制性腺發(fā)育，可解釋中醫(yī)腎主生殖，腎陰對腎陽溫煦、激發(fā)、興奮的功能有抑制作用；MLT是強(qiáng)效抗氧化劑，有親脂和親水的特點(diǎn)，易進(jìn)入任何細(xì)胞保護(hù)亞細(xì)胞成分免被自由基氧化損傷，這對應(yīng)中醫(yī)理論腎陰滋養(yǎng)全身的作用。TGF-β 信號通路在細(xì)胞的生長、增殖、遷移、分化、存活和凋亡等方面發(fā)揮重要作用[13]。研究表明，TGF-β 信號通路也與腎陰關(guān)系密切。補(bǔ)腎中藥可能通過激活TGF-β 信號通路并上調(diào)關(guān)鍵效應(yīng)因子Smad3 及轉(zhuǎn)錄因子GATA-4 的表達(dá)，進(jìn)而改善腎陰虛狀態(tài)[14]。腎陰與肝陰密切相關(guān)：中醫(yī)認(rèn)為“肝腎同源、精血同源”。腎為五臟之本，腎藏精，肝藏血，腎為肝之母，母子相生，精血同源，肝陰和腎陰相互滋養(yǎng)。雖然肝和腎的結(jié)構(gòu)和功能有所差異，但起源相同，故生理病理相關(guān)，治療疾病時(shí)可采用“肝腎同治”的方法。故MLT、TGF-β 信號通路可能與肝陰、腎陰有著密切關(guān)系。

3 MLT保護(hù)DA能神經(jīng)元的作用機(jī)制

氧化應(yīng)激是PD 重要的發(fā)病機(jī)制之一。MLT 的抗氧化能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于維生素C 和E，它能直接去除活性氧（reactive oxygen species，ROS），抑制促氧化酶，促進(jìn)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）等抗氧化酶的基因表達(dá)，減少細(xì)胞氧化損傷[15]。MLT 可以不依賴受體，以其自身化學(xué)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)發(fā)揮直接抗氧化作用：MLT 可以向自由基提供一個(gè)或多個(gè)電子，從而中和其氧化活性，MLT 還能與其他抗氧化分子如抗壞血酸協(xié)同來發(fā)揮抗氧化作用[16]。MLT 還可通過其代謝產(chǎn)物間接發(fā)揮抗氧化作用，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生存。N1-乙酰基-N2-甲?；?5-甲氧基犬尿胺（N1-acetyl-N2-formyl-5-methoxykynuramine，AFMK）和N1-乙?；?5-甲氧基犬尿胺（N1-acetyl-5-methoxykynuramine，AMK）都是MLT 的代謝產(chǎn)物，并且都存在于腦內(nèi)。AFMK 和AMK 均被認(rèn)為是有效的抗氧化劑，具有清除自由基和激活自由基清除級聯(lián)反應(yīng)的能力[11]。自噬-溶酶體系統(tǒng)、分子伴侶介導(dǎo)的自噬、泛素-蛋白酶體系統(tǒng)等蛋白清除途徑受損可導(dǎo)致神經(jīng)毒性α-syn 寡聚體的積累和擴(kuò)散，毒性α-syn 通過聚集、纖維化，最后產(chǎn)生路易小體，介導(dǎo)DA 神經(jīng)元的變性死亡。MLT 被證實(shí)能抑制α-syn 聚集，它通過抑制α-syn 原纖維形成和二級結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變來阻止α-syn 形成，并降低其誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，防止神經(jīng)細(xì)胞變性[17]。炎癥反應(yīng)在神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生和進(jìn)展中也起重要作用。最新證據(jù)表明MLT 作為細(xì)胞保護(hù)分子能減緩炎癥衰老的過程。MLT 及其犬尿胺代謝產(chǎn)物可以預(yù)防興奮性毒性，減少自由基負(fù)荷并減少促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生。MLT 也能與金屬結(jié)合，通過形成螯合物來減少羥基自由基的損傷，從而減輕金屬毒性。MLT 還有抗亞硝化作用，還可以通過阻止蛋白質(zhì)復(fù)合物與DNA結(jié)合以抑制核因子κB（Nuclear factor kappa-B，NF-κB）途徑的激活發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[18]。MLT有助于改善PD 的非運(yùn)動癥狀，如記憶障礙、抑郁、焦慮和睡眠障礙等。多達(dá)65%的患者在出現(xiàn)快速眼動睡眠行為障礙（rapid eye movement sleep behavior disorder，RBD）后的10～13 年發(fā)展為PD，而每天服用MLT 可有效治療RBD。通過淋巴系統(tǒng)清除有害代謝物利于恢復(fù)腦功能，而睡眠不足與淋巴清除率降低存在密切關(guān)系。PD 患者可能存在RBD，給予MLT 后既能保證睡眠又能提高淋巴清除率。另外，在PD 動物模型中，MLT 能恢復(fù)紋狀體的密度，而治療PD 最常用的藥物L(fēng)-DOPA 卻沒有這一療效，這提示MLT 可以作為治療PD 的輔助用藥[17]。大多數(shù)研究認(rèn)為MLT 通過阻止DA 能神經(jīng)元凋亡而改善PD 的運(yùn)動癥狀，但也有研究認(rèn)為MLT 沒有為PD的運(yùn)動癥狀帶來益處。雖然存在這些分歧，但MLT能預(yù)防DA 能神經(jīng)元神經(jīng)變性的觀點(diǎn)已被普遍接受[17]。另外，Bolitho 等[19]報(bào)道使用DA 能藥物治療PD 后，MLT 的分泌顯著增加，提示MLT 與PD可能有潛在的聯(lián)系。文獻(xiàn)報(bào)道的MLT 保護(hù)DA 能神經(jīng)元的作用機(jī)制見圖1。

圖1 與PD相關(guān)的MLT作用機(jī)制

4 TGF-β信號通路對DA能神經(jīng)元發(fā)育和存活的影響

TGF-βs（包括TGF-β1、TGF-β2 和TGF-β3）是具有多種生物活性的多肽生長因子，廣泛分布于各種類型的組織中，調(diào)節(jié)許多細(xì)胞活動進(jìn)程，例如細(xì)胞增殖和分化、轉(zhuǎn)移、新血管形成和免疫抑制[10]。TGF-β 信號通路對DA 神經(jīng)元發(fā)育和存活至關(guān)重要。用TGF-βs 處理中腦腹側(cè)前體細(xì)胞，可增加DA 能神經(jīng)元數(shù)量，而降低內(nèi)源性TGF-βs 則能抑制中腦DA 能神經(jīng)元形成[20]。如果將TGF-β2和TGF-β3 同時(shí)敲除，可導(dǎo)致胚胎期小鼠的DA 能神經(jīng)元凋亡[21]。以轉(zhuǎn)基因手段降低TGF-β 信號傳導(dǎo)，小鼠黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)可出現(xiàn)退化，表現(xiàn)出運(yùn)動障礙癥狀。而在黑質(zhì)中增強(qiáng)TGF-β 信號傳導(dǎo)則可顯著減少1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）誘導(dǎo)的DA 能神經(jīng)變性和運(yùn)動障礙。這表明TGF-β 信號傳導(dǎo)障礙會增加發(fā)生PD 的風(fēng)險(xiǎn)，而激活該通路具有治療PD 的潛力[22]。TGF-β 通路中Smad3 的表達(dá)缺失可導(dǎo)致紋狀體內(nèi)DA 代謝加劇，使DA 能神經(jīng)元逐步喪失，并出現(xiàn)α-syn 聚集[22-23]。研究表明α-syn 對神經(jīng)元突觸有毒性作用，而TGF-β1 可保護(hù)中腦神經(jīng)元免受這種毒害作用，防止突觸喪失[23]。TGF-β1 在黑質(zhì)DA 能神經(jīng)元中大量表達(dá)，呈劑量依賴性地促進(jìn)DA 能神經(jīng)元軸突生長[21]。另外，α-syn 原纖維片段可激活小膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)而激活A(yù)1 型星形膠質(zhì)細(xì)胞，后者產(chǎn)生大量炎癥物質(zhì)，損害突觸形成并誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡。TGF-β1 作為神經(jīng)系統(tǒng)的重要抗炎因子，可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化并阻止A1 星形細(xì)胞產(chǎn)生，從而防止DA 能神經(jīng)元凋亡[23]。小膠質(zhì)細(xì)胞活化后產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)如腫瘤壞死因子TNF-α、白介素IL-1β，和氧化應(yīng)激分子如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶iNOS、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（PHOX），這些物質(zhì)引發(fā)并加重PD[24]。TGF-β1 能調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的活性，減少炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β、IL-6 及NO 的產(chǎn)生，降低神經(jīng)毒性[25]。小膠質(zhì)細(xì)胞通過PHOX 的活化產(chǎn)生ROS，細(xì)胞內(nèi)ROS 的增加可激活NF-κB 途徑，導(dǎo)致大量炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，TGF-β1 可以通過抑制PHOX 來下調(diào)NF-κB 的活性[26]。TGF-β 通路還可能通過以下機(jī)制發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用：TGF-β1 通過激活ERK/MAPK 信號途徑促進(jìn)其磷酸化，使Bcl-2 家族中的Bad 促凋亡蛋白失活；增強(qiáng)TGF-β1 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能上調(diào)Bcl-2 家族中抗凋亡蛋白的表達(dá)，發(fā)揮抗凋亡作用；TGF-β1 還與神經(jīng)營養(yǎng)因子有協(xié)同作用，是FGF-2 和GDNF 等營養(yǎng)因子發(fā)揮作用所必需的輔因子[27]。GDNF 受體GFR-α1 募集到細(xì)胞膜上需要TGF-βs 的參與，降低TGF-βs 則能消除GDNF 對DA 能神經(jīng)元的保護(hù)作用[20]。TGF-β 信號通路影響DA 能神經(jīng)元發(fā)育和存活的相關(guān)機(jī)制，見圖2。

圖2 TGF-β信號通路影響DA能神經(jīng)元發(fā)育和存活的相關(guān)機(jī)制

5 MLT與TGF-β信號通路之間的相互作用

MLT 和TGF-β 信號通路之間有密切的聯(lián)系。研究表明，MLT 對TGF-β 通路有正調(diào)控作用：不管在體內(nèi)還是體外實(shí)驗(yàn)中，MLT 均能上調(diào)胃癌腫瘤 組 織 中TGF-β1 的 表 達(dá)[10]。Proietti 等[28]等 發(fā)現(xiàn)使用MLT 干預(yù)MCF-7 人乳腺癌細(xì)胞后，癌細(xì)胞中TGF-β1 的表達(dá)量明顯上調(diào)，且能被TGF-β1中和抗體完全抑制。MLT 還能以濃度依賴的方式顯著減少骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡，同時(shí)增加營養(yǎng)因子TGF-β1 的表達(dá)，并降低具有激活凋亡功能的Bcl-2 相 關(guān)X 蛋 白（Bcl-2-associated X protein，Bax）的表達(dá)[29]。一定量的TGF-β 對維持正常的軟骨基質(zhì)成分至關(guān)重要，MLT 可能通過上調(diào)TGF-β來達(dá)到刺激軟骨細(xì)胞產(chǎn)生軟骨基質(zhì)成分的作用[30]。MLT 還可以通過上調(diào)TGF-β1 和Ⅱ型膠原蛋白對腫瘤壞死因子TNF-α 介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷起到保護(hù)作用[31]。但也有研究指出MLT 對TGF-β 通路有負(fù)調(diào)控作用：MLT 通過抑制TGF-β1 的表達(dá)和Smad3 的磷酸化抑制肺組織纖維化[32]；MLT 通過抑制TGF-β1/Smad 通路來改善大鼠肝臟纖維化[33]。以上結(jié)果表明在不同細(xì)胞中MLT 對TGF-β 通路的調(diào)控作用不同。在DA 能神經(jīng)元中MLT 對TGF-β通路有何調(diào)控作用尚未見報(bào)道。

6 中藥對MLT和TGF-β信號通路的調(diào)控作用

滋補(bǔ)肝腎中藥影響MLT 和TGF-β 信號通路的報(bào)道較少見，但有文獻(xiàn)[34-35]指出其他中藥可影響MLT 的表達(dá)、調(diào)控TGF-β 信號通路：溫腎類中藥金匱腎氣丸、蛇床子活性組分可以增加大鼠血清中MLT 的含量；陰虛可引起體內(nèi)MLT 水平下降，而滋陰中藥熟地黃可以提高陰虛模型大鼠血清MLT的水平[36]。養(yǎng)血調(diào)肝、健脾利濕中藥當(dāng)歸芍藥散可促進(jìn)老年大鼠松果體分泌MLT，具有清除自由基、神經(jīng)保護(hù)的作用[35]。安神補(bǔ)氣利濕中藥開心散可促進(jìn)神經(jīng)生長、抗氧化、抗炎、抗細(xì)胞凋亡，能增加血漿MLT 及褪黑素受體MT1 的表達(dá)[37]。芪連扶正膠囊的含藥血清可以上調(diào)TGF-β 通路的Ⅰ型受體和Ⅱ型受體，及Smad2、Smad3、Smad4 的表達(dá)，下調(diào)TGF-β1 和Smad7 的表達(dá)，影響TGF-β/Smad通路。姜黃素可減少TGF-β1 表達(dá)，下調(diào)Smad3 表達(dá)，上調(diào)Smad7 表達(dá)。姜黃素還可抑制TGF-β 誘導(dǎo)的Smad2、Smad3 磷酸化及轉(zhuǎn)錄水平[38]。補(bǔ)骨脂素可以激活BMP/Smads 信號通路，促進(jìn)Smad1/5/8的磷酸化及BMP-2 及BMP-4 的蛋白表達(dá)[39]。滋補(bǔ)肝腎中藥是否能影響MLT 表達(dá)、調(diào)控TGF-β 信號通路傳導(dǎo)這一問題值得深入研究。

臨床上滋補(bǔ)肝腎中藥治療PD 取得了良好的效果，通過綜述文獻(xiàn)，滋補(bǔ)肝腎中藥治療PD 的機(jī)制可能與MLT 和TGF-β 信號通路密切相關(guān)。MLT 和TGF-β 激活后引起的抗氧化、抗α-syn 聚集、抗炎癥等信號級聯(lián)反應(yīng)可能是滋補(bǔ)肝腎中藥治療PD的關(guān)鍵所在。在DA 能神經(jīng)元中，MLT 與TGF-β信號通路還可能存在調(diào)控作用。探討滋補(bǔ)肝腎中藥和MLT、TGF-β 信號通路的關(guān)系，一方面可以揭示滋補(bǔ)肝腎中藥引起的相關(guān)因子表達(dá)變化，解釋其作用機(jī)制，另一方面也可以闡明肝腎陰虛證型的分子基礎(chǔ)。