苓桂術(shù)甘湯對慢性心力衰竭大鼠心肌功能及心室重構(gòu)的影響

寇林利，趙明君，魏明明，李瑩超

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712021)

慢性心力衰竭(Chronic heart failure,CHF)是心內(nèi)科常見疾病，各種心臟疾患晚期均會(huì)出現(xiàn)心功能失代償相關(guān)表現(xiàn)，CHF是目前威脅人類健康的重要公共衛(wèi)生問題，全球心力衰竭患者已超過6000萬例，且心衰的發(fā)病率與年齡呈正相關(guān)，每增加10歲發(fā)病率隨之翻一番，且預(yù)后差，病死率高[1-3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為CHF發(fā)病以心室重構(gòu)為主要機(jī)制，臨床對其干預(yù)措施主要為減緩心室重構(gòu)進(jìn)程，緩解患者癥狀，提高生活質(zhì)量。中醫(yī)認(rèn)為“心衰”系心病日久，心絡(luò)“虛”“瘀”相兼，久則發(fā)為以“心悸兼喘息不能平臥，咳吐痰涎，尿少水腫”為主癥的脫證。臨床研究表明，苓桂術(shù)甘湯通過多機(jī)制、多靶點(diǎn)改善心衰患者癥狀及預(yù)后，臨床應(yīng)用廣泛[4-8]。二維斑點(diǎn)追蹤技術(shù)(Two dimensional speckle tracking echocardiography，2D-STE)通過測量標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)態(tài)二維圖像的應(yīng)變，建立二維灰階圖像分析聲學(xué)斑點(diǎn)運(yùn)動(dòng)軌跡來定量評(píng)價(jià)局部和整體心肌功能的無創(chuàng)檢測技術(shù)[9]。本課題旨在通過引入二維斑點(diǎn)追蹤成像技術(shù)定量評(píng)價(jià)苓桂術(shù)甘湯治療慢性心力衰竭大鼠模型的心肌運(yùn)動(dòng)情況，探討苓桂術(shù)甘湯改善慢性心力衰竭大鼠心室重構(gòu)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)SD大鼠[許可證號(hào)SCXK(川)2020-030),成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司]5～7周，共44只，體重190～220 g。納入實(shí)驗(yàn)的大鼠均在陜西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心喂養(yǎng)，給予普通飼料及飲用水飼養(yǎng)7 d后開始用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑：苓桂術(shù)甘湯由陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院自制；注射用鹽酸多柔比星(批號(hào)2020080714)；地高辛(批號(hào)123191105)；ELISA 試劑盒(批號(hào)L211021127)；Masson染液套裝(批號(hào)G1006)；中性樹膠(批號(hào)10004160)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)主要儀器：正置光學(xué)顯微鏡及成像系統(tǒng)(日本尼康公司)；脫水機(jī)(Diapath公司)；包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)；高速組織研磨儀(Sercicebio公司)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(大龍公司)；酶標(biāo)檢測儀(BioTeK公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藥品制備：苓桂術(shù)甘湯由茯苓20 g，桂枝、白術(shù)各15 g，炙甘草10 g組成，于12倍純水中浸泡30 min后按照1∶8比例加水，煎煮2次藥液，1000 r/min，10 min離心，取上清，濃縮至濃度為1 g/ml，存放于4 ℃冰箱備用。

1.2.2 心電圖采集：受檢大鼠連接心電圖，取左側(cè)臥位并調(diào)整導(dǎo)聯(lián)使心率平穩(wěn)后，暴露左室長軸切面，采集心尖四腔及左室短軸乳頭肌，連續(xù)5個(gè)心動(dòng)周期水平切面的二維動(dòng)態(tài)圖像并保存，幀頻180～200幀/s。

1.2.3 二維超聲心動(dòng)圖檢查：于心尖四腔心切面使左室最大程度暴露，記錄大鼠各組左室射血分?jǐn)?shù)(Left ventricular ejection fraction，LVEF)、左室短軸縮短率(Fraction shortening，F(xiàn)S)、左室舒張末內(nèi)徑(Left ventricular end-diastolic internal diameter，LVIDd)、左室收縮末內(nèi)徑(Left ventricular end-systolic internal diameter，LVIDs)相應(yīng)數(shù)值。

1.2.4 2D-STE檢查：于上述1.2.2采集的二維動(dòng)態(tài)圖像中勾勒出心尖左心長軸切面上左室心內(nèi)膜、中段及心外膜大致輪廓，若與實(shí)情不符，則可手動(dòng)調(diào)整心內(nèi)膜及心外膜邊緣曲線，使其寬度盡量與實(shí)際一致。自動(dòng)分析左室室間隔的興趣區(qū)域，使用軟件分析心尖四腔心切面圖像,測量并計(jì)算各節(jié)段平均總應(yīng)變值,獲得左心室室間隔二維應(yīng)變參數(shù)(絕對值)、二維斑點(diǎn)縱向應(yīng)變絕對值(GLS)等相關(guān)指標(biāo)以評(píng)估左室收縮功能。上述檢查均由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的超聲醫(yī)師根據(jù)美國超聲心動(dòng)圖協(xié)會(huì)制定的超聲心動(dòng)圖規(guī)范化操作流程[10]完成，所有數(shù)據(jù)均重復(fù)測量3次，取平均值。

1.3 心衰模型建模方法 配比液：將10 mg注射用鹽酸多柔比星于5 ml滅菌注射用水中混勻，加入0.9%氯化鈉溶液稀釋濃度至2 mg/ml。對需要建模的大鼠給予2 mg/kg的配比液腹腔注射，2次/周，共4周。空白組給予同體積0.9%氯化鈉溶液。定期觀察并記錄大鼠的行為、毛發(fā)色度、液體出入量等變化，初步評(píng)判CHF造模是否成功。造模1周之內(nèi)各組分別行心臟超聲，取得病理學(xué)切片，Masson染色后鏡下對比觀察，進(jìn)一步明確CHF模型是否成功建立。

1.4 分組及干預(yù) 將大鼠隨機(jī)分成空白組、模型組、地高辛組、苓桂術(shù)甘湯組，各11只。根據(jù)人與大鼠體表面積換算公式，苓桂術(shù)甘湯組、地高辛組分別以6.25 g/(kg·d)、0.027 mg/(kg·d)為劑量標(biāo)準(zhǔn)灌胃,空白組、模型組給予等體積0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)灌胃4周。每周稱重1次并記錄，同時(shí)為盡量排除晝夜節(jié)律的影響因素采取固定時(shí)間灌胃。

1.5 血液學(xué)指標(biāo)檢測 各組大鼠在灌胃4周后于心尖部取血，靜置30 min，2000 r/min，離心30 min，取上清，-80 ℃儲(chǔ)存。ELISA實(shí)驗(yàn)中取適量樣本，室溫解凍，以ELISA試劑盒檢測，記錄各組大鼠血漿B型腦鈉肽(B brain natriuretic peptide，BNP)、血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ，Ang-Ⅱ)及內(nèi)皮素1(Endothelin 1，ET-1)水平。

1.6 Masson染色心肌組織 采血完成后盡快取出心臟，0.9%氯化鈉溶液灌流至組織表面顏色灰白，固定于4%多聚甲醛過夜，常規(guī)無水乙醇、包埋、切片，Masson染色，鏡下對比觀察各組大鼠心肌纖維化程度，采集圖像保存分析。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 造模過程中發(fā)現(xiàn)空白組大鼠精神狀態(tài)佳，毛色正常無脫落，食水量、二便均正常，活潑好動(dòng)，由于互相撕咬死亡2只，重新分籠后無死亡發(fā)生。模型組大鼠在造模第1周時(shí)出現(xiàn)飲食、飲水量逐漸減少，造模第2周活動(dòng)逐漸減少，表現(xiàn)為安靜、嗜臥，部分大鼠毛發(fā)逐漸粗糙、變黃及脫落；造模第3周時(shí)出現(xiàn)體重下降，四肢末梢冰涼，皮膚蒼白，毛發(fā)脫落，尤以雙耳后及頸部毛發(fā)脫落較甚，大便較稀軟，大鼠鼻部及眼角出現(xiàn)紅色分泌物；造模第4周模型組大鼠出現(xiàn)腹部膨隆表現(xiàn)。各組直至灌胃給藥結(jié)束后大鼠存活情況：空白組9只，模型組7只，地高辛組、苓桂術(shù)甘湯組，每組6只。

2.2 各組大鼠心肌組織病理學(xué)形態(tài)改變 通過Masson三色法染色分析，并計(jì)算膠原纖維面積占左心室組織面積的百分比后發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，模型組、地高辛組、苓桂術(shù)甘湯組纖維化程度均較高；與模型組比較，地高辛組、苓桂術(shù)甘湯組纖維化程度均低；苓桂術(shù)甘湯組纖維化程度低于地高辛組(圖1)。

A：空白組；B：模型組；C：地高辛組；D：苓桂術(shù)甘湯組圖1 各組大鼠心肌組織病理學(xué)形態(tài)(Masson染色，×200)

2.3 各組大鼠二維超聲結(jié)果比較 造模結(jié)束1周后對各組大鼠行心臟二維B超。與空白組比較，模型組大鼠的LVEF、FS、LVIDd、LVIDs均明顯改變，主要表現(xiàn)為LVEF、FS的顯著降低和LVIDd、LVIDs升高(圖2)。

A：空白組；B：模型組圖2 造模1周后二維超聲判定建模成功

給藥4周后，各組大鼠超聲檢查結(jié)果，見表1。模型組大鼠LVEF、FS值均低于空白組,LVIDd、LVIDs則高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。苓桂術(shù)甘湯組、地高辛組LVEF、FS值均高于模型組，LVIDd、LVIDs均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LVEF、FS、LVIDd、LVIDs在地高辛組與苓桂術(shù)甘湯組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

表1 各組大鼠超聲心動(dòng)圖相關(guān)指標(biāo)比較

二維超聲結(jié)果提示，模型組大鼠心功能受損，左室舒張功能及收縮功能均受到一定程度損害，藥物治療后的大鼠心功能均得到一定程度改善，但較空白組仍有差距。

2.4 各組大鼠血清BNP、Ang-Ⅱ及ET-1比較 見表2。模型組大鼠BNP、Ang-Ⅱ、ET-1均高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。地高辛組、苓桂術(shù)甘湯組BNP、Ang-Ⅱ、ET-1均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。苓桂術(shù)甘湯組ET-1低于地高辛組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠血清BNP、Ang-Ⅱ及ET-1水平比較(ng/L)

2.5 各組大鼠2D-STE應(yīng)變參數(shù)比較 見表3。模型組室間隔二維應(yīng)變參數(shù)各節(jié)段絕對值均低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。地高辛組、苓桂術(shù)甘湯組室間隔二維應(yīng)變參數(shù)各節(jié)段絕對值均高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。地高辛組室間隔二維應(yīng)變參數(shù)基底段、心尖段絕對值均高于苓桂術(shù)甘湯組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。各組大鼠給藥4周后給予二維斑點(diǎn)結(jié)果，與空白組相比，模型組GLS的絕對值較低；與模型組相比，地高辛組、苓桂術(shù)甘湯組GLS絕對值較高；與苓桂術(shù)甘湯組比較，地高辛組GLS絕對值升高(圖3)。

表3 各組大鼠心臟室間隔2D-STE應(yīng)變參數(shù)比較

A：空白組；B：模型組；C：地高辛組；D：苓桂術(shù)甘湯組圖3 各組大鼠給藥4周后二維斑點(diǎn)結(jié)果圖

2.6 各指標(biāo)相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，BNP與GLS之間存在顯著相關(guān)性(r=-0.9447,P<0.01)；Ang-Ⅱ與GLS之間存在顯著相關(guān)性(r=-0.9251,P<0.01)，ET-1與GLS之間存在顯著相關(guān)性(r=-0.9186,P<0.01)。

3 討 論

心肌損傷是CHF發(fā)生發(fā)展的主要環(huán)節(jié)，而抵抗各種損傷的修復(fù)機(jī)制主要表現(xiàn)為心室重構(gòu)[11-12]；目前認(rèn)為心室重構(gòu)主要包括心肌肥大和心肌纖維化[13-14]，是心肌針對機(jī)械或者神經(jīng)刺激做出的代償性反應(yīng)，微觀方面表現(xiàn)為心室心肌細(xì)胞及間質(zhì)的重構(gòu)，宏觀方面以心室擴(kuò)張和心功能衰退為主[15]。數(shù)據(jù)顯示僅以心衰“金四角”，即ACEI/ARNI、β受體阻滯劑、MRA和 SGLT2抑制劑為主要方案的西醫(yī)治療對心衰的反復(fù)住院率及遠(yuǎn)期療效并不明顯[16-19]。而中醫(yī)認(rèn)為心陽不足是心衰的主要病機(jī)，且心陽乃陽中之太陽，可振奮一身之陽[20-21]。因此，心陽虛可逐漸導(dǎo)致肺、脾、腎三臟陽氣皆虛，影響其相應(yīng)生理功能，首當(dāng)其沖是全身津液代謝失調(diào)發(fā)為水腫，苓桂術(shù)甘湯作為經(jīng)典的健脾利水、溫陽蠲飲方劑，在CHF治療中效果可觀，方中重用茯苓健脾利水滲濕，為君藥；配伍桂枝溫心陽以制腎水，助心陽以平?jīng)_降逆,通心陽以消陰翳之痰飲，同時(shí)達(dá)到溫補(bǔ)肺、脾、腎三臟，且能祛除里實(shí)；白術(shù)合茯苓加強(qiáng)培土制水之功,為佐藥；并使以炙甘草辛甘化陽，助藥效發(fā)散。全方共奏助陽化氣之功,使邪從小便而利[22]。

當(dāng)左心室負(fù)荷量及心臟形態(tài)改變時(shí)應(yīng)用二維超聲心動(dòng)圖對心臟結(jié)構(gòu)與功能的評(píng)價(jià)存在一定局限[23]。本研究所用的2D-STE可以對心肌組織進(jìn)行定量分析，通過獲取興趣范圍的心肌組織灰階并自動(dòng)逐幀追蹤此區(qū)域內(nèi)聲學(xué)斑點(diǎn)位置、心動(dòng)周期中的信息對目標(biāo)位置心肌運(yùn)動(dòng)情況進(jìn)行分析，并對大鼠心肌組織進(jìn)行圖像創(chuàng)建，最終獲得牛眼圖。此圖像中主要涉及到心肌組織的運(yùn)動(dòng)、形變及應(yīng)變角度、位移、速度等多方面心肌力學(xué)參數(shù)，精準(zhǔn)辨別心肌不同節(jié)段的異常運(yùn)動(dòng)情況[24-26]。此結(jié)果可最大程度排除心臟整體運(yùn)動(dòng)、室壁運(yùn)動(dòng)夾角、聲束方向等因素的干預(yù)。在心動(dòng)周期中，心肌發(fā)生的應(yīng)變顯著表現(xiàn)在徑向、縱向及圓周運(yùn)動(dòng)三個(gè)矢量方向，通常以心肌縱向應(yīng)變?yōu)橹饕獏⒖糩27-28]。2D-STE檢查目前仍存在一定技術(shù)局限：其一，心肌運(yùn)動(dòng)一般在三維空間觀察其形態(tài)變化，而該檢查技術(shù)僅檢測了心肌縱向、徑向及周向的二維形變情況，而無法全面跟蹤斑點(diǎn)運(yùn)動(dòng)軌跡的空間位置[29-31]；其二，該診斷技術(shù)對圖像質(zhì)量要求極其嚴(yán)苛，必須采取完整的心肌內(nèi)、中、外三層膜，而通常高分辨率的二維圖像可以將心肌節(jié)段運(yùn)動(dòng)進(jìn)行有效追蹤，并掌握整個(gè)檢查時(shí)間段患者的心肌運(yùn)動(dòng)情況[32-34]。

本研究結(jié)果提示，慢性心衰大鼠經(jīng)地高辛、苓桂術(shù)甘湯治療后心功能均得到改善，但地高辛組和苓桂術(shù)甘湯組血清學(xué)LVEF、FS、LVIDd、LVIDs、BNP、Ang-Ⅱ比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而從左心室二維斑點(diǎn)追蹤顯像來看，地高辛組室間隔二維應(yīng)變參數(shù)基底段及心尖段絕對值較高，且GLS絕對值也高于苓桂術(shù)甘湯組；從病理學(xué)分析來看，地高辛組總治療效果優(yōu)于苓桂術(shù)甘湯組。通過將血清學(xué)指標(biāo)BNP、Ang-Ⅱ及ET-1與GLS進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，其結(jié)果驗(yàn)證了苓桂術(shù)甘湯通過調(diào)控RAAS系統(tǒng)來改善左室心肌收縮功能以減輕心室重構(gòu)，延緩心衰進(jìn)程。2D-STE技術(shù)對局部心肌運(yùn)動(dòng)的定量評(píng)價(jià)驗(yàn)證了苓桂術(shù)甘湯調(diào)控神經(jīng)內(nèi)分泌因子改善心肌收縮力，在慢性心力衰竭診斷及療效判定中有重要意義。