桃紅四物湯對(duì)大鼠肢體缺血-再灌注損傷骨骼肌長(zhǎng)鏈非編碼RNA H19、核因子κB-p65表達(dá)的影響

劉宗義，朱付平，李武平

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007)

肢體缺血-再灌注損傷(Limb ischemic reperfusion injury，LI-RI)是肢體缺血損傷和再灌注損傷的合稱，LI-RI多繼發(fā)于擠壓綜合征、動(dòng)脈栓塞、斷肢再植、動(dòng)脈損傷等疾病，致殘率、病死率較高，不僅會(huì)導(dǎo)致患肢出現(xiàn)不可逆性肌肉壞死征象(小腿肌肉僵硬、腫脹、皮膚壞死等)，血流再灌注會(huì)加重?fù)p傷，誘發(fā)全身重要器官衰竭，甚至危及生命。目前，醫(yī)學(xué)界對(duì)于LI-RI的防治措施主要有預(yù)防性的筋膜切開術(shù)[1]、高壓氧治療[2]、基因治療[3]等，但治療成本較高，療效不穩(wěn)定，而且治療LI-RI的具體作用機(jī)制尚未完全闡明。長(zhǎng)期臨床實(shí)踐和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，中醫(yī)藥在防治LI-RI方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[4]，諸多中藥中的有效成分在缺血-再灌注損傷(Ischemia reperfusion injury，IRI)防治中具有廣闊前景[5]。課題組前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，活血化瘀類藥物可通過(guò)調(diào)控Wnt/Ca2+信號(hào)途徑下調(diào)三磷酸肌醇受體(IP3R)、Wnt5a、骨骼肌鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)等蛋白表達(dá)從而減輕LI-RI[4，6]。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA H19(Long non-coding RNA H19，LncRNA H19)是一個(gè)長(zhǎng)度為3.0 kb具有高度進(jìn)化保守性的LncRNA，作為最早發(fā)現(xiàn)的印記基因，LncRNA H19在肢體缺血-再灌注損傷中發(fā)揮重要作用。研究顯示，LncRNA H19的異常表達(dá)與小鼠精原細(xì)胞(GC-1)缺血再灌注損傷密切相關(guān)[7],在機(jī)體重要臟器的缺血-再灌注損傷性疾病的病理機(jī)制研究中，顯示LncRNA H19是IRI的上游關(guān)鍵分子，通過(guò)調(diào)控NF-κB通路表達(dá)降低下游炎癥因子表達(dá)，發(fā)揮著重要的生物調(diào)控功能[7-9]。NF-κB 信號(hào)通路是 Wnt/Ca2+信號(hào)通路的主要小通路，可啟動(dòng)和調(diào)控 IL-1、TNF-α等炎癥因子轉(zhuǎn)錄，而炎癥因子又能反向推進(jìn)NF-κB信號(hào)通路中蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)加重炎癥反應(yīng)[10]。課題組前期從Wnt/Ca2+信號(hào)通路中的蛋白分子相互關(guān)系角度研究，證實(shí)桃紅四物湯能調(diào)控通路中的關(guān)鍵蛋白、降低鈣超載、機(jī)體炎癥反應(yīng)，而NF-κB通路作為Wnt/Ca2+信號(hào)通路的關(guān)鍵小通路，其與LI-RI發(fā)生的相互關(guān)系尚未闡明，本實(shí)驗(yàn)著重探討上游分子LncRNA H19與NF-κB通路間的調(diào)控關(guān)系，尋找LI-RI 損傷中骨骼肌細(xì)胞損傷的關(guān)鍵分子靶點(diǎn)，深入研究肢體缺血-再灌注損傷中骨骼肌細(xì)胞損傷的分子病理機(jī)制并予桃紅四物湯干預(yù)，以多層面豐富LI-RI病理機(jī)制，為中醫(yī)藥防治LI-RI提供科學(xué)理論依據(jù)與新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性SD大鼠78只，SPF級(jí)，8～10周齡，體重220～250 g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理編號(hào)(LLBH-202103050001)、動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)[SCXK(湘)2019-0004]、實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號(hào)[SYXK(湘)2019-0009]。所有大鼠均喂養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，相對(duì)濕度保持在50%～70%，溫度20～25 ℃，光照12 h/d，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物：桃紅四物湯由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑科利用現(xiàn)代技術(shù)工藝加工制成。組成藥物：桃仁、紅花各15 g，川芎、熟地、當(dāng)歸、赤芍各10 g。根據(jù)藥物所含主要有效成分的理化性質(zhì)，確定桃紅四物湯的制備工藝路線：桃仁、紅花、川芎、熟地、當(dāng)歸、赤芍六味藥物提取，水提液減壓濃縮至相對(duì)密度1.08～1.12(熱測(cè)溫度 60 ℃)，加入苯甲酸鈉使其溶解，分裝，即得。桃紅四物湯原藥物濃度為0.15 g/ml(規(guī)格250 ml/瓶，批號(hào)20201215)。

1.1.3 主要試劑與儀器：大鼠LncRNA H19阻斷劑hsa-miR-199a-5p miRNA Inhibitor(批號(hào)CIH0463，美國(guó)Cohesion公司)，大鼠NF-κB-p65 WB抗體(批號(hào)66535-1-Ig，Proteintech公司)，mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)CW2569，中國(guó)北京康為世紀(jì)公司)，miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)CW2141，北京康為世紀(jì)公司)，熒光定量RCP儀(型號(hào)PIKOREAL96)，臺(tái)式冷凍離心機(jī)(型號(hào)H1650R，湖南湘儀公司)，電泳儀(型號(hào)DYY-6C，北京六一公司)，BD-180S雙門冷凍柜(型號(hào)BC/BD-318HD，青島海爾冰箱通用有限公司)；Image Pro plus version 6.0(美國(guó)Media Cybernetics公司)；酶標(biāo)儀(型號(hào)PO-9622A，上海培奧分析儀器有限公司)；實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增儀(型號(hào)7500，美國(guó)ABI公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組與給藥：按隨機(jī)數(shù)字表將78只SD大鼠分為空白組、模型組、LncRNA H19阻斷劑組、桃紅四物湯組，空白組6只，其余每組24只。桃紅四物湯組于缺血前3 d開始予桃紅四物湯灌胃，每天灌胃2次，缺血前2 h再給藥1次，除空白組外每只動(dòng)物共灌胃7次，給藥劑量根據(jù)體質(zhì)量通過(guò)“體表面積-劑量換算法”計(jì)算得出，依據(jù)課題組前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，桃紅四物湯中劑量(0.15 g/ml)為最佳藥效濃度[11]，即每次灌胃給藥劑量為2 ml，未采用桃紅四物湯灌胃的其余各組在給藥相同時(shí)間點(diǎn)給予等體積蒸餾水灌胃。阻斷劑組造模前2 h予尾靜脈注射LncRNA H19基因阻斷劑3.75 mg/kg[12-13]。模型組、桃紅四物湯組在同樣時(shí)間點(diǎn)給予相同體積0.9%氯化鈉溶液尾靜脈注射，每日固定時(shí)間點(diǎn)給藥2次，除空白組外其余各組大鼠連續(xù)給藥7次。

1.2.2 大鼠LI-RI模型構(gòu)建：所有動(dòng)物置恒溫恒濕和自然光照的動(dòng)物房中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周?？瞻捉M動(dòng)物不造成肢體缺血-再灌注損傷，余下三組大鼠參照前期實(shí)驗(yàn)方法造模[14]，用口腔正畸橡皮筋和塑料套管阻斷大鼠左后肢血流4 h，再解除患肢橡皮筋和扎帶阻斷恢復(fù)下肢血液灌注，制備LI-RI模型。阻斷大鼠左后肢血流4 h后，大鼠趾掌變得蒼白，局部皮膚青紫、皮溫發(fā)涼，患肢活動(dòng)明顯受限，恢復(fù)患肢血流灌注后，大鼠趾掌恢復(fù)紅潤(rùn)溫暖，提示造模成功。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材：在血流再灌注0、2、4、8 h 時(shí)間點(diǎn)，每組隨機(jī)選取6只大鼠(除空白組6只大鼠于0 h全部選取)，用3%戊巴比妥鈉1.5 ml/kg腹腔注射麻醉，麻醉成功后，將大鼠固定在手術(shù)臺(tái)上，用脫毛膏脫去左后肢毛發(fā)備皮，絡(luò)合碘體表消毒后75%酒精脫碘，沿左側(cè)后肢縱軸方向切開皮膚、筋膜，暴露左下肢腓腸肌，每只大鼠患肢截取腓腸肌組織300 mg，用0.9%氯化鈉溶液洗凈，干燥，刀片切割后裝入保存管中，迅速置于-70 ℃超低溫冰箱中保存。

1.2.4 HE染色：取0.25 mg缺血-再灌注4 h大鼠腓腸肌組織，用4%中性甲醇溶液固定腓腸肌組織，4 μm厚度石蠟切片后60 ℃恒溫，烤片12 h，切片脫蠟至水，將切片用蘇木素染1 min后用蒸餾水沖洗，PBS返藍(lán)后再用伊紅染30 s，再次用蒸餾水沖洗并用酒精脫水處理，置于二甲苯中10 min后封片，染色后在顯微鏡下觀察各組大鼠腓腸肌組織炎癥反應(yīng)及形態(tài)學(xué)變化。

1.2.5 DAPI熒光染色：取0.25 mg再灌注4 h大鼠腓腸肌組織，60 ℃烤片12 h，切片，脫蠟至水，DAPI工作液37 ℃染核10 min，PBS沖洗，緩沖甘油封片，避光存放，熒光顯微鏡電腦采集，每個(gè)樣本取5個(gè)視野采集，倍數(shù)為400倍。骨骼肌細(xì)胞凋亡率=(細(xì)胞核濃縮細(xì)胞數(shù)÷細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.2.6 RT-qPCR檢測(cè)：取0.25 mg大鼠腓腸肌組織，采用Trizol法提取骨骼肌總RNA，將腓腸肌組織加液氮充分研磨，室裂解5 min，離心后取上層液相加入20～30 μl無(wú)菌無(wú)酶水溶解沉淀，紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度。混勻，離心后孵育靶基因。再次離心，冷卻，以GAPDH為內(nèi)參，采用SYBR法測(cè)定目標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 LncRNA H19、NF-κB-p65、GAPDH引物序列

1.2.7 Western blot法檢測(cè)：剪取0.025 g大鼠腓腸肌組織，預(yù)冷PBS洗組織，加入裂解液反復(fù)研磨，裂解后離心，灌膠，封膠。取50 μl的5×loading buffer加入蛋白上清中混勻，沸水煮5 min，電泳電壓設(shè)定為恒定78 V，時(shí)間2.5 h，Marker 2 μl點(diǎn)入第1孔，其余每孔點(diǎn)入10～30 μl已變性蛋白上樣，轉(zhuǎn)膜電流300 mA恒定，將膜取出放入1×PBST中洗1次，將膜浸入后配制好的5 %脫脂奶粉中室溫放置1 h，4 ℃過(guò)夜。再按照1∶2000比例稀釋，將膜與一抗一起孵育，室溫放置90 min，按照1∶5000比例用1×PBST稀釋HRP標(biāo)記的二抗與膜共同室溫孵育90 min，ECL顯色曝光、成像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Graph Pad Prism 8軟件制圖分析。各組間比較采用單因素方差分析，若各組數(shù)據(jù)滿足正態(tài)性、方差齊性，則采用重復(fù)測(cè)量資料方差分析，若方差不齊，則用多因素方差分析比較各組不同時(shí)間段組間LncRNA H19、NF-κB-p65表達(dá)差異；P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠HE染色結(jié)果比較 見(jiàn)圖1。染色后顯微鏡觀察，空白組腓腸肌纖維排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，呈長(zhǎng)索狀，肌漿豐富，肌纖維表面有多個(gè)緊密附著的細(xì)胞核，核大小、著色均勻，未見(jiàn)異常改變。除空白組外，其余各組骨骼肌均可見(jiàn)不同程度的破壞和異常改變，隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，各組肌肉組織破壞和形態(tài)學(xué)改變?cè)桨l(fā)明顯。模型組缺血-再灌注后骨骼肌纖維間縫隙增大，少量肌細(xì)胞破裂，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)明顯炎癥物質(zhì)浸潤(rùn)；桃紅四物湯組、LncRNA H19阻斷劑組肌纖維輕度破壞，細(xì)胞受損腫大畸形，排列整齊，肌纖維間縫隙稍增大，炎癥浸潤(rùn)不明顯，較模型組減輕。

A：空白組；B：模型組；C：LncRNA H19阻斷劑組；D：桃紅四物湯組圖1 各組大鼠缺血-再灌注4 h后腓腸肌形態(tài)比較(HE染色，×400)

2.2 各組大鼠DAPI熒光染色及腓腸肌細(xì)胞凋亡率比較 見(jiàn)表2(圖2)?？瞻捉M腓腸肌細(xì)胞架構(gòu)完整無(wú)變形，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，核外形、染色均勻。除空白組外，其余組均可見(jiàn)數(shù)量不等的凋亡小體，即細(xì)胞核碎裂成大小不等的圓形小體，核邊緣不規(guī)則，被細(xì)胞膜包繞。模型組細(xì)胞凋亡率高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，LncRNA H19阻斷劑組、桃紅四物湯組細(xì)胞著色較重，核濃縮呈新月形，聚集于核膜一邊，但兩組細(xì)胞凋亡率均低于模型組，且桃紅四物湯組低于LncRNA H19阻滯劑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠缺血-再灌注4 h后腓腸肌細(xì)胞凋亡率比較(%)

A：空白組；B：模型組；C：LncRNA H19阻斷劑組；D：桃紅四物湯組圖2 各組大鼠缺血-再灌注4 h后腓腸肌細(xì)胞比較(DAPI染色，×200)

2.3 各組大鼠腓腸肌LncRNA H19表達(dá)比較 見(jiàn)表3。與空白組比較，干預(yù)后模型組、LncRNA H19阻斷劑組、桃紅四物湯組中 LncRNA H19表達(dá)均上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著血流再灌注時(shí)間延長(zhǎng)，LncRNA H19在骨骼肌中的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，于再灌注4 h達(dá)到最高值，血流再灌注4 h后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。與模型組比較，桃紅四物湯組、LncRNA H19阻斷劑組的干預(yù)4、8 h，LncRNA H19表達(dá)均低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。干預(yù)4、8 h，LncRNA H19阻斷劑組的LncRNA H19表達(dá)量低于桃紅四物湯組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腓腸肌LncRNA H19表達(dá)比較

2.4 各組大鼠腓腸肌NF-κB-p65蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表4(圖3)。模型組大鼠腓腸肌NF-κB-p65蛋白表達(dá)高于空白組大鼠的腓腸肌NF-κB-p65蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。桃紅四物湯組、LncRNA H19阻滯劑組大鼠腓腸肌NF-κB-p65蛋白表達(dá)均高于模型組大鼠的水平；而隨著時(shí)間延長(zhǎng)，NF-κB-p65蛋白表達(dá)升高，且在2、4 h兩組表達(dá)均高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。桃紅四物湯組、阻滯劑組大鼠腓腸肌NF-κB-p65蛋白表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

表4 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腓腸肌NF-κB-p65蛋白表達(dá)比較

A：空白組；B：模型組；C：LncRNA H19阻斷劑組；D：桃紅四物湯組圖3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)NF-κB-p65蛋白表達(dá)比較

2.5 各組大鼠腓腸肌NF-κB-p65 mRNA表達(dá)比較 見(jiàn)表5。隨著血流再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，NF-κB-p65 mRNA在骨骼肌中的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，于再灌注4 h到達(dá)最高值，血流再灌注4 h后表達(dá)量有所下調(diào)。與空白組比較，模型組、LncRNA H19阻斷劑組、桃紅四物湯組中NF-κB-p65 mRNA表達(dá)均增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與模型組比較，桃紅四物湯組、LncRNA H19阻斷劑組NF-κB-p65 mRNA表達(dá)均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。LncRNA H19阻斷劑組NF-κB-p65 mRNA表達(dá)低于桃紅四物湯組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

表5 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腓腸肌NF-κB-p65 mRNA表達(dá)比較

3 討 論

LI-RI是肢體出現(xiàn)缺血后血液又回灌入組織而引起的一系列組織損傷，常繼發(fā)于動(dòng)脈損傷、斷肢(指)再植、血栓性閉塞等臨床疾病中，是一種病理機(jī)制復(fù)雜且治療困難的臨床疾病，不僅可以引發(fā)局部組織和器官損傷，而且可誘發(fā)遠(yuǎn)隔組織、器官的進(jìn)一步損傷，嚴(yán)重時(shí)甚至可導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)及多器官功能衰竭[15]。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的深入，國(guó)內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)LI-RI的發(fā)生發(fā)展與自由基、細(xì)胞凋亡、鈣超載、中性粒細(xì)胞的黏附與聚集、NO等眾多因素密切相關(guān)，以及誘發(fā)大量促炎癥細(xì)胞因子爆發(fā)式釋放，如NF-κB-p65、IL-1β、TNF-α等，不僅會(huì)再次加重肌肉組織的損傷，且炎癥因子進(jìn)入血液循環(huán)，可誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)和遠(yuǎn)隔重要器官損害[16]。

團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，桃紅四物湯可通過(guò)調(diào)控Wnt/Ca2+信號(hào)通路中IP3R、Wnt5a、CaMKⅡ等關(guān)鍵受體減輕鈣超載反應(yīng)，降低LI-RI大鼠腓腸肌細(xì)胞凋亡率，并下調(diào)血漿中IL-1β、TNF-α等炎癥因子表達(dá)，起到減輕LI-RI作用[17]。桃紅四物湯由桃仁、干地黃、紅花、炒川芎、赤芍藥、當(dāng)歸等中藥組成，其中桃仁、紅花能改善血管條件，防止血栓形成，加速溶栓過(guò)程。紅花能提高大鼠體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)生物活性，降低丙二醛(MDA)血清水平，紅花提取物預(yù)處理可降低大鼠腸缺血再灌注損傷的氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡率[18]。當(dāng)歸可減少組織過(guò)氧化損傷和提高細(xì)胞生物膜的穩(wěn)定性，川芎具有抗氧化作用，在小腸缺血再灌注損傷中，其主要成分川芎嗪能夠拮抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)炎癥和細(xì)胞凋亡通路表達(dá)[19]。赤芍總苷可通過(guò)增強(qiáng)抗氧化酶的生物活性，降低組織的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，提高細(xì)胞膜穩(wěn)定性，減輕細(xì)胞因缺血而帶來(lái)的病理?yè)p傷[20]。桃紅四物湯可有效降低血漿中IL-1β、TNF-α等炎癥因子表達(dá)，減輕LI-RI作用[21]。在腦缺血-再灌注方面，桃紅四物湯可以通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)腦缺血部位的血管新生，使腦缺血-再灌注損傷大鼠損傷的神經(jīng)功能得到恢復(fù)[22]。

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)LI-RI的防治和病理?yè)p傷的機(jī)制研究重心逐漸發(fā)展至分子生物學(xué)、細(xì)胞機(jī)制水平和信號(hào)因子、基因靶向調(diào)控等方面。LncRNA H19是一個(gè)長(zhǎng)度為3.0 kb具有高度進(jìn)化保守性的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，在機(jī)體眾多內(nèi)臟器官的I-RI類疾病的病理機(jī)制中，LncRNA H19均起到了生物調(diào)控功能[23]。LncRNA H19可通過(guò)敲減miR-103/107表達(dá)，抑制細(xì)胞壞死和拮抗小鼠I-RI心梗的出現(xiàn)[24]。在動(dòng)脈粥樣硬化調(diào)控機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，LncRNA H19在動(dòng)脈粥樣硬化患者血清中高度表達(dá)，通過(guò)NF-κB信號(hào)通路調(diào)控動(dòng)脈粥樣硬化疾病，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡[25-27]。LncRNA H19過(guò)表達(dá)后，NF-κB-p65蛋白在血管平滑肌細(xì)胞中高度表達(dá)[28-30]。而NF-κB信號(hào)通路是 Wnt/Ca2+信號(hào)通路中的主要小通路，普遍分布于細(xì)胞漿中，靜息狀態(tài)下它與抑制性蛋白IκB結(jié)合而為非活性狀態(tài)。NF-κB是一種快反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，可被許多物質(zhì)激活，如病毒、細(xì)胞內(nèi)因子、蛋白激酶C激活劑及細(xì)胞外刺激等[31-33]。NF-κB信號(hào)通路被激活后可參與許多基因轉(zhuǎn)錄與調(diào)控過(guò)程，可調(diào)控與啟動(dòng)腫瘤壞死因子-α、白介素-1等炎癥因子轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而引起一系列炎癥反應(yīng)[34-36]。在機(jī)體免疫、氧化應(yīng)激、組織炎癥、細(xì)胞增殖與凋亡等生理病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[37]。近年研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA H19-NF-κB信號(hào)通路可相互作用，發(fā)揮其生物學(xué)作用[38]。劉湜樺等[39]研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA H19通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)幽門螺旋桿菌感染的GC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲。Jiang等[40]通過(guò)抑制腦出血模型大鼠中LncRNA H19表達(dá)，發(fā)現(xiàn) LncRNA H19沉默后，腦出血大鼠腦組織NF-κB-p65表達(dá)降低，提示LncRNA H19可導(dǎo)致神經(jīng)損傷，釋放炎癥因子，加劇氧化應(yīng)激，并通過(guò)激活NF-κB通路進(jìn)一步加重腦出血大鼠腦損傷。以上研究表明，LncRNA H19-NF-κB信號(hào)通路與LI-RI炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，并可調(diào)控NF-κB信號(hào)通路和介導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生。

本研究HE染色結(jié)果顯示，桃紅四物湯組和LncRNA H19阻滯劑組腓腸肌纖維的破壞程度較模型組明顯減輕，且桃紅四物湯組的肌纖維輕度破壞，炎癥浸潤(rùn)不明顯，較LncRNA H19阻斷劑組稍減輕。DAPI 熒光染色顯示，桃紅四物湯組、LncRNA H19阻滯劑組細(xì)胞凋亡率低于模型組，說(shuō)明LncRNA H19阻滯劑、桃紅四物湯預(yù)處理可減少細(xì)胞凋亡，減輕LI-RI作用。 RT-qPCR 、Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白組相比，各組大鼠NF-κB-p65蛋白及其mRNA表達(dá)一致性上調(diào)，說(shuō)明NF-κB-p65是LI-RI Wnt5a/Ca2+信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白；與模型組相比，桃紅四物湯組、LncRNA H19阻滯劑組不同時(shí)間點(diǎn)腓腸肌 LncRNA H19表達(dá)一致性下調(diào)，提示桃紅四物湯可抑制LncRNA H19表達(dá)。桃紅四物湯組、阻滯劑組的NF-κB- p65表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明桃紅四物湯可通過(guò)調(diào)控上游分子LncRNA H19途徑下調(diào)NF-κB- p65表達(dá)，減輕LI-RI作用。這為 LI-RI骨骼肌細(xì)胞損傷的分子機(jī)制和桃紅四物湯的防治作用提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。在研究 LI-RI 發(fā)生、進(jìn)展、預(yù)防的分子病理機(jī)制中，NF-κB是Wnt/Ca2+信號(hào)通路的一條關(guān)鍵小通路，上游分子LncRNA H19是否可以通過(guò)調(diào)控Wnt/Ca2+信號(hào)途徑中其他小通路的表達(dá)協(xié)同影響LI-RI，以及桃紅四物湯在抑制LI-RI細(xì)胞凋亡方面可能存在多通路、多靶點(diǎn)效應(yīng)，值得進(jìn)一步開展體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究。