實時熒光定量PC R 方法在蜂學研究中的應用

王藝樺，王紅坤，周云倩，董 坤，周丹銀，張 炫

（云南農業(yè)大學動物科學技術學院蜂學系，云南 昆明 650201）

實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，RT-qPCR）是一種在DNA 擴增反應中利用化學熒光物質的積累，實時、準確、快速地測定每次聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction,PCR）后產物總量的方法。測定過程中，通過選定參照物作為標準品，對待測樣品中的特定DNA 序列進行定量分析。1985 年，美國PE-Cetus 公司人類遺傳研究室的Mullis 等研發(fā)了體外核酸擴增技術，即PCR 技術[1]。傳統PCR 技術通過高溫變性、低溫退火、適溫延伸3 個反應階段，以待測DNA 片段為模板，合成DNA 新鏈[2]。傳統PCR 技術只能對產物進行定性分析和粗略的定量分析，且實驗過程中易受環(huán)境污染，這促使人們在原有PCR 技術上進行改進。1995 年美國PE（Perkin Elmer）公司研制出一種新型PCR 定量技術。1996 年美國ABI（Applied Biosystems）公司成功研發(fā)并推出實時熒光定量PCR 技術，該技術成功解決了傳統PCR 技術無法準確定量以及環(huán)境污染導致實驗結果假陽性等問題[3]，且目的基因的循環(huán)擴增以及產物的定量檢測分析同時進行，極大地減少了檢測所需時間。實時熒光定量PCR 技術從根本上實現了DNA 的定量檢測分析，是基因擴增技術方面的重大突破。

1 實時熒光定量P C R 的特點

（1）通過在PCR 反應體系中加入能標記特定PCR 產物的熒光基團，利用其產生的熒光信號，可實時監(jiān)測PCR 反應中特定產物每經歷一次循環(huán)反應所產生的變化量。

（2）熒光染料法和熒光探針法，均可以直接探測目的基因在擴增過程中熒光信號的變化，從而獲得PCR 產物的定量結果，大大提高了檢測的靈敏度、特異性和精確性[4]。

（3）實時熒光定量PCR 儀檢測到的數據，通過連接計算機并安裝相應分析軟件，可以在計算機上通過擴增曲線圖、溶解曲線圖、標準曲線圖，直觀反應PCR 產物擴增情況，操作簡便，效率高。

（4）RT-qPCR 反應在一個全封閉狀態(tài)下進行PCR 擴增和產物熒光信號檢測分析，有效避免了傳統PCR 在開放環(huán)境中檢測由于環(huán)境污染而導致假陽性結果的出現，有效提高了實驗的安全性和數據的可靠性。

（5）RT-qPCR 反應可以一次性進行批量樣本的PCR 擴增反應，數據通過計算機進行檢測分析，極大地減小了人眼觀察帶來的主觀誤差。

2 實時熒光定量P C R 的原理

實時熒光定量PCR 是在傳統PCR 原理上的進一步延伸。傳統PCR 是在體外條件下，加入模板DNA、4 種游離的脫氧核糖核苷酸、2 種引物以及具有熱穩(wěn)定性的DNA 聚合酶，通過高溫使DNA 變性解開雙鏈結構、降低溫度使引物與模板DNA 的單鏈進行互補序列結合形成局部雙鏈，最后通過溫度升高至72℃左右，以dNTP 為原料，短時間內快速合成大量與模板DNA 互補的新鏈。實時熒光定量PCR 是在傳統PCR 體系的基礎上通過加入熒光基團或熒光探針并通過實時熒光定量PCR儀器獲得相應熒光積累信號，該熒光信號不斷積累形成“S”型曲線即為PCR 反應進程，通過曲線能夠計算獲得目的樣本的初始基因分子數，進而對整個PCR 反應進行定量分析。

實時熒光定量PCR 反應中，由熒光信號積累形成的曲線稱為PCR 擴增曲線（圖1）。該曲線以PCR 反應循環(huán)數作為橫坐標，實時熒光信號強度作為縱坐標并引入了基線（baseline）、熒光閾值（threshold）、Ct（threshold cycle）的概念。在PCR 擴增反應中，從擴增反應開始循環(huán)到熒光信號呈現指數增長之前的一段時間內，熒光信號呈一條直線，該直線稱為基線。熒光閾值是指熒光信號指數增長時的臨界值，一般是PCR 反應3～15 個循環(huán)熒光信號標準差的10 倍[5]。Ct 值是指PCR 反應試管中熒光信號不斷積累達到熒光閾值時所經歷的循環(huán)次數。Ct 值與PCR 擴增反應的起始目的基因量的對數成反比線性關系，Ct 值越大，起始目的基因量越小[6]。PCR 擴增曲線通過不斷收集每一個循環(huán)積累熒光信號的強度，根據熒光強度變化對目的基因的PCR 產物量進行實時檢測，最終繪制成目的基因的擴增曲線。

圖1 實時熒光定量PCR 擴增曲線Fig.1 Amplification curve of RT-qPCR

實時熒光定量PCR 反應中，通過升高溫度使PCR 擴增后的目的基因解開雙鏈結構，熒光信號強度快速降低而形成的一條單峰曲線稱為溶解曲線（圖2）。該曲線以溫度作為橫坐標，隨著時間推移的相對熒光強度的導數作為縱坐標。溶解曲線中通過對PCR 產物不斷加熱，使擴增產物逐漸解開雙鏈結構，由于熒光基團需要結合到DNA 的雙鏈結構中，才能產生游離狀態(tài)下10～100 倍的熒光信號[4]，所以當溫度升高至Tm 值（DNA 雙鏈堿基對分離50%的溫度）時，大量DNA 雙鏈結構被破壞，熒光信號強度急劇下降，從而產生一特征峰，進而繪制成該產物的溶解曲線。不同目的基因所對應的Tm 值也不相同，其熒光信號強度急劇下降的溫度也不同。由此可以通過溶解曲線的特征峰判斷PCR 產物的特異性[7]，出現單峰說明PCR 擴增產物特異性好，出現雜峰則代表產物受到污染或者有引物二聚體的產生，PCR 擴增產物的特異性較差。

(ⅱ) 對任意F∈CIrr(X),若Fδ∩(∪i∈IUi)=∪i∈I(Fδ∩Ui)≠?,則存在i∈I使得Fδ∩Ui≠?,由Ui∈τCSI及F∈CIrr(X),F∩Ui≠?,于是F∩(∪i∈IUi)≠?,從而∪i∈IUi∈τCSI。

圖2 實時熒光定量PCR 溶解曲線Fig.2 Melt curve of RT-qPCR

3 實時熒光定量P C R 的定量方法

實時熒光定量PCR 主要有2 種定量方法：絕對定量法（absolute quantification）和相對定量法（relative quantification）[8]。絕對定量法常用已知的樣本數據來確定未知樣本中某項數值的絕對量；相對定量法則應用測定目的樣本和參照樣本之間某一數值的相對比率來確定。不同實驗可以依據實驗目的，選擇合適的定量方法進行數據分析。

3.1 絕對定量法

絕對定量法是通過標準曲線法對目的樣本的拷貝起始量進行絕對定量。首先，該方法需要確定標準曲線（圖3）；在已知標準品濃度的情況下，通常進行10 倍稀釋，將稀釋后的標準品進行實時熒光PCR 反應獲得不同稀釋程度下的拷貝數；最后，將標準品拷貝數的對數值作為橫坐標，所對應的Ct 值作為縱坐標，繪制出標準曲線并計算出相應的線性回歸方程。在定量分析過程中，將目的樣品實時熒光定量PCR 反應過程中的Ct 值代入方程中，即可計算出目的樣本的起始拷貝數。

圖3 實時熒光定量PCR 標準曲線Fig.3 Standard curve of RT-qPCR

3.2 相對定量法

相對定量法是指測定樣本中目的基因與另一參照基因兩者拷貝數的變化情況。實驗過程中不需要知道它們在每個樣本中的拷貝數，便可獲得目的基因相對比值，然后判斷出目的基因在測定樣本中表達水平的高低。在使用相對定量法的實驗過程中，待測樣本的目的基因的拷貝數來自標準曲線。將目的基因的拷貝數與參照基因的拷貝數相除，即可計算出目的基因的相對比值，該比值為參照基因拷貝數的n倍。由于在PCR 反應中，管家基因正常表達且基本不受環(huán)境條件影響，因此需要加入管家基因作為標準參照物，從而校正上樣過程中存在的實驗誤差，進而保證相對定量法的真實性和準確性。

4 實時熒光定量P C R 的檢測方法

實時熒光定量PCR 具有多種檢測方法，隨著分子生物學的不斷深入發(fā)展，相應的科學檢測手段也應運而生。迄今為止，科學家已經發(fā)明建立了一系列實時熒光定量PCR 技術檢測方法。具體分為2 大類，分別是DNA 染料法和熒光探針法[9]。

4.1 D N A 染料法

DNA 染料法通過在PCR 反應體系中添加熒光染料，利用該染料會特異性結合到雙鏈DNA 小溝上并散發(fā)出熒光信號的特性[10]，散發(fā)出的熒光信號被熒光探測儀器檢測，從而實現對PCR 產物擴增的實時檢測。實時熒光定量PCR 的DNA 染料包括SYBR Green 染料、SYBR Safe 染料、SYBR Gold 染料與 EB（Ethidium Bromide）染料，實驗室常用的熒光染料為SYBR Green I，該染料使用方法簡單、技術成熟且成本相對較低。但是DNA 染料法在特異性檢測PCR 產物的過程中存在一定不足。由于該方法檢測的是PCR 反應體系中所有的雙鏈DNA 分子，即熒光染料會與所有雙鏈DNA 分子小溝結合，當反應過程中有引物二聚體或非特異性擴增的情況發(fā)生時，會對實驗結果的真實性和準確性產生顯著影響。因此，要求實驗過程中PCR 反應的退火溫度要精確，所使用的引物要具有較高的特異性，在引物設計過程中減少引物二聚體的產生。針對這一問題還可以通過分析溶解曲線來分辨非特異性產物和引物二聚體，進而排除產生的假陽性結果。

4.2 熒光探針法

熒光探針法（Fluorescence Probe）由3 部分組成：熒光報告基團、熒光淬滅基團以及連接基團。在PCR 反應過程中，熒光探針會與目的基因發(fā)生特異性結合，在反應起始階段目的基因和熒光探針的化學結構不會被破壞。此時，根據熒光共振能量轉移原理（fluorescence resonance energy transfer，FRET），在熒光探針結構完整的情況下熒光淬滅基團會抑制熒光報告集團所激發(fā)出的熒光信號，使熒光信號的強度不會發(fā)生變化。當PCR 反應溫度升高時，DNA 的雙鏈結構被破壞，特異性結合到DNA上的熒光探針，其上的連接基團功能失效，導致熒光報告基團和熒光淬滅基團之間穩(wěn)定的能量結構被破壞，熒光淬滅基團無法抑制熒光報告基團釋放熒光信號。此時，隨著目的基因的大量復制，相應的熒光探針結構被破壞，大量熒光信號被儀器檢測到，對應擴增曲線上熒光信號強度開始呈指數增長。簡而言之，探針法是利用熒光探針會特異性與目的基因片段結合，并隨著擴增產物的增加而不斷發(fā)射熒光信號來實時檢測PCR 反應進程。熒光探針可細分為水解探針、分子信標和雜交探針等。

水解探針法（hydrolysis probes）是一種應用較廣的寡核苷酸探針。該熒光探針在5' 端含有熒光報告基團，例如ROX、FAM、VIC、NED 等，在3' 端含有熒光淬滅基團，如TAMRA、BHQ、QSY 等[11]。當PCR 擴增時，熒光探針結構被破壞，報告基團發(fā)射的熒光信號無法被淬滅基團抑制，從而使儀器檢測到大量熒光信號，即DNA 模板每復制一次，就有一個熒光信號被釋放，實現了對PCR 擴增反應的實時監(jiān)測。由于需要利用Taq 酶5'→3'外切核酸酶活性將熒光探針水解，所以該探針又稱為TaqMan 探針。

基于TaqMan 探針而研發(fā)的TaqMan-MGB探針，是在TaqMan 探針的3'端除了熒光淬滅基團外，再加入一種可與雙鏈DNA 的螺旋小溝特異性結合的MGB（minor groove binder）分子。MGB 使探針的Tm 值上升10℃左右且探針的長度相對縮短，降低了合成探針所需的費用。另外，由于TaqMan-MGB 探針在3' 端使用非熒光淬滅基團，使得熒光反應的本地信號大大降低，從而提高了反應檢測的靈敏度[12]。

4.2.2 分子信標法

分子信標法（molecular beacons）是一種具有莖環(huán)發(fā)夾結構的單鏈DNA 分子探針，由美國科學家Tyagi 和Kramer 發(fā)明[13]，該探針的兩端含有熒光報告基團和淬滅基團。由于分子信標探針呈發(fā)夾結構，與TaqMan 探針相比，其5' 端的報告基團與3' 端的淬滅基團距離更近，淬滅基團抑制熒光信號的效果更強。在PCR 反應過程中，分子信標與目標序列的DNA 進行互補結合時，莖環(huán)結構被打開，位于5' 端報告基團和3' 端的淬滅基團相分離，淬滅基團的抑制作用隨著距離的逐漸增大而減弱，進而產生大量熒光信號。由于分子信標具有極強的特異性，只有與其完全互補配對的DNA 序列存在時，才會與其特異性結合，而釋放熒光信號，因此分子信標能夠做到準確區(qū)分出只有一個核苷酸區(qū)別的DNA 序列，常用于鑒定點突變以及對DNA 序列進行特異性檢測[14]。此外，發(fā)卡式引物、蝎狀引物以及LUX引物等熒光標記引物，是基于分子信標原理而開發(fā)的一類反應速度快、熒光信號強的聯合分子探針系統[15]。

4.2.3 雜交探針法

雜交探針法（hybridization probes）是指在PCR 反應體系中加入2 個特異性探針[16]，其中上游探針的5' 端標記熒光受體基團，下游探針的3'端標記熒光供體基團，2 個基團分別位于2 個不同的探針上，且兩者需要結合到目標序列上才可以釋放出熒光信號。在PCR 反應進行到退火階段時，2 個探針一前一后結合到擴增產物上，兩者前后相接使受體基團和供體基團距離相近，供體基團激發(fā)后產生的熒光能量轉移至受體基團，使其發(fā)出紅色熒光信號從而被儀器檢測。當2 個探針分離時，2 個基團距離較遠，儀器檢測不到受體基團發(fā)出的紅色熒光信號。雜交探針由于需要2 個探針才能產生熒光信號，其特異性進一步加強，但相應的成本也較高。

5 實時熒光定量P C R 在蜜蜂科學研究中的應用

5.1 蜜蜂疾病診斷

診斷蜜蜂疾病的方法主要有實驗室診斷和臨床診斷。實驗室診斷包括：病原學診斷、解剖學診斷以及血清學診斷[17，18]；臨床診斷主要是通過實際觀察蜂群整體以及蜜蜂個體（幼蟲、蛹、成蟲）的形態(tài)特征變化來判斷?；疾∶鄯渫ǔＰ袆舆t緩，蜂體形態(tài)和顏色會發(fā)生改變[19]。如蜜蜂殘翅病毒（Deformed wing virus，DWV）常使成年蜜蜂翅膀卷曲變皺，身體萎縮，體色變暗，失去飛行能力，翅膀常呈現“K”型且只能爬行，1～2 日后死亡；蜜蜂黑蜂王臺病毒常使蜂王幼蟲的王臺變成黑色，患病幼蟲多于前蛹期或蛹期死亡，死亡幼蟲會形成一個類似于囊狀幼蟲病的囊；螨害嚴重常出現幼蟲和蜂蛹死亡，在蜂箱周圍地面上可見到大量新羽化出房的幼蜂翅膀殘缺，到處爬行，衰竭死亡。

隨著實時熒光定量PCR 技術的不斷開發(fā)和應用，蜜蜂疾病的診斷方法研究進入到一個新的階段[20]。宋戰(zhàn)昀等[21]運用TaqMan 探針實時定量PCR 技術成功檢測到蜜蜂囊狀幼蟲?。╯acbrood disease，SBV），該方法也適用于蜂蜜、花粉、蜂膠和蜂王漿等蜂產品中SBV 的檢測，為蜜蜂及相關蜂產品的質量安全提供了檢測手段，為臨床快速確診蜜蜂囊狀幼蟲病，及時用藥治療并防止用藥超標導致的藥物殘留提供理論和技術支撐。張體銀等[22]建立了蜜蜂克什米爾病毒（Kashmir bee virus，KBV）的Taq-Man 探針實時熒光定量方法，為KBV 的快速檢測提供了技術支撐；與此同時，張體銀等[23]建立了蜜蜂急性麻痹病毒（Acute Bee Paralysis Virus，ABPV）的TaqMan 探針實時熒光定量方法，為ABPV 的精確檢測提供了技術支持。楊倩等[24]通過TaqMan 探針實時定量PCR 技術原理，成功建立黑蜂王臺病毒(Black queen cell virus，BQCV)的快速檢測手段，為控制黑蜂王臺病毒的傳播和提高蜂王幼蟲成活率提供了技術保障。

王琛等[25]運用TaqMan-MGB 探針建立的實時熒光定量RT-PCR 成功對DWV 進行實時檢測，該方法與王蕾等[26]通過使用SYBR Green I熒光染料建立的實時熒光定量RT-PCR 檢測方法相比較，TaqMan-MGB 探針法能夠檢測到拷貝數10 以下的病毒載量，靈敏度更高。該方法還具有背景信號強度低、探針引物精確度高、特異性強，以及操作簡便、速度快等特點。TaqMan-MGB 探針的研究開發(fā)，為DWV的病原檢測及其流行病學調查提供了技術支撐。

5.2 蜜蜂病理學研究

美洲幼蟲腐臭病（American foulbrood，AFB）又稱“爛子病”，是一種主要危害蜜蜂幼蟲并導致幼蟲蟲體腐爛的疾病。該病易造成幼蟲死亡以及蜂群整體群勢下降，一旦發(fā)生難以徹底清除。AFB 是由幼蟲芽孢桿菌引發(fā)的疾病，控制病因是一種有效的防范措施。何曉杰等[27]運用實時熒光定量PCR TaqMan 探針法對幼蟲芽孢桿菌進行定量檢測分析，進而監(jiān)控蜜蜂體內AFB 的含量。該方法的建立能夠為AFB 的早期診斷和預防提供信息參考。

歐洲幼蟲腐臭病(European foulbrood，EFB)的致病菌為蜂房蜜蜂球菌，其余細菌如幼蟲芽孢桿菌等為次生菌。該病多發(fā)于群勢較弱的蜂群，幼蟲染病后蟲體失去光澤并發(fā)黃，病蟲死亡后會散發(fā)酸臭氣味，影響蜂群群勢。何曉杰等[28]通過實時熒光定量PCR 方法對蜜蜂歐洲幼蟲腐臭病病原菌進行定量分析，為蜂產品中蜂房蜜蜂球菌的檢測以及EFB 的預防提供了技術指導。

5.3 蜜蜂基因功能表達研究

實時熒光定量PCR 技術是一種研究基因功能表達的良好平臺，通過該技術能檢測和分析目的基因在不同組織的時空表達模式，從而為進一步闡明目的基因在樣本中的生物學功能提供理論依據。

王宇飛等[29]和齊磊等[30]運用實時熒光定量PCR 檢測了意大利蜜蜂不同日齡的工蜂觸角中化學感受蛋白基因 CSPs家族（Amel-CSP1～Amel-CSP6，其中Amel-CSP5 表達穩(wěn)定無特異性)的表達情況，結果顯示Amel-CSP1、Amel-CSP6 可能與意蜂工蜂工作行為轉變有關；Amel-CSP2 則與工蜂羽化和信息素的接受有關；Amel-CSP3 在蜜蜂搜索蜜源過程中具有一定的氣味運輸功能；Amel-CSP4可能與信息素的傳遞和運輸有關。王琦[31]等通過實時熒光定量PCR 技術測定了西方蜜蜂各級型不同發(fā)育階段昆蟲血淋巴19 k Da 蛋白（HP19）的轉錄水平，揭示了該蛋白在西方蜜蜂變態(tài)發(fā)育期起重要調控作用。劉川東等[32]應用實時熒光定量PCR 測定西方蜜蜂蛻皮激素早期應答因子ecr 和usp 在蜜蜂不同級型、不同發(fā)育時期的表達水平，揭示了蛻皮激素對蜜蜂生長發(fā)育、蛻皮變態(tài)有調控作用。李曉燕等[33]利用實時熒光定量PCR 技術對MRJP7（王漿蛋白基因家族成員之一）在意大利蜜蜂各級型不同發(fā)育階段、不同組織中進行定量檢測分析，結果表明MRJP7 在工蜂羽化后9 日齡前后的哺育蜂王漿腺和頭部高水平特異性表達，這與工蜂會哺育幼蟲和蜂王的行為相適應，證明MRJP7 具有一定的營養(yǎng)功能。

5.4 蜂產品運用研究

實時熒光定量PCR 技術在蜜蜂蜂產品研發(fā)中也有一定程度的研究。王芳[34]使用實時熒光定量PCR 技術檢測了不同濃度下水溶性殼聚糖對蜂花粉源菌群的抑制作用，結果表明將殼聚糖運用到蜂花粉中可抑制菌群生長，并為由蜂花粉引起的蜜蜂疾病提供預防作用，為相關藥物的開發(fā)提供理論基礎。柳吉芹等[35]利用實時熒光定量PCR TaqMan 探針法，通過設計2 種針對中蜂和意蜂的特異性探針，對中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜之間MRJP2 的分子量進行檢測鑒定。PCR 擴增結果顯示大多數中蜂蜂蜜存在摻假現象。研究提供的鑒別方法能夠快速有效地區(qū)分中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜，并為蜂產業(yè)的良好健康發(fā)展提供了方法。

6 展望

實時熒光定量PCR 技術自發(fā)明至今，在蜜蜂疾病診斷檢測方面已得到廣泛應用。蜜蜂病毒如：DWV、SBV、KBV 等，其病原體的檢測診斷已得到較為充分的研究。由于實時熒光定量PCR 技術能夠定量測定基因量且具有檢測速度快、精度高、誤差小、特異性強等特點，目前已經成為分子生物學相關研究的重要技術。隨著實時熒光定量PCR 技術的不斷更新換代，儀器操作更加簡便、實驗成本降低、反應靈敏度大幅提高，結合生物芯片技術、肽核酸技術、微解剖技術等其他先進檢測技術，實時熒光定量PCR 技術在蜜蜂科學研究中將會有更為廣闊的應用前景。