匹立尼酸基于TLR4/NF-κB信號通路對大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用

張偉奇，周碩，李鐵成*

(錦州醫(yī)科大學：1附屬第三醫(yī)院麻醉科，2附屬第一醫(yī)院乳腺外科，遼寧 錦州 121000)

近年來，缺血性心臟病死亡率顯著增高[1]。使血流迅速再通是有效改善急性心肌缺血和損傷癥狀的關鍵。但是，也可能因此造成心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia/reperfusion injury, MI/RI)，使心臟的結構發(fā)生改變并導致功能障礙。目前，多種臨床方法已被廣泛使用，但充分有效的預防或治療仍然缺乏[2]。強烈的炎癥反應是MI/RI復雜的多因素發(fā)病機制中的關鍵[3]，核因子(nuclear factor, NF)-κB是參與炎癥調節(jié)最突出的轉錄因子之一[4]。內源性免疫受體TOLL樣受體-4(toll-like receptor 4，TLR4)通過復雜的相互作用，誘導IκB表達調控NF-κB定位從而阻止P50、P65移位入細胞核調控其下游多種炎癥因子反應[5,6]。因此，阻止TLR4/NF-κB信號通路的過多表達對MI/RI有重要意義。

匹立尼酸(pirinixic acid，又名Wy-14643)是人工合成的過氧化物酶體增殖物激活受體-a(peroxisome proliferator-activated receptor a，PPARa)的激動劑，最初作為降脂劑開發(fā)的多功能的脂肪酸模擬物。Wy-14643除了可降血脂和降血糖外，還具有抗血管內皮收縮及降壓保護的作用[7]，可通過抗炎癥、抗氧化來保護肝腎等損傷。本研究旨在探討匹立尼酸對大鼠MI/RI模型中炎癥反應的影響，并就其機制進行初步分析。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

Wy-14643、二甲基亞砜(dimethyl Sulfoxide，DMSO)購于上海源葉生物科技有限公司；氯化硝基四氮唑藍(nitroblue tetrazolium，NBT)購于南京探求生物技術有限公司；β-actin抗體購于武漢三鷹生物科技有限公司；TLR4、NF-κB購于深圳市科潤達生物工程有限公司；肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme，CK-MB)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)試劑盒購于上海酶聯科技生物有限公司；蘇木精-伊紅染色試劑盒(hematoxylin-eosin，HE)、聚氰基丙烯酸正丁酯蛋白測定試劑盒(bicinchoninic acid，BCA)、核蛋白提取試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；超聲波破碎儀產自美國Sonics公司；生物顯微鏡、切片機、烤片機產自德國Leica公司；垂直電泳系統(tǒng)、化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)產自美國伯樂公司；高速冷凍離心機產自德國Sigma公司；小動物呼吸機、心電監(jiān)護儀產自成都泰盟公司；其他由錦州醫(yī)科大學動物實驗中心實驗室提供。

1.2 實驗動物及分組

40只大鼠，適應性飼養(yǎng)1周，根據隨機數表法隨機分為5組，每組各8只：(1)假手術組(Sham組)；(2)缺血再灌注組(MI/RI組)；(3)匹立尼酸低劑量組(low dose, W1組)；(4)匹立尼酸中劑量組(middle dose, W2組)；(5)匹立尼酸高劑量組(high dose,W3組)。藥物組W1、W2、W3分別于術前2 d、1 d、1 h腹腔注射匹立尼酸1、4、8 mg/kg，匹立尼酸以10% DMSO(1 ml/kg)作為溶劑；Sham組和MI/RI組于上述時間注射等體積等濃度的DMSO溶劑。

1.3 模型制作及處理

參考文獻[8]，術前禁食12 h，自由飲水。10%水合氯醛(3 ml/kg)下腹部注射，靜待數分鐘大鼠仰臥大字位于操作臺，記錄心電圖變化，并插管人工通氣(潮氣量2 ml/100 g，頻率60次/min)。剪開左胸3、4肋間皮膚，小心剪斷第2、3肋骨，暴露術野，分離心包，識別冠狀動脈，5-0縫合線結扎MI/RI組、匹立尼酸各劑量組左前降支(Sham組僅做穿線處理)，見心電圖ST-T升高，缺血30 min后松結，再灌注1 h，升高區(qū)下降50%即造模成功。

1.4 檢測方法

1.4.1 酶聯免疫吸附法測定CK-MB、LDH、TNF-α及IL-6 造模成功后，于頸總動脈處取血，室溫存放60 min，離心(3 000轉/min,10 min)，上清液-80 ℃儲存，待備好所有大鼠血清，將樣本融化加入樣本孔混勻，封板，于37 ℃恒溫箱1 h，反復清洗濾紙吸干重復5次，加底物，避光反應15 min，最后加終止液測吸光度。

1.4.2 NBT染色 取血后，每組隨機選4個心臟，僅保留左心室，-20 ℃速凍1 h等厚切4片，0.2%NBT溶液37 ℃水浴染色。梗死的心肌不染色，呈淡紅色；著色后呈暗紫色為正常組織。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)。心肌梗死面積(%)=梗死部分面積/總心肌面積×100%。

1.4.3 HE染色 每組剩下的4個心臟，一半-80 ℃保存用于Western blot測定，另一半放入4%多聚甲醛，制作切片，脫蠟,乙醇多次脫水，沖洗3 min，HE染色，上行梯度酒精各5 min，透明處理，封閉切片，光學顯微鏡拍照觀察。

1.4.4 Western blot檢測蛋白質表達 從備于-80 ℃的心肌組織中融化提取核孔蛋白，檢測蛋白質濃度并置成樣本。上樣電泳，轉膜，洗膜，密封，加一、二抗體孵育后再洗膜。行條帶的灰度值分析，計算心肌組織TLR4、NF-κBp65蛋白的相對表達數量。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 各組血清LDH、CK-MB含量的比較

與Sham組比較，MI/RI組、匹立尼酸藥物組CK/MB、LDH表達水平顯著升高(P<0.01)；與MI/RI組比較，匹立尼酸藥物組CK/MB、LDH含量顯著下降(P<0.01)；與W1組比較，W3組CK/MB、LDH含量明顯減少(P<0.01)；與W2組比較，W3組CK/MB明顯降低(P<0.05；表1)。

表1 各組CK/MB、LDH表達量比較

2.2 各組血清TNF-α和IL-6含量的比較

與Sham組比較，MI/RI組、匹立尼酸各藥物組TNF-α、IL-6表達水平顯著上升(P<0.01)；與MI/RI組比較，匹立尼酸各藥物組TNF-α、IL-6含量明顯下降(P<0.01，P<0.05)；與W1組比較，W2、W3組TNF-α含量顯著減少(P<0.01)，W3組IL-6含量顯著降低(P<0.01)；與W2組比較，W3組TNF-α、IL-6含量明顯降低(P<0.01，P<0.05；表2)。

表2 各組TNF-α和IL-6表達量比較

2.3 各組心肌梗死面積的比較

從著色程度判斷，Sham組未發(fā)生梗死。與Sham組對比，MI/RI組大鼠心肌梗死面積明顯擴大(35.88%和0.00%，P<0.01)；與MI/RI組比較，W1、W2、W3組梗死面積劑量相關性明顯降低(28.00%、16.93%、8.38%和35.88%，P<0.01或P<0.05；圖1)。

圖1 各組心肌梗死面積的比較

2.4 各組心肌組織TLR4和NF-κBp65蛋白的表達比較

相較于Sham組，MI/RI組TLR4和NF-κBp65表達大幅度上調(P<0.01)，匹立尼酸各劑量組的蛋白表達變化明顯(P<0.01，P<0.05)；相較于MI/RI組，匹立尼酸各組TLR4和NF-κBp65表達量呈劑量相關的下降趨勢(P<0.01)；匹立尼酸W1組與W3組TLR4和NF-κBp65表達有顯著差異(P<0.01)；相較于匹立尼酸W2組，W3組TLR4和NF-κBp65表達顯著下調(P<0.01；圖2)。

圖2 各組心肌組織TLR4和NF-κBp65蛋白的表達比較

2.5 各組心肌組織病理形態(tài)學改變

光學顯微鏡下，Sham組心肌纖維緊密排列，結構正常；MI/RI組，細胞腫脹，核邊緣化，間質水腫肌纖維斷裂，核周見炎癥性空泡；W1組，細胞內腫脹界限不清，伴少量出血；W2組可見細胞間質水腫，散在炎性空泡；W3組細胞間質輕度水腫，細胞結構完整(圖3)。

圖3 各組心肌組織病理形態(tài)學改變

3 討 論

心源性休克是急性心肌梗死患者致死的主要原因，通過經皮冠狀動脈介入或冠狀動脈旁路移植等方法可進行緊急血運重建，保證心臟各功能正常運行[9,10]。然而，降低心肌梗死死亡率的同時也引發(fā)了由中性粒細胞驅動的炎癥過程。TNF-α和各類型白細胞介素家族等細胞因子是炎癥反應的標志性物質。IL-6決定多種炎癥相關的蛋白質表達，介導多條信號轉導通路，在類風濕性關節(jié)炎、癌癥等相對復雜的疾病中的作用已被證實[11]，心肌亦是如此[12]。多種炎癥性心臟病的病理變化過程中，TNF-α和IL-6等細胞因子于通透性改變的細胞膜迅速入血，大量循環(huán)炎癥細胞相互作用浸潤受損的心肌，導致缺血再灌注損傷[13,14]。本實驗結果與此前研究結論相符合，觀察到模型組TNF-α和IL-6含量比假手術組顯著增高，說明心肌損傷與炎癥反應相關，各劑量藥物預處理組TNF-α和IL-6含量較模型組均降低，其中以高劑量組下降最為明顯。同時，大量存于心肌細胞中的CK-MB活性及質量的聯合檢測,早在發(fā)病2 h內就提示急性心肌梗死的發(fā)生，是心肌酶譜中最先上升且幅度最大的心肌酶。但其單一指標對心肌梗死患者的檢測缺乏特異性[15]。LDH則是心肌主要的功能酶，心肌損傷時入血的CK-MB和LDH可早期反映心肌損傷程度，二者綜合分析診斷可顯著提高急性心肌梗死的早期診斷率。本實驗結果中，模型組CK-MB和LDH含量仍為最高，且在藥物預處理后的心肌組織中檢測到的CK-MB和LDH含量呈藥物依賴作用的降低，說明Wy-14643可減少再灌注后的心肌損傷。同時,任何原因引起過長時間的心肌缺血最終都會發(fā)展為心肌梗死，心肌梗死面積的大小與缺血時間及嚴重程度呈正相關，判斷梗死面積并分級有助于采取階段性臨床措施以改善心功能。梗死面積作為患者死亡率的預測因素，以上方法均可有效、準確、及時地判斷病情，為挽救心肌爭取寶貴時間。本實驗根據心肌梗死區(qū)面積的大小來判斷心肌缺血再灌注后心肌損傷的嚴重程度，并且通過觀察心肌組織病理學變化證實梗死面積最大的模型組心肌組織病理損傷也最嚴重，并據W1、W2、W3組結果推斷出Wy-14643對心肌缺血再灌注損傷可起到保護作用。

NF-κB發(fā)現于B淋巴細胞并幾乎存在所有動物細胞中，具有兩種通路[16]，集體的應激反應、凋亡、免疫及炎癥觸發(fā)均離不開NF-κB的密切調控[17]。本研究進一步從NF-κB信號通路入手，研究Wy-14643是否和MI/RI有關聯。有研究表明，通過抑制NF-κB信號通路的激活可防御脂多糖誘導的炎癥因子的釋放[18]，還可減輕炎癥導致的疼痛感覺[19]。本實驗選用的匹立尼酸作為PPARa激動劑，可通過上調肝細胞內PPARa表達，抑制NF-κB的活化，保護冷保存損傷的肝臟組織。本實驗得出，與假手術組相比，MI/RI組TLR4、NF-κBp65表達水平均上調，表明在MI/RI時可能引發(fā)了由NF-κB介導的炎癥反應；相比于MI/RI組，各藥物組TLR4、NF-κBp65表達減少，且隨劑量增加這種變化逐漸顯著，可能與Wy-14643預處理抑制TLR4/NF-κB信號通路誘導的炎癥反應有關。綜合結果顯示，Wy-14643對心肌缺血再灌注損傷具有保護作用。

綜上，匹立尼酸在癌癥和神經變性的治療很有成效[20]。本實驗以動物水平為例初步證明，匹立尼酸可抑制NF-κB信號通路，降低炎癥反應，對心肌有保護作用。下一步將從體外細胞水平深入研究，將為匹立尼酸在心血管領域的應用提供進一步臨床意義。