顱腦損傷中miRNA潛在的診斷和治療價值的研究進(jìn)展

梁文佳，郭海星，陳 奎，劉震東，遷榮軍

1.河南大學(xué)人民醫(yī)院,河南省人民醫(yī)院，鄭州 450003; 2.河南省人民醫(yī)院脊柱脊髓外科，河南大學(xué)人民醫(yī)院，鄭州大學(xué)人民醫(yī)院，鄭州 450003; 3.河南省人民醫(yī)院神經(jīng)外科,河南大學(xué)人民醫(yī)院，鄭州大學(xué)人民醫(yī)院，鄭州 450003

顱腦損傷作為三大神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，是世界上主要的公共衛(wèi)生安全問題，全世界每年大約有5 000萬人發(fā)生顱腦損傷[1]。在中國，顱腦損傷的病死率高達(dá)13人/10萬人[2]。經(jīng)過治療的顱腦損傷患者也因為存在嚴(yán)重身體、心理和社會缺陷，導(dǎo)致生活質(zhì)量較差，給家庭和社會帶來沉重負(fù)擔(dān)[3]。顱腦損傷具有高致死率和致殘率[1]，因此相較于傳統(tǒng)的藥物、手術(shù)等治療方式，更加有效的生物靶向治療手段對于顱腦損傷患者的預(yù)后至關(guān)重要。除此之外，受傷后簡單有效的診斷方法將迅速幫助醫(yī)師制定診療方案，對于患者的預(yù)后也有重大幫助。目前臨床常用格拉斯昏迷評分量表(GCS)和影像學(xué)檢測技術(shù)(CT和MRI)對顱腦損傷患者做出診斷和制定治療方式，但是均有缺陷[4-5]，所以新型標(biāo)志物是目前臨床當(dāng)中所需要的。例如，在顱腦損傷發(fā)生后立即檢測血清膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)和人泛素C末端水解酶L1(UCH-L1)的新型生物標(biāo)志物已經(jīng)被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FAD)在臨床上獲批使用，可以迅速提高顱腦損傷診斷的速度[6]。除此之外，有新的證據(jù)表明microRNA(miRNA)也可以滿足這一臨床需求。

miRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一類調(diào)節(jié)幾乎所有已知基因表達(dá)的調(diào)節(jié)分子[7]。miRNA是短的(18～25個核苷酸)RNA分子，遵守堿基互補配對原則靶向的與mRNA結(jié)合，進(jìn)而阻遏mRNA翻譯成蛋白質(zhì)[8]，通過調(diào)節(jié)下游目的基因的表達(dá)活性在細(xì)胞生命活動的全過程中發(fā)揮重要作用，例如細(xì)胞周期、細(xì)胞代謝、細(xì)胞凋亡和免疫反應(yīng)等[9-12]。因此，可以說miRNA是人類病理狀態(tài)下有希望用于診斷和治療疾病的生物標(biāo)志物。也有研究報道，miRNA參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和修復(fù)所必需的細(xì)胞過程：分化、增殖、凋亡和代謝[13-14]。并且，miRNA對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有重要調(diào)控作用。例如，在局灶性腦缺血當(dāng)中早期應(yīng)用miR-124能夠顯著升高Arg-1，提高神經(jīng)元存活率，改善神經(jīng)功能缺損[15]。因此，miRNA對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理進(jìn)展和腦功能作用的維持至關(guān)重要。然而，miRNA在顱腦損傷的病理進(jìn)程當(dāng)中發(fā)揮的作用有待完全闡明。本綜述回顧了近年以來miRNA在顱腦損傷中的機制研究和靶向治療的作用，幫助了解miRNA在顱腦損傷中發(fā)揮的調(diào)控效應(yīng)。

1 miRNA表達(dá)水平變化與顱腦損傷的診斷相關(guān)

miRNA可以通過外泌體、微泡或者與高密度脂蛋白等保護性蛋白質(zhì)結(jié)合在細(xì)胞外運輸，這些載體的保護作用使生物流體中的miRNA含量豐富且穩(wěn)定的存在[16]。因此，miRNA的豐富性、在波動pH水平下的穩(wěn)定性、抗酶降解性以及在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中的重要作用，使之成為理想的生物標(biāo)記物。除此之外，miRNA穩(wěn)定的存在腦脊液當(dāng)中，并且可以輕易的穿過血腦屏障到達(dá)血液等體液當(dāng)中參與調(diào)控機體的生命活動[17]，在顱腦損傷發(fā)生后的不同病理狀態(tài)下產(chǎn)生相應(yīng)的表達(dá)水平變化以應(yīng)對環(huán)境帶來的不利因素[18]。因此，監(jiān)測體液中miRNA的變化可能和顱腦損傷的嚴(yán)重程度相關(guān)。已經(jīng)有相關(guān)臨床證據(jù)表明，在顱腦損傷發(fā)生后患者血液當(dāng)中miRNA表達(dá)水平的變化和顱腦損傷的類型是有關(guān)聯(lián)的，見表1。所以，miRNA是一種可以用于診斷顱腦損傷的生物標(biāo)志物。更重要的是，在顱腦損傷后的危急情況下，醫(yī)護人員可以輕易取得患者的血液樣本進(jìn)行檢測用于診斷患者的嚴(yán)重程度，為挽救患者生命節(jié)省時間。

表1 顱腦損傷患者血清和腦脊液中miRNA的表達(dá)水平變化

2 miRNA參與顱腦損傷后神經(jīng)炎癥反應(yīng)

神經(jīng)炎癥是顱腦損傷后的一種自然反應(yīng)，對受損的大腦有一定的保護作用，然而過度的神經(jīng)炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致神經(jīng)元發(fā)生減少和功能恢復(fù)變差的重要原因[27]。據(jù)報道，神經(jīng)炎癥是顱腦損傷的關(guān)鍵因素[28]。因此，抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)可能是減輕腦損傷情況的治療方式。miRNA的表達(dá)水平變化可以調(diào)控顱腦損傷后神經(jīng)炎癥反應(yīng)的強弱。Si等[29]通過構(gòu)建顱腦損傷后小鼠模型，發(fā)現(xiàn)顱腦損傷后的神經(jīng)炎癥的加重與上調(diào)的miR-193a表達(dá)密切相關(guān)，并且通過注射miR-193a抑制劑發(fā)現(xiàn)顱腦損傷后小鼠的損傷體積、腦水含量和神經(jīng)元死亡顯著降低。因此，通過靶向改變miRNA的表達(dá)水平減輕顱腦損傷后的炎癥程度可能成為一種治療顱腦損傷的特效藥物。然而，神經(jīng)炎癥反應(yīng)是一個復(fù)雜的過程，不同的miRNA在顱腦損傷發(fā)生后的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著不同的調(diào)控功能。

神經(jīng)炎癥是一種多方面的反應(yīng)，涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的許多細(xì)胞和炎癥因子[30]。其中，小膠質(zhì)細(xì)胞是引發(fā)炎癥和免疫反應(yīng)的細(xì)胞，當(dāng)其被激活時，迅速遷移到損傷部位，并在顱腦損傷后的神經(jīng)炎癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用[31]。也有相關(guān)研究報道，在小膠質(zhì)細(xì)胞的激活當(dāng)中miRNA充當(dāng)著一個重要角色。Qi等[23]通過RT-qPCR發(fā)現(xiàn)了在顱腦損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞中miR-429過度表達(dá)，在酶聯(lián)免疫吸附試驗中發(fā)現(xiàn)炎性因子過度表達(dá)。隨后，在顱腦損傷后小鼠模型側(cè)腦室注射miR-429的抑制劑后發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞激活顯著降低，并且對于顱腦損傷后的神經(jīng)修復(fù)具有顯著作用。Henry等[32]在成年雄性C57Bl/6小鼠中進(jìn)行受控皮質(zhì)沖擊模型(CCI)模擬顱腦損傷，發(fā)現(xiàn)顱腦損傷引起強烈且持續(xù)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)與小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中miR-155表達(dá)增加相關(guān)，并且在miR-155抑制劑注射后減少創(chuàng)傷后神經(jīng)炎癥反應(yīng)和改善神經(jīng)恢復(fù)。所以，在顱腦損傷后靶向改變miRNA表達(dá)水平抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，進(jìn)而減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)具有潛在的應(yīng)用價值。更重要的是，有研究發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞在顱腦損傷中發(fā)揮作用是基于它們的兩個表型的極化：M1(促炎)型和M2(抗炎)型[33]，合理的運用這把雙刃劍可能也是一種重要的治療方式。有關(guān)于顱腦損傷中miRNA的研究提示了小膠質(zhì)細(xì)胞的極化是受其調(diào)控的。Yang等[34]通過檢測顱腦損傷大鼠模型中小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2型的特征基因和炎癥因子，隨后在大鼠尾靜脈中注射富含miR-124的外泌體，最后通過PCR和酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測到小膠質(zhì)細(xì)胞的M1型特征基因(CD32、IL-1b)和促炎細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)在注射后顯著減少，并且M2型特征基因(CD206、精氨酸酶1)和抗炎細(xì)胞因子(IL-4、IL-10、TGF-β)在注射后顯著升高。揭示了miR-124通過抑制TLR4細(xì)胞信號通路調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的M2型極化參與到顱腦損傷后的神經(jīng)炎癥反應(yīng)的機制，并且注射富含miR-124的外泌體可能是一種潛在的治療顱腦損傷的方式。在Long等[35]的研究中，發(fā)現(xiàn)miR-873a-5p通過促進(jìn)顱腦損傷后的小膠質(zhì)細(xì)胞M2型極化來抑制炎癥反應(yīng)。因此，通過miRNA的表達(dá)水平的變化調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的極化，特別是促進(jìn)顱腦損傷后的小膠質(zhì)細(xì)胞的M2型極化可能是一種潛在的治療策略。除此之外，星形膠質(zhì)細(xì)胞是CNS中最豐富的細(xì)胞類型，在維持微環(huán)境穩(wěn)定性和神經(jīng)元功能中起著至關(guān)重要的作用[36-37]。Korotkou等[38]發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活與炎癥相關(guān)的miR155和miR142表達(dá)增加相關(guān)，可能是參與形成顱腦損傷的重要原因。所以，在顱腦損傷后的神經(jīng)炎癥反應(yīng)當(dāng)中，miRNA也在星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活當(dāng)中發(fā)揮著重要的作用。

3 miRNA參與顱腦損傷后神經(jīng)元細(xì)胞凋亡

神經(jīng)元凋亡是一種以最小的免疫系統(tǒng)激活除去異常的神經(jīng)元的機制[39]，所以顱腦損傷后的神經(jīng)元凋亡可能是對損傷的生理性的保護反應(yīng)。然而，過度的神經(jīng)元凋亡可能加劇顱腦損傷[40]。因此，在顱腦損傷后的病理條件下過度激活凋亡相關(guān)途徑可能是有害的。有研究表明，miRNA作為一種重要的調(diào)控分子參與到了神經(jīng)元的凋亡過程當(dāng)中。Yan等[21]發(fā)現(xiàn)上調(diào)的miR-219a-5p可能抑制神經(jīng)元細(xì)胞中CCNA2和CACUL1的表達(dá)，并進(jìn)一步調(diào)節(jié)akt/Foxo3a和p53/Bcl-2信號通路，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者Caspase-3表達(dá)發(fā)生顯著上調(diào)，從而誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。也有研究表明[41]，在顱腦損傷后小鼠的大腦皮質(zhì)組織和原代皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡模型中發(fā)現(xiàn)miR-23a顯著下調(diào)。隨后，過表達(dá)的miR-23a可以重新激活PTEN/AKT/mTOR信號通路抑制神經(jīng)元的凋亡來保護小鼠顱腦損傷后的CNS的功能。Zhao等[42]發(fā)現(xiàn)顱腦損傷后小鼠腦和血清中miR-203上調(diào)，并且經(jīng)過miR-203抑制劑處理后顯著地抑制顱腦損傷導(dǎo)致的Caspase-3上調(diào)和Bcl-2下調(diào)，減少神經(jīng)元凋亡。所以，在顱腦損傷發(fā)生后神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡與miRNA的調(diào)控效應(yīng)是密切相關(guān)的。更重要的是，通過靶向改變miRNA的表達(dá)水平可以減少過度的神經(jīng)元凋亡保護顱腦損傷后大腦正常功能的行使，這類研究具有重要的研究價值。

4 miRNA參與顱腦損傷后血腦屏障損傷

血腦屏障主要由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(BMVECs)、星形膠質(zhì)細(xì)胞和基底膜組成，是維持正常腦功能的基本結(jié)構(gòu)屏障，可調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、營養(yǎng)物質(zhì)和分子向腦組織運輸，以及代謝廢物從大腦進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)[43]。血腦屏障損傷引起的腦水腫是顱腦損傷預(yù)后不良的主要原因之一[44]。更嚴(yán)重的是，廣泛的血腦屏障損傷可導(dǎo)致全腦水腫，引起顱內(nèi)壓持續(xù)升高，從而導(dǎo)致死亡[45]。有研究發(fā)現(xiàn)，在血腦屏障損傷的病理進(jìn)程當(dāng)中miRNA是一個重要的調(diào)控因素。Wu等[46]的研究通過將BMECs和星形膠質(zhì)細(xì)胞共同培養(yǎng)建立體外血腦屏障模型，發(fā)現(xiàn)miRNA-9-5p的上調(diào)通過激活Hedgehog通路和抑制NF-κB/MMP-9通路減輕了血腦屏障的損傷，促進(jìn)了顱腦損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)。也有研究發(fā)現(xiàn)[47]，顱腦損傷BMVECs中miR-21-3p的增加導(dǎo)致血腦屏障的滲漏增加和緊密連接蛋白表達(dá)減少，加劇顱腦損傷；隨后，miR-21-3p拮抗劑治療可以下調(diào)BMVECs中miR-21-3p表達(dá)直接靶向促進(jìn)MAT2B的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)減輕了血腦屏障的損傷。所以，miRNA通過調(diào)控細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路參與到血腦屏障的損傷過程，靶向抑制顱腦損傷后的血腦屏障破壞對于臨床治療是極具意義的。

5 miRNA參與顱腦損傷后血管形成

在顱腦損傷發(fā)生后，大腦微血管產(chǎn)生損傷會在病灶周圍形成缺血半暗帶，代謝產(chǎn)物的積累加重炎癥反應(yīng)并誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，加重顱腦損傷患者的惡性進(jìn)展[48]。血管形成有利于大腦局部血管的恢復(fù)，可以為神經(jīng)重塑提供神經(jīng)血管基質(zhì)，并促進(jìn)損傷部位神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、遷移和分化[49]。因此，血管形成在顱腦損傷后患者的病情恢復(fù)具有重要價值。現(xiàn)如今，已有相關(guān)證據(jù)表明，miRNA參與顱腦損傷后參與血管形成發(fā)生的機制當(dāng)中[50]。Ge等[51]在構(gòu)建大鼠的液體沖擊顱腦損傷模型后，發(fā)現(xiàn)大鼠腦組織樣本當(dāng)中miR-21顯著上調(diào)，并經(jīng)過側(cè)腦室灌注miR-21類似物或拮抗劑來控制腦內(nèi)miR-21的表達(dá)水平；揭示miR-21的表達(dá)增加可以通過抑制PTEN(miR-21靶基因)的表達(dá)，激活A(yù)kt細(xì)胞信號通路促進(jìn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞中血管形成相關(guān)分子VEGF,Ang-1和Tie-2的增加，進(jìn)而改善顱腦損傷后神經(jīng)系統(tǒng)的遠(yuǎn)期功能。也有證據(jù)表明[52]，miRNA-9-5p的上調(diào)通過抑制Ptch-1的轉(zhuǎn)錄，并且激活Hedgehog通路增加了AKT的磷酸化，從而促進(jìn)了BMVECs中細(xì)胞周期蛋白D1、MMP-9和VEGF的表達(dá)，有利顱腦損傷后的血管生成。因此，miRNA是參與到顱腦損傷后血管形成的病理進(jìn)程當(dāng)中的重要小分子物質(zhì)，利用miRNA類似物或拮抗劑治療顱腦損傷有利于大腦重建側(cè)支循環(huán)，恢復(fù)腦組織局部血流和能量供應(yīng)，有利于神經(jīng)元存活和神經(jīng)功能恢復(fù)。

6 展望

臨床常用的GCS分類和影像學(xué)診斷是有明顯缺陷的，例如CT和MRI操作復(fù)雜、時間長，延誤患者救治時間，GCS分類存在診斷陽性率不足等諸多問題。因此，可以穿過血腦屏障在外周血液中穩(wěn)定存在和輕易檢測的miRNA，必定會成為一種診斷顱腦損傷的重要手段。在腫瘤疾病當(dāng)中miRNA類似物或者拮抗劑已經(jīng)進(jìn)行到臨床實驗當(dāng)中，并且這幾種臨床前制劑具有低毒性和有效載荷到達(dá)靶點的應(yīng)用前景[53]。miRNA的生物靶向治療作用是有目共睹的，在顱腦損傷患者的救治過程當(dāng)中miRNA的生物制劑可成為另一種治療手段，成功的臨床試驗和臨床有效的miRNA藥物必將促進(jìn)這一新興領(lǐng)域的未來。但是，目前與顱腦損傷嚴(yán)重程度相關(guān)的miRNA表達(dá)水平變化的研究僅在小樣本數(shù)據(jù)中進(jìn)行，可能存在一定的統(tǒng)計學(xué)假陽性。除此之外，對于miRNA在顱腦損傷后的神經(jīng)炎癥反應(yīng)、神經(jīng)元凋亡、血腦屏障損傷等病理機制的調(diào)控效應(yīng)僅限于動物實驗和體外實驗當(dāng)中，進(jìn)一步的臨床實驗有待去實施。雖然目前在顱腦損傷中miRNA的研究有很多局限性，但是僅目前的研究結(jié)果已經(jīng)表明了miRNA可多方面和多層面參與到顱腦損傷后的病理變化當(dāng)中并發(fā)揮著重要的作用。因此，進(jìn)一步的研究對于提高顱腦損傷的整體認(rèn)知具有重要意義。更重要的是，miRNA潛在的診斷和靶向治療價值向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化，能使每一名顱腦損傷患者受益匪淺。不難想象，在顱腦損傷的高度異質(zhì)性和復(fù)雜變化當(dāng)中，miRNA的相關(guān)研究是戰(zhàn)勝顱腦損傷的一個契機。

作者貢獻(xiàn)聲明：梁文佳：文獻(xiàn)檢索、論文撰寫；郭海星、陳奎：文章審閱；劉震東：論文修改；遷榮軍：論文選題、撰寫指導(dǎo)及修改