一種新型生物反應(yīng)器的基因測序分析

杜 巍 王 坤 蘆旭飛 葉天彤

（北京京環(huán)新能環(huán)境科技有限公司，北京 100020）

0 引言

垃圾填埋滲瀝液通常指填埋過程中及雨水滲漏產(chǎn)生的液體?；驕y序是指通過對微生物的遺傳基因進(jìn)行測定來確定環(huán)境中微生物的種類和濃度的一種分子生物學(xué)分析方法。16S核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）測序是一種特殊的基因測序方式，其中16S指的是細(xì)菌RNA的沉降系數(shù)，即顆粒在單位離心力場中粒子的移動速度，對大分子物質(zhì)沉降系數(shù)通常在10 s~13 s左右。對細(xì)菌的基因組織進(jìn)行離心沉降后，按照沉降系數(shù)可分為3種，即5S、16S和23S。細(xì)菌的16S RNA高變區(qū)具有明顯的細(xì)菌種屬特征，便于區(qū)分不同細(xì)菌。因此對細(xì)菌16S RNA高變區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測序，再將所得結(jié)果與數(shù)據(jù)庫比較，可以得到樣品中細(xì)菌的菌群結(jié)構(gòu)和多樣性及分布特征。

胡小松等對復(fù)齒鼯鼠干燥糞便樣品中微生物16S RNA基因進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)厚壁菌門（87.68%±2.68%）、擬桿菌門（7.62%±3.74%）為優(yōu)勢菌門。李俊峰基于16S RNA分析流程找出了在胃炎病人和健康人中豐度顯著差異的物種。郝兵兵從膜生物反應(yīng)器（membrane bio-reactor，MBR）反應(yīng)器中分離純化、篩選出一株假單胞菌，該菌株對水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中的硝酸鹽有較好去除效果。

1 材料與方法

1.1 測試方法與流程說明

1.2 樣品分組與多樣性分析方法

該研究將對接種菌種樣品、實際生物反應(yīng)器樣品、曝氣池樣品3類樣品進(jìn)行16S RNA基因測序，得到樣品信息庫，最終根據(jù)結(jié)果進(jìn)行多樣性分析。

對所測樣品根據(jù)其來源分為A、B、C共3組，其中A組為接種菌種樣品組，B組為實際生物反應(yīng)器樣品組，C組為曝氣池樣品組。菌種原樣標(biāo)記為ACJ1；生物反應(yīng)器段標(biāo)記為BZP1、BZP2；曝氣池段標(biāo)記為CBQ1、CBQ2、CBQ3和CBQ4，具體的取樣分組信息見表1。

表1 16S RNA測序分組情況表

這里采取組間進(jìn)行A組與B組BZP1、A組與C組CBQ2、A組與C組CBQ4共3次對比。這一過程將依次采取趙式（the chao1 index，Chao1）菌群豐富度指數(shù)曲線、香農(nóng)-威納（shannon-wiener，Shannon）多樣性指數(shù)曲線、辛普森（ginisimpson，simpson）多樣性指數(shù)曲線以及準(zhǔn)確覆蓋率（Good′s

該研究是針對北京某填埋場的生物反應(yīng)器滲瀝液處理設(shè)施而進(jìn)行的。該處理設(shè)施采用生物反應(yīng)器+曝氣池+膜處理工藝對填埋場滲瀝液進(jìn)行處理，其中生物反應(yīng)器+曝氣池為前端生化處理部分，具體流程圖詳如圖1所示。該研究旨在通過16S RNA基因測序研究能夠適應(yīng)垃圾滲瀝液這種高鹽高氨氮環(huán)境的微生物的種群分布及主要功能菌。coverage）測序深度曲線對OTU數(shù)據(jù)測定結(jié)果進(jìn)行全面和準(zhǔn)確性檢驗，確保后續(xù)利用OTU數(shù)據(jù)得到正確的分析結(jié)論。

圖1 生物反應(yīng)器-膜處理工藝流程示意圖

chao1指數(shù)稀釋曲線指的是用chao1算法估計群落中含OTU數(shù)目的指數(shù)，是一種生態(tài)學(xué)中常用的估計物種總數(shù)的方法，如公式（1）所示。

式中：1是估計的OTU數(shù)；是實際觀察的OTU數(shù)；是只有1條序列的OTU數(shù)目；是只有2條序列的OTU數(shù)目。

shannon-wiener指數(shù)稀釋曲線，反映樣品中微生物多樣性的指數(shù)，利用各樣品的測序量在不同測序深度時的微生物多樣性指數(shù)構(gòu)建曲線，以此反映各樣本在不同測序數(shù)量時的微生物多樣性。

計算指數(shù)如公式（2）所示。

式中：為-指數(shù)。各種之間，個體分配越均勻，值就越大；為個體序號。為樣品中屬于第種的個體的比例，如樣品總個體數(shù)為，第種個體數(shù)為，則=/。

Simpson指數(shù)稀釋曲線在生態(tài)學(xué)中常常用來定量描述一個區(qū)域的生物多樣性。當(dāng)樣品中只有1個物種時（即所有序列都代表同一個物種），值為0；當(dāng)樣品中各物種均勻分布時，值為1。Simpson指數(shù)值越大，越均勻，群落多樣性越高。Simpson指數(shù)計算公式如公式（3）所示。

式中：為Simpson指數(shù)；n為樣品中含條序列的OTU 數(shù)；為樣品總序列數(shù)。

Good′s coverage指數(shù)稀釋曲線用于評估測序結(jié)果代表的菌種群落中物種的總數(shù)，常用于評估測序深度是否足夠。其計算公式如公式（4）所示。

式中：為Good's coverage指數(shù)；為樣本中OTUs的數(shù)量；為OTUs總豐度。

2 組間對比分析

2.1 ACJ1與 BZP1對比分析

ACJ1與BZP1這2組數(shù)據(jù)的多樣性對比見表2。從表2中可以明顯看出，ACJ1與BZP1從多種測試方法角度來看均存在較大差異。實際操作過程中，ACJ1為培養(yǎng)初期所使用的菌種，BZP1為經(jīng)過長時間馴化后實際生物反應(yīng)器工藝段中存在的菌種。顯然，實際過程中菌種組成已發(fā)生了較大改變，因此后續(xù)將單獨探究BZP1為代表的生物反應(yīng)器工藝段中的優(yōu)勢菌，以探究滲瀝液處理中的脫氮優(yōu)勢菌。

表2 ACJ1與BZP2測定結(jié)果對比表

2.2 ACJ1與 CBQ2對比分析

ACJ1與CBQ2兩組數(shù)據(jù)的多樣性對比見表3。從表3中可以明顯看出，ACJ1與CBQ2從多種測試方法角度來看均存在較大差異。實際操作過程中，ACJ1為培養(yǎng)初期所使用的菌種，CBQ2為經(jīng)過長時間馴化后曝氣池工藝段中存在的菌種。顯然，實際過程中菌種組成已發(fā)生了較大改變，因此后續(xù)將單獨探究CBQ2為代表的曝氣池工藝段中的優(yōu)勢菌，以探究滲瀝液處理中的脫氮優(yōu)勢菌。

表3 ACJ1與CBQ2測定結(jié)果對比表

上述分析證明所得OTU數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性和多樣性滿足后續(xù)分析要求，因此進(jìn)入下一步分析階段。

3 豐度分析

3.1 接種原樣豐度圖

接種原樣分析圖見圖2及表4。

圖2 接種原樣菌種豐度分布圖

表4 接種原樣菌種占比表

從圖2及表4中可以看出，主要優(yōu)勢門類為變形菌門和厚壁菌門，其中厚壁菌門主要為梭狀芽胞桿菌綱、桿菌綱。

這里對廠家接種樣品的思路做如下猜想。1） 先利用變形菌門內(nèi)的各種細(xì)菌的不同適應(yīng)性，在不良水質(zhì)下迅速繁殖并有效提升污泥濃度，與此同時若生存環(huán)境仍過于惡劣，芽孢桿菌釋放芽孢，并進(jìn)入休眠狀態(tài)，等待后續(xù)環(huán)境改善后重新恢復(fù)活力。2） 變形菌門內(nèi)的各種細(xì)菌大量繁殖后逐步改善水質(zhì)，進(jìn)入生長穩(wěn)定期，同時，芽孢桿菌開始恢復(fù)活力，進(jìn)入繁殖階段并進(jìn)一步改善水質(zhì)。3） 主要菌種繁殖基本結(jié)束，進(jìn)入穩(wěn)定運行狀態(tài)，工藝出水逐漸穩(wěn)定。

3.2 生物反應(yīng)器樣品分析

生物反應(yīng)器樣品豐度圖見圖3及表5。

從圖3及表5中可以看出，主要優(yōu)勢門類為變形菌門和似桿菌門，其中似桿菌門主要為黃桿菌綱、似桿菌綱和嗜鹽細(xì)菌綱。變形菌門為接種樣品中中添加較多的部分，該部分的存在符合正常規(guī)律。接種樣品中本不屬于優(yōu)勢菌種的似桿菌最終數(shù)量超越了厚壁菌成了第2類優(yōu)勢菌種，這說明安定填埋場的水質(zhì)和處理環(huán)境較為適宜似桿菌門的生長，而厚壁菌門的細(xì)菌相對不適應(yīng)上述環(huán)境，因此推斷安定衛(wèi)生填埋場生物反應(yīng)器工藝實際對TN去除占主導(dǎo)作用的桿狀細(xì)菌主要為似桿菌門類的各類細(xì)菌，如后續(xù)需要加強(qiáng)處理效果，可考慮適當(dāng)投加對應(yīng)菌種。

表5 生物反應(yīng)器菌種占比表

圖3 生物反應(yīng)器菌種豐度分布圖

3.3 曝氣池樣品分析

曝氣池樣品豐度圖見表6。

表6 （a）曝氣池1-1菌種占比表

表6 （b）曝氣池1-2菌種占比表

表6 （c）曝氣池1-3菌種占比表

從表6可以看出，主要優(yōu)勢門類為變形菌門和似桿菌門，其中似桿菌門主要為黃桿菌綱、似桿菌綱和嗜鹽細(xì)菌綱。變形菌門為接種樣品中中添加較多的部分，該部分的存在符合正常規(guī)律。與轉(zhuǎn)盤情況類似，接種樣品中本不屬于優(yōu)勢菌種的似桿菌最終數(shù)量超越了厚壁菌成了第2類優(yōu)勢菌種，進(jìn)一步證實了安定填埋場的水質(zhì)和處理環(huán)境更適宜似桿菌門的生長。同時雖然圖中沒有顯示，但在表6（a）和表6（d）的結(jié)果中都存在含量為0.5%以下的產(chǎn)甲烷菌，證明控制溶解氧后即使不接種也能夠產(chǎn)生相關(guān)厭氧細(xì)菌，只是濃度受限。同時參考處理效果可以看出，曝氣池和生物反應(yīng)器菌種類別和含量基本相近，只是因為曝氣量和整體結(jié)構(gòu)不同而導(dǎo)致處理效果有所差異。

表6 （d）曝氣池1-4菌種占比表

4 結(jié)論

接種原樣中主要優(yōu)勢門類為變形菌門和厚壁菌門，其中厚壁菌門主要為梭狀芽胞桿菌綱、桿菌綱；生物反應(yīng)器樣品中主要優(yōu)勢門類為變形菌門和似桿菌門，其中似桿菌門主要為黃桿菌綱、似桿菌綱和嗜鹽細(xì)菌綱；曝氣池樣品中主要優(yōu)勢門類為變形菌門和似桿菌門，其中似桿菌門主要為黃桿菌綱、似桿菌綱和嗜鹽細(xì)菌綱。曝氣池和生物反應(yīng)器菌種類別和含量基本相近，只是因為曝氣量和整體結(jié)構(gòu)不同而導(dǎo)致處理效果有所差異；在曝氣量充足的情況下，似桿菌將逐漸取代厚壁菌成為生物除氮作用的優(yōu)勢菌種。