骨髓間充質(zhì)干細胞聯(lián)合納米羥基磷灰石膠原蛋白復(fù)合支架修復(fù)兔節(jié)段性骨缺損的實驗研究*

吳啟潤 周東明 呂曉峰 段文禹 王孟輝 高巖

四肢長骨節(jié)段性骨缺損的修復(fù)一直是臨床治療的難題[1]。臨床上，傳統(tǒng)治療方法具有一定的缺點如自體骨移植易造成二次損傷、感染；異體骨移植存在疾病傳播風(fēng)險、骨愈合緩慢及免疫排斥等[2-3]。而通過膜引導(dǎo)下骨再生技術(shù)是治療節(jié)段性骨缺損的一種新思路和新方法[4-5]。但目前制備的膜管生物力學(xué)強度不高，不足以保持相應(yīng)的膜管下容積，活動后導(dǎo)致膜管移位、變形，影響膜下新骨形成、重塑，從而限制了其臨床應(yīng)用[6-7]。Ilizarov 技術(shù)通過牽張作用治療骨缺損，但該方法產(chǎn)生釘?shù)栏腥?、過程痛苦，且對患者心理健康產(chǎn)生不利影響[8]，臨床上尚無有效方法治療長段骨缺損。

近年，探索引導(dǎo)性骨再生材料修復(fù)骨缺損已經(jīng)成為骨科領(lǐng)域的一個研究熱點。將納米羥基磷灰石（nanometer hydroxyapatite，Nano-HA）與膠原蛋白以一定的方式復(fù)合以后得到類似自然骨骼的結(jié)構(gòu)，可作為骨修復(fù)材料。納米羥基磷灰石強度高，鈣磷結(jié)構(gòu)接近于自然骨骼，生物相容性好；Ⅰ型膠原蛋白具有免疫原性低，易降解等特點，同時它影響細胞的分化增殖，參與細胞代謝的多個過程，是保持細胞正常功能不可缺少的物質(zhì)。骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）能夠多向誘導(dǎo)分化潛能，擴增能力強。本實驗采用BMSCs 聯(lián)合納米羥基磷灰石膠原蛋白（Nano-HA/COL）復(fù)合支架，植入兔骨缺損處，觀察其修復(fù)效果。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 LIVE/DEAD 染色試劑盒（美國Life Technologies 公司）；注射用青霉素鈉（生產(chǎn)廠家：山東圣旺藥業(yè)股份有限公司，批準文號：獸藥字150061248，規(guī)格：160 萬單位/支）；超低溫冰箱（Hermo Fisher Scientific 公司）；戊二醛消毒熏箱（江蘇泰州宏泰實驗設(shè)備廠）；流式細胞儀（美國Beckman Coulter 公司）；胎牛血清（FBS）（美國Gibico 公司）；PBS 緩沖液（美國 Hyclone 公司）；1 mL 一次性注射器（山東威高股份有限公司）；Ⅰ型膠原蛋白（蘇州天可貿(mào)易有限公司）；二氧化碳孵育箱（美國Thermo Fisher 公司）。

1.2 實驗動物 國產(chǎn)家兔30 只[2 月齡，體重2～2.5 kg，不限雌雄，由包頭醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供動物許可證：SCXK（蒙）2014-0003]。實驗操作在包頭醫(yī)學(xué)院動物實驗中心進行，實驗過程通過包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批（編號20210011）。

1.3 方法

1.3.1 納米羥基磷灰石膠原蛋白復(fù)合支架的制備 將Nano-HA 微粒（40 nm）與聚乙烯亞胺按3︰2比例混合制成凝膠，凝膠與1%發(fā)泡劑聚氧乙烯十二烷基醚混合直至泡沫狀，加入交聯(lián)劑凝固。倒入管狀模具待HA 凝膠成型后取出，冷凍干燥并在1 200 ℃下熱凝結(jié)成HA 管。稱取450 mgⅠ型膠原蛋白放入50 mL 的0.50 mol/L 醋酸溶液，攪拌使溶質(zhì)充分溶解后經(jīng)1 mol/L 的NaOH 使pH 值接近7。將制備的HA 管置入溶液后冷凍4 h，移入冷凍干燥機中，UV 射線照射支架可制得已干燥成型的納米“羥基磷灰石-膠原蛋白”管狀支架材料。大體外觀及電鏡下微觀結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 納米“羥基磷灰石-膠原蛋白”管狀支架材料

1.3.2 家兔骨髓間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng) 10% 水合氯醛2.5～3 mL/kg 腹腔注射麻醉，常規(guī)髂區(qū)備皮、消毒、鋪巾。16 號骨穿針接10 mL 注射器（含稀釋的肝素鈉）在髂骨穿刺獲得紅骨髓5 mL，注射入適量的L-DMEM 培養(yǎng)基中，以200 目濾網(wǎng)濾過后，置于轉(zhuǎn)速離心機離心8 min 去上清液，用L-DMEM培養(yǎng)液懸浮沉淀，制成單細胞懸液。細胞按1×108/L 濃度接種培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。定量換液，待細胞生長到90% 時用0.25% 胰蛋白酶消化。鏡下觀察細胞相互分離后停止消化，按1×106/L 濃度接種，傳代培養(yǎng)，鏡下觀察。見圖2。

圖2 倒置相差顯微鏡下兔BMSCs形態(tài)（P3×10）

1.3.3 兔骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）表面抗原的檢測 取P3 代的BMSCs，濃度為1×109/L 置于離心機中，離心5 min 去上清液，加PBS 緩沖液吹打均勻，取細胞懸液至EP 管，分別加入適量CD29、CD34、CD44、CD166 抗體，避光下孵育30 min，PBS 緩沖液去除未結(jié)合抗體，離心機離心5 min 后去除上清液，每管加PBS 緩沖液后檢測。

1.3.4 骨髓間充質(zhì)干細胞接種納米羥基磷灰石膠原蛋白支架 納米羥基磷灰石膠原蛋白支架浸泡于適量DMEM 培養(yǎng)液后呈膠狀，環(huán)氧乙烷消毒。取P3代BMSCs 懸液與Nano-HA 凝膠振蕩復(fù)合8 min，然后塑形為長16 mm、直徑4 mm 的圓柱狀，置CO2培養(yǎng)箱孵育2 h 備用。

1.3.5 活死細胞檢測細胞活性 將接種BMSCs 的Nano-HA/COL 支架用LIVE/DEAD 細胞染色試劑進行染色，在高倍熒光顯微鏡下觀察。

1.3.6 實驗分組及兔雙側(cè)尺骨缺損模型的建立 取家兔30 只，2 月齡，體重2～2.5 kg，隨機分為空白組、單純支架組、實驗組，每組10 只。每只家兔水合氯醛腹腔注射麻醉，無菌條件下暴露雙側(cè)前臂尺骨，在尺骨骨干中段制成16 mm 節(jié)段性骨缺損，見圖3A?？瞻捉M不植入材料；單純支架組植入Nano-HA/COL 支架，見圖3B；實驗組植入BMSCs復(fù)合的Nano-HA/COL 支架，逐層縫合傷口，見圖3C、圖3D；各組均不做內(nèi)外固定。術(shù)后每日觀察動物情況并肌注青霉素40×104U/d，共3 d。每組術(shù)后8、12 周空氣栓塞處死5 只兔子獲取尺骨局部標本進行大體標本觀察和組織染色，判斷各組骨缺損修復(fù)情況。

圖3 尺骨缺損模型的建立

1.4 觀察指標及判定標準

1.4.1 大體形態(tài)觀察 觀察所有家兔術(shù)后活動、飲食、傷口愈合情況，取雙側(cè)尺骨標本觀察其大體形態(tài)、材料表面吸收的情況、缺損處修復(fù)情況。

1.4.2 X 射線觀察 分別于術(shù)后8、12 周對每組動物進行手術(shù)部位X 射線檢查，根據(jù)Lane-Sandhu X射線評分標準進行評分[9]，見表1。

表1 Lane-Sandhu X射線評分標準

1.4.3 組織形態(tài)學(xué)分析 獲取兔雙側(cè)尺骨缺損包括正常骨端5 mm 的部位標本，經(jīng)甲醛固定、脫鈣、乙醇脫水，石蠟包埋后切片，行HE 染色。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件分析，計量資料用（）表示，多組之間采用單因素方差分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨髓間充質(zhì)干細胞在納米羥基磷灰石膠原蛋白支架上的細胞活力 將BMSCs 與Nano-HA/COL 支架復(fù)合后進行LIVE/DEAD 染色，觀察到細胞均勻分布于支架材料中，多數(shù)細胞均呈現(xiàn)綠色熒光（活細胞），見圖4。

圖4 BMSCs在Nano-HA/COL支架上的細胞活力（×200）

2.2 大體標本形態(tài)觀察 術(shù)后家兔進食及活動正常，切口無發(fā)紅、腫脹等炎癥反應(yīng)。術(shù)后8 周時：空白組骨缺損骨面清晰，兩端骨質(zhì)硬化，新骨形成少，骨缺損未能修復(fù)；單純支架組填充材料少量降解，材料與骨分界較清楚；實驗組填充材料部分降解，與骨界面較模糊，可見少量骨痂形成，與宿主骨組織結(jié)合緊密。術(shù)后12 周時：空白組骨缺損骨面清晰，可見少量新骨形成，比術(shù)后8 周時明顯；單純支架組植入材料基本降解，骨缺損部分修復(fù)，缺損區(qū)見大部分骨痂組織，斷端處模糊；實驗組植入材料明顯降解，骨痂形成進一步增多，與宿主骨組織結(jié)合緊密，材料與宿主骨基本融合，骨皮質(zhì)連續(xù)，骨缺損大部分修復(fù)。見圖5。

圖5 術(shù)后大體形態(tài)觀察

2.3 X 射線檢查 根據(jù)Lane-Sandhu X 射線評分標準來評估骨形成評分，取其平均值作為結(jié)果統(tǒng)計，術(shù)后8 周每組雙側(cè)尺標本個數(shù)為20，術(shù)后12 周每組雙側(cè)尺標本個數(shù)為10。術(shù)后8、12 周，實驗組X 射線骨形成評分均高于空白組和單純支架組，且單純支架組均高于空白組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2。術(shù)后8 周：空白組骨缺損兩端有無骨痂形成，髓腔未通，可見明顯骨缺損，并無骨性連接，見圖6A；單純支架組填充材料與宿主骨分界清楚，見圖6B；實驗組材料密度高于宿主骨密度，材料填充處有明顯鈣化影并與宿主骨分界清楚，見圖6C。術(shù)后12 周：空白組骨缺損區(qū)兩端髓腔未通，斷端形成少量骨痂，骨缺損周圍高密度略高，無骨性連接見圖6D；單純支架組和實驗組，材料與宿主骨之間無明顯骨折界線見圖6E；材料已溶解性吸收、髓腔再通，皮質(zhì)骨連續(xù)，尤以實驗組明顯，見圖6F。

圖6 X射線檢查骨缺損處

表2 Lane-Sandhu X射線骨形成評分[分，（）]

表2 Lane-Sandhu X射線骨形成評分[分，（）]

*與空白組比較，P<0.01；#與單純支架組比較，P<0.01。

2.4 組織形態(tài)學(xué)分析 術(shù)后8 周：空白組斷端出現(xiàn)少量的骨基質(zhì)，髓腔未通，見圖7A；單純支架組材料未降解，可見纖維肉芽組織，骨小梁形成，但排列混亂，見圖7B；實驗組材料大部分降解，骨缺損區(qū)可見骨小梁，可見新生骨組織形成，見圖7C。術(shù)后12 周：空白組骨缺損區(qū)為纖維組織連接，少量的骨基質(zhì)，髓腔封閉，少量骨小梁形成，排列混亂，骨缺損未修復(fù)，見圖7D；單純支架組，材料基本降解，纖維組織填充，見新生骨小梁形成，骨小梁排列混亂，可見髓腔脂肪組織，見圖7E；實驗組材料完全降解，骨缺損區(qū)可見少量纖維結(jié)締組織，骨小梁較粗大，骨小梁排列有序，可見骨髓脂肪組織，髓腔再通，骨缺損基本修復(fù)，見圖7F。

圖7 骨缺損處HE染色（10×20）

3 討論

骨缺損是臨床中常見的損傷，臨床上治療骨缺損是依靠自體骨或同種異體骨移植[10]。髂嵴的祖細胞和生長因子豐富，移植取材方便，手術(shù)操作簡單，成為移植骨的主要來源[11]。但是，自體骨取骨時會造成供體部位血管神經(jīng)損傷、深部感染等嚴重并發(fā)癥，同時，自體骨移植尚存在骨塊尺寸、形狀和數(shù)量的限制及骨塊易發(fā)生移位、被吸收、脫出等問題。目前，骨組織工程支架修復(fù)節(jié)段性骨缺損是一種創(chuàng)新方法[12]。骨組織工程通過生物材料、細胞和細胞因子的組合來促進骨缺損的修復(fù)，支架起著核心作用，它們不僅為細胞生長提供空間結(jié)構(gòu)，還能夠促進新組織向特定結(jié)構(gòu)生長[13-14]。Nano-HA 是骨組織工程中常用細胞載體基質(zhì)材料，它溶解度高，抗疲勞、抗拉伸能力強，同時具有類似天然骨的多孔結(jié)構(gòu)，很適合作為移植載體使用[15]。BMSCs 在基因工程、骨組織工程中的應(yīng)用價值得到廣泛關(guān)注[16-17]。BMSCs 增殖能力強、可多向誘導(dǎo)分化[18]。隨后大量的實驗及臨床研究證實了BMSCs 結(jié)合支架材料治療骨缺損的可行性[19]。

本研究制作兔尺骨中段16 mm 的骨缺損模型，不保留骨膜的全段骨缺損，排除骨膜對成骨的影響，這使得實驗更充分體現(xiàn)復(fù)合支架的成骨性能。LIVE/DEAD 染色結(jié)果表明：兔BMSCs 與Nano-HA/COL 支架復(fù)合后，大部分呈綠色熒光，表明細胞基本能夠存活，細胞與材料之間存在良好的生物相容性；術(shù)后家兔進食及活動正常，切口無發(fā)紅、腫脹、滲液等炎癥征象，無嘔吐、厭食，表明了實驗材料的生物相容性好。實驗結(jié)果表明，X 射線檢查中在相同時間段內(nèi)空白組骨缺損區(qū)兩端髓腔未通，骨缺損周圍密度略高，無骨性連接。單純支架組材料與宿主骨之間無明顯骨折界線，材料已溶解性吸收、髓腔相通。實驗組材料幾乎完全溶解性吸收、皮質(zhì)連續(xù)，骨缺損大部分修復(fù)。根據(jù)表2 術(shù)后8、12 周Lane-Sandhu X 射線評分：實驗組>單純支架組>空白組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），可視為實驗組修復(fù)效果優(yōu)于單純支架組、空白組。組織學(xué)檢測中，在相同時間段內(nèi)空白組骨缺損區(qū)為纖維組織連接，少量的骨基質(zhì)及鈣鹽沉積，無連續(xù)的新生骨形成。單純支架組植入材料進一步降解，骨缺損區(qū)可見少量纖維結(jié)締組織，新生骨小梁形成，髓腔再通，骨缺損基本修復(fù)，但骨修復(fù)實驗組較為明顯?？傊ㄟ^術(shù)后的X 射線攝片、大體觀察、組織學(xué)檢查方面，觀察到在相同時間段內(nèi)，植入BMSCs 復(fù)合的Nano-HA/COL 支架的家兔觀察指標的結(jié)果均要好于單純植入Nano-HA/COL 支架和不植入任何材料的家兔，并且單純植入納米羥基磷灰石膠原蛋白支架的家兔骨修復(fù)作用要好于不植入材料。說明了納米羥基磷灰石復(fù)合膠原蛋白具有良好的骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)作用。這兩種材料組成的復(fù)合骨可以作為一種新型的骨缺損修復(fù)材料。

本實驗骨缺損的修復(fù)主要有以下方面：Nano-HA/COL 支架聯(lián)合BMSCs 具備了良好的成骨活性：納米羥基磷灰石（nHA）化學(xué)成分和表面特性影響著細胞的生存、附著、遷移分化和增殖[20]；互通的多孔系統(tǒng)是骨支架材料的重要參數(shù)：納米羥基磷灰石膠原蛋白支架為圓柱狀立體結(jié)構(gòu)，內(nèi)部有連通的三維結(jié)構(gòu)，孔隙率為（70±15）%，孔徑為500～600 μm，孔隙連通率為99%，促進成骨細胞的長入，有利于周圍的細胞因子的附著和增生，逐漸分化為新骨組織，同時納米羥基磷灰石逐漸分解，最終被新骨組織替代；良好的生物相容性：術(shù)后家兔進食、活動正常，切口無發(fā)紅、腫脹等炎癥反應(yīng)。本實驗結(jié)果表明Nano-HA 及其復(fù)合材料與BMSCs 具有顯著的成骨作用，為重建骨缺損及臨床應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。但迄今為止，達到組織工程支架材料要求的理想的組織工程化產(chǎn)品還有許多問題需要探索和解決，組織工程化骨的構(gòu)建還需進一步研究。