丙烯酰胺/羧甲基纖維素/生物炭復(fù)合水凝膠對(duì)煙苗鎘脅迫的緩解效應(yīng)研究

杜 甫 夏茂林 劉新源 于兆錦 張 展 劉云飛 姬小明

（1河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，450002，河南鄭州；2湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，430040，湖北武漢；3河南省三門峽市煙草公司技術(shù)中心，472400，河南三門峽；4河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，450008，河南鄭州）

鎘（Cd）是土壤重金屬污染的主要來源之一，威脅動(dòng)植物和人類健康[1]。土壤中的Cd被作物吸收和積累后，通過食物鏈進(jìn)入人體，嚴(yán)重破壞腎臟和骨骼[2]。Cd可直接影響植物生長(zhǎng)和發(fā)育[3]，抑制葉綠素合成，從而阻礙光合作用[4]。此外，Cd還能抑制植物的抗氧化酶活性[5]。如何降低植物Cd污染是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。向土壤添加改良劑和穩(wěn)定劑被認(rèn)為是經(jīng)濟(jì)、有效和可持續(xù)的修復(fù)方法[6]。

水凝膠具有豐富的官能團(tuán)和特殊的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，是一種有效的吸附劑，可去除廢水中的重金屬[7]。前人[8]制備水凝膠用于吸附水中污染物，達(dá)到了顯著的效果。此外，水凝膠在去除土壤污染物方面也具有良好的效果[9]。生物炭是一種經(jīng)濟(jì)型的固體產(chǎn)品，是通過植物材料限氧熱解衍生而來的有機(jī)材料，富含官能團(tuán)和密集的孔洞，已被廣泛用于修復(fù)和鈍化重金屬[10]。據(jù)報(bào)道[11-12]，生物炭可有效地吸附水和土壤中的重金屬污染物。Bandara等[11]發(fā)現(xiàn)，生物炭可以將水中的Cd降低至世界衛(wèi)生組織要求的最低水平。Wang等[12]指出，生物炭可以降低植物體的Cd濃度。

煙草是一種特殊的經(jīng)濟(jì)作物，對(duì)Cd的富集能力很強(qiáng)[13]。研究[14]表明，Cd脅迫會(huì)抑制煙草生長(zhǎng)發(fā)育。目前，關(guān)于花生殼生物炭復(fù)合水凝膠鮮有文獻(xiàn)報(bào)道，將該水凝膠用于緩解煙苗Cd脅迫的研究尚屬空白。本研究結(jié)合水凝膠和生物炭在吸附重金屬方面的優(yōu)勢(shì)，制備了新型花生殼生物炭復(fù)合水凝膠，探討了其緩解煙苗Cd脅迫的效應(yīng)，為緩解煙苗Cd脅迫提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 水凝膠的制備及表征

1.1.1 化學(xué)試劑 羧甲基纖維素鈉（CMC，聚合度為800～1200），丙烯酰胺（AM）、過硫酸銨（APS）和N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺（MBA）購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，Cd(NO3)2·4H2O（上海伊恩試劑有限公司），三氟乙酰胺（BSTFA）、N，N'-二甲基甲酰胺（DMF）和CH2Cl2由天津大茂化學(xué)試劑廠生產(chǎn)。上述試劑均為分析純，試驗(yàn)用水均為去離子水?；ㄉ鷼ど锾浚˙）由河南惠農(nóng)土質(zhì)保育有限公司提供（450℃，灼燒4h）。

1.1.3 水凝膠AM/CMC/B的制備 將CMC 1.0g和100mL去離子水置于100mL燒杯中，攪拌直至CMC完全溶解。然后將AM 8.0g和B 4.0g加入燒杯中。之后加入APS 0.09g和MBA0.045g，并用玻璃棒攪拌均勻，調(diào)節(jié)磁力攪拌器轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/min，水浴溫度為60℃，反應(yīng)3h，得水凝膠AM/CMC/B。

將制備的水凝膠AM/CMC和AM/CMC/B在去離子水中吸水24h使其充分溶脹，然后用去離子水沖洗不小于3次。再將其置于60℃真空干燥箱中干燥至恒重，利用粉碎機(jī)粉碎，用0.3mm（60目）孔徑篩過濾，密封保存于真空干燥器中。

1.1.4 水凝膠的表征 將2種水凝膠樣品與KBr混合壓片，在4000～500/cm的條件下，利用Nicolet iS10型傅里葉變換紅外光譜儀測(cè)定2種水凝膠的FT-IR圖譜。

1.1.5 水凝膠對(duì)Cd2+的吸附性能研究 分別取AM/CMC和AM/CMC/B各0.05g干凝膠加入到100mL Cd2+溶液中。研究固定溫度（25℃）、干凝膠量（0.05g）、固定初始Cd2+濃度（200mg/L）和不同pH（2～6）條件下，2種水凝膠對(duì)Cd2+的平衡吸附量（Qe）。吸附試驗(yàn)在100mL塑料瓶中進(jìn)行，調(diào)節(jié)振蕩器速度為150轉(zhuǎn)/min。達(dá)到平衡后，通過Vista-MPX ICP-OES電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀測(cè)定Cd2+的濃度。最后，2種水凝膠的最大吸附容量（Qm）通過以下等式計(jì)算：

式中，C0和Ce分別是溶液中Cd2+初始濃度和最終濃度（mg/L）。V和m分別是Cd2+溶液的體積（L）和2種干燥凝膠的質(zhì)量（g）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

土壤取自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)許昌校區(qū)（總Cd 0.13mg/kg，pH 7.6，有機(jī)質(zhì)19.09g/kg，堿解氮74.70mg/kg，有效磷8.70mg/kg，速效鉀114.50mg/kg，水溶性氯24.80mg/kg）。將擁有4片真葉的煙苗移栽至塑料盆內(nèi)，塑料盆的尺寸為7cm×7cm（直徑×高），每盆裝風(fēng)干土200g。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)處理，CK（空白對(duì)照，不添加任何水凝膠）、H（每盆添加干凝膠AM/CMC 0.50g）、BH（每盆添加干凝膠AM/CMC/B 0.50g），每個(gè)處理的10株煙苗作為重復(fù)。移栽前，將干凝膠和干土混合均勻，然后將10mg/kg的Cd2+溶液等量加入到每個(gè)盆中。為防止Cd2+滲出，每個(gè)盆底部用膠帶密封。將移栽后的煙苗置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為25℃±1℃，每天光照16h。培養(yǎng)15d后對(duì)煙苗進(jìn)行拍照和指標(biāo)測(cè)定，同時(shí)取煙葉樣品用液氮冷凍后儲(chǔ)存于-80℃冰箱中，進(jìn)行后續(xù)分析。

風(fēng)影明白，當(dāng)年那個(gè)纏著他將竹笛子帶來的小姑娘已經(jīng)消失了，取而代之的已是一個(gè)世俗的婦人。說來，紅琴的那個(gè)世界更有存在的理由，人不能不食五谷雜糧，不能生活在一個(gè)沒有人間煙火味的夢(mèng)境之地，世外桃源是不存在的。東泉嶺的茶樓再美再好，也不能成為紅塵世界的避難所，不能成為另一種寺院。茶樓不開在古色古香的東白湖古鎮(zhèn)上，而開在這個(gè)荒山野嶺，也只有他這個(gè)還俗的和尚才能想得出來，或許是他的骨子里依然有著一種看破紅塵四大皆空從而遁入空門隱居起來的出世情結(jié)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 煙苗表型記錄及生長(zhǎng)指標(biāo) 采用尼康D610相機(jī)分別于Cd脅迫0和15d對(duì)煙苗表型進(jìn)行拍照。用EPSON Perfectio V800 Photo根系掃描儀（日本EPSON公司）掃描煙苗根系獲得根系圖片，利用根系分析軟件WinRHIZO對(duì)煙苗根系生長(zhǎng)指標(biāo)進(jìn)行分析。手工測(cè)定煙苗的最大葉長(zhǎng)、最大葉寬和最大葉面積。

1.3.2 生物量和相對(duì)含水量（RWC） 在Cd脅迫15d后，采用文獻(xiàn)[15]的方法測(cè)定煙苗的生物量，并利用公式計(jì)算新鮮煙葉的RWC：

式中，F(xiàn)W（g）為新鮮煙葉飽和吸水后的質(zhì)量，TW（g）為新鮮煙葉的質(zhì)量，DW（g）為新鮮煙葉的干重。

1.3.3 光合作用和相對(duì)葉綠素含量（SPAD值） 參照文獻(xiàn)[16]方法，采用LI-6400型光合儀（美國(guó)LICOR公司）測(cè)定煙苗葉片凈光合速率（Pn）、胞間CO2濃度（Ci）、蒸騰速率（Tr）和氣孔導(dǎo)度（Gs）。采用SPAD 502型便攜式葉綠素儀測(cè)定SPAD值。

1.3.4 丙二醛（MDA）含量和抗氧化酶活性 參照文獻(xiàn)[17]的方法測(cè)定葉片中MDA含量，并采用北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定葉片脯氨酸（Pro）含量、過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）活性。

1.3.5 代謝物種類和含量 稱量冷凍干燥的煙草粉末20mg于2mL離心管中，然后加入內(nèi)標(biāo)萃取物1.5mL（1L CH2Cl2含有2.5mg十三烷基酸），在室溫下攪拌均勻，然后超聲60min。經(jīng)氮?dú)獯蹈珊?，加入衍生化試劑（BSTFA/DMF，體積比1:1），采用美國(guó)安捷侖7890B-5977A型氣質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定煙草代謝物的種類和含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用DPS 7.0軟件進(jìn)行差異性分析，用Graph Pad Prism 8.0和AI 2017軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 水凝膠FT-IR分析

如圖1所示，AM/CMC和AM/CMC/B水凝膠均含有AM和CMC單元的特征官能團(tuán)。對(duì)于生物炭，3392/cm的峰歸因于-OH。1600/cm處的峰是由生物炭中的C＝C拉伸振動(dòng)引起的。另外，在1035/cm處存在顯著的峰帶，其對(duì)應(yīng)于纖維素和半纖維素C－O的拉伸。如圖1（a）所示，AM/CMC/B水凝膠的峰含有B和AM/CMC的特征峰，AM/CMC/B的峰型是B和AM/CMC峰的疊加，紅外譜圖結(jié)果表明成功合成了水凝膠AM/CMC/B。

圖 1AM/CMC/B(a)、AM/CMC(b)和 B(c)的 FT-IRFig.1 FT-IR ofAM/CMC/B(a),AM/CMC(b)and B(c)

2.2 pH對(duì)水凝膠Cd2+平衡吸附量的影響

由圖2可知，AM/CMC/B在pH為2～6的Cd2+溶液中的平衡吸附量呈現(xiàn)出先增加再減小的趨勢(shì)，在pH為2和5時(shí)，平衡吸附量分別達(dá)到最小值和最大值，分別為97.53和164.83mg/g。當(dāng)pH為2時(shí)，AM/CMC/B與AM/CMC的平衡吸附量相差最小，為11.27mg/g；當(dāng)pH為4時(shí)，AM/CMC/B與AM/CMC的平衡吸附量相差最大，為56.56mg/g?？梢?，在添加了生物炭形成水凝膠后，對(duì)溶液中Cd2+的吸附量大大增加，可能與生物炭對(duì)Cd2+有良好的吸附性有關(guān)。

圖2 不同水凝膠在不同pH下對(duì)Cd2+的平衡吸附量Fig.2 Equilibrium adsorption of Cd2+by different hydrogels under different pH values

2.3 水凝膠對(duì)煙苗表型和生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

由圖3可知，與CK處理相比，H和BH處理的煙苗葉片數(shù)增加1片，葉片較大、顏色較深、根系更發(fā)達(dá)，說明H和BH處理可以緩解鎘脅迫對(duì)煙苗生長(zhǎng)發(fā)育的限制，改善煙苗表型。由圖4可知，與CK處理相比，H和BH處理的最大葉長(zhǎng)分別增加了14.94%和38.28%，最大葉寬分別增加了1.94%和30.01%，最大葉面積分別增加了16.90%和79.19%，總根長(zhǎng)分別增加了29.74%和83.31%?？偢砻娣e分別增加了33.00%和83.97%，根平均直徑分別增加12.36%和54.44%，根尖數(shù)分別增加了14.83%和88.21%，根體積分別增加了69.75%和261.56%。這些數(shù)據(jù)表明，Cd對(duì)不加任何水凝膠處理的煙苗毒害最大，使其生長(zhǎng)發(fā)育受限，H和BH處理均可減輕Cd脅迫下煙苗受到的毒害效應(yīng)，以BH處理的改善效果較好。

圖3 Cd脅迫15d煙苗的表型Fig.3 Phenotype of tobacco seedlings under Cd stress for 15 days

圖4 Cd脅迫15d煙苗的生長(zhǎng)指標(biāo)Fig.4 Growth indexes of tobacco seedlings under Cd stress for 15 days

2.4 水凝膠對(duì)煙苗生物量和RWC的影響

由圖5可知，H和BH處理煙苗的地上部鮮重、地下部干重和葉片RWC均顯著高于對(duì)照。在Cd脅迫下，CK處理煙苗受Cd影響最大。與CK處理相比，H和BH處理的地上部鮮重分別增加25.91%和98.39%，地下部鮮重分別增加了20.27%和130.67%，地上部干重分別增加了18.10%和84.22%，地下部干重分別增加了68.18%和231.82%。葉片RWC分別提高了4.84%和17.01%?？梢姡珹M/CMC和AM/CMC/B水凝膠能夠緩解Cd脅迫下煙苗的毒害，提高煙苗的抗逆性。AM/CMC/B水凝膠對(duì)提高Cd脅迫下煙苗的生物量和RWC的效果較好。

圖5 Cd脅迫15d煙苗的生物量和葉片RWCFig.5 Biomass and leaf RWC of tobacco seedlings under Cd stress for 15 days

2.5 水凝膠對(duì)煙苗光合特性和SPAD值的影響

從圖6可知，與CK處理相比，H處理煙苗的Pn、Ci、SPAD值、Tr和Gs分別提高了28.47%、29.67%、11.28%、43.20%、52.63%，BH處理分別提高了62.03%、31.59%、29.61%、82.54%、84.42%。H和BH處理能提高Cd脅迫下煙苗的SPAD值和光合作用。總之，在Cd脅迫15d后，BH處理的煙草幼苗光合作用受到的抑制最小?？梢酝茰y(cè)，BH處理的光合活性增強(qiáng)可能歸因于其土壤中的Cd被有效吸附和固定。

圖6 Cd脅迫15d煙苗的光合特性和SPAD值Fig.6 Photosynthetic characteristics and SPAD values of tobacco seedlings under Cd stress for 15 days

2.6 水凝膠對(duì)煙苗MDA和Pro含量及CAT和POD活性的影響

由圖7可知，與CK處理相比，BH處理顯著提高了Pro含量及CAT和POD活性，顯著降低了MDA含量，H處理顯著提高了CAT和POD活性。與CK相比，H處理煙苗的Pro含量及CAT和POD活性分別提高了57.53%、95.32%、67.10%，BH處理分別提高了192.19%、226.93%、105.77%，H和BH處理MDA含量分別降低了17.30%和36.61%。可能因?yàn)锳M/CMC和AM/CMC/B通過增強(qiáng)煙苗抗氧化能力，明顯降低Cd誘導(dǎo)的氧化損傷水平。此外，AM/CMC和AM/CMC/B均提高了葉片抗氧化酶活性，其中AM/CMC/B水凝膠的效果較好。

圖7 Cd脅迫15d煙苗的MDA和Pro含量及CAT和POD活性Fig.7 Contents of MDA and Pro,activities of CAT and POD in tobacco seedlings under Cd stress for 15 days

2.7 水凝膠對(duì)煙苗代謝物含量的影響

GC-MS分析結(jié)果（表1）顯示，從煙葉中共檢測(cè)到30種煙草代謝物，包括有機(jī)酸（7種）、萜類（8種）、烷烴（10種）和其他代謝物（5種）。4種代謝物總含量以BH處理最高，H處理次之，CK處理最低。CK處理中其他代謝物含量最高，烷烴類含量最低。H和BH處理中含量最高的是萜類，最低的是烷烴類。代謝物總量以BH處理的含量最高，CK處理最低。H和BH處理分別比CK處理高62.38%和123.13%，表明水凝膠AM/CMC和AM/CMC/B可提高Cd脅迫下煙葉代謝水平，從而提高煙苗對(duì)Cd的耐受性，減輕Cd的毒害作用，代謝物水平高有利于煙苗自身的生長(zhǎng)發(fā)育，對(duì)外界逆境脅迫的抗性也有所增加，其中BH處理的效果較好。

表1 不同處理煙苗代謝物的含量Table 1 Contents of metabolites in tobacco seedlings under different treatments

3 討論

研究[3]表明，Cd會(huì)影響植物的葉片發(fā)育。我們通過盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Cd脅迫15d后，煙苗的葉片數(shù)減少，Roy等[18]發(fā)現(xiàn)在Cd脅迫下植物葉片顯著減少，與本研究結(jié)果基本一致。與對(duì)照相比，生物炭復(fù)合水凝膠顯著（P＜0.05）改善了煙苗的表型。研究[19]表明，Cd不僅會(huì)影響植物對(duì)水分的吸收和利用，還會(huì)導(dǎo)致根和葉失水，此外，Cd還會(huì)顯著降低植物生物量[20]，這些結(jié)果與本研究的結(jié)果一致。本試驗(yàn)中，添加水凝膠不僅增加了Cd脅迫下煙苗的生物量，同時(shí)增加了葉片的RWC，減少了水分的散失，添加生物炭水凝膠促進(jìn)了Cd脅迫下煙苗的生長(zhǎng)，增強(qiáng)了煙苗的抗逆性。

光合作用是植物生長(zhǎng)和干物質(zhì)積累的重要途徑，也是對(duì)逆境特別是重金屬脅迫敏感的過程之一[21]。這一過程需要足夠的葉綠素參與，SPAD值可以直接反映植物葉片中的葉綠素含量。據(jù)報(bào)道[22]，Cd脅迫通過影響葉片葉綠體結(jié)構(gòu)、光能吸收和氣孔導(dǎo)度來抑制光合作用。Cd脅迫還會(huì)破壞葉綠體結(jié)構(gòu)，阻礙葉綠素的合成，降低其含量[23]。本試驗(yàn)中，在Cd脅迫15d后，添加了AM/CMC/B的煙苗光合作用相比對(duì)照有所改善，SPAD值也顯著提升，可能是因?yàn)锳M/CMC/B通過吸附土壤中的Cd減少了其對(duì)葉綠體結(jié)構(gòu)的破壞，增加了葉綠素含量，同時(shí)提高了葉片的Gs和對(duì)光能的吸收。

氧化應(yīng)激是非生物和生物應(yīng)激的核心部分。這種機(jī)制是由于細(xì)胞產(chǎn)生活性氧（ROS，包括H2O2和O2-）和抗氧化酶之間的嚴(yán)重失衡所致，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的生理紊亂。酶促活性氧清除系統(tǒng)在維持膜的結(jié)構(gòu)和功能以及細(xì)胞氧化還原平衡方面起著重要作用[24]。例如，Pro可以增強(qiáng)抗氧化反應(yīng)，最終緩解Cd的抑制效應(yīng)[25]。此外，氧化損傷與抗氧化防御機(jī)制密切相關(guān)。超氧化物歧化酶是抑制ROS產(chǎn)生的第一步，將O2-轉(zhuǎn)化為H2O2。此外，H2O2可以被CAT分解成O2-和H2O，從而降低ROS的毒性[26]。Cd還會(huì)干擾植物體內(nèi)的細(xì)胞酶系統(tǒng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)。本試驗(yàn)中，添加水凝膠AM/CMC/B處理的煙苗MDA積累量明顯降低，Pro含量和CAT、POD活性顯著提升，表明AM/CMC/B提高了煙苗對(duì)體內(nèi)ROS的清除能力，降低了Cd對(duì)細(xì)胞的毒害作用，從而有利于自身生長(zhǎng)。

代謝物是植物體內(nèi)重要的化合物，主要負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)植物的生命活動(dòng)和抵抗逆境。有機(jī)酸參與光合作用和呼吸作用，還可作為活性代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)滲透壓，平衡過量陽離子。另外，有機(jī)酸對(duì)植物體內(nèi)的重金屬有解毒作用。萜類化合物也是植物體內(nèi)重要的代謝產(chǎn)物，有些萜類化合物是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的，有些則在調(diào)節(jié)植物與環(huán)境的關(guān)系中起著重要的生態(tài)作用。植物中的烷烴在葉片表面形成一層蠟，為維持內(nèi)部環(huán)境提供了保障，增強(qiáng)了葉片的抗逆性。Cd通過抑制植物代謝產(chǎn)物的生物合成來抑制植物生長(zhǎng)[27]。本試驗(yàn)的結(jié)果表明，添加水凝膠處理H和BH將煙苗的代謝物總量分別提高了62.38%和123.13%，可見，AM/CMC/B對(duì)煙苗抵御Cd脅迫的效果最佳，降低了Cd對(duì)煙苗代謝產(chǎn)物生物合成所造成的抑制效果，促進(jìn)其生長(zhǎng)。

4 結(jié)論

本研究成功制備了丙烯酰胺/羧甲基纖維素/生物炭復(fù)合水凝膠AM/CMC/B，通過表征和吸附試驗(yàn)，表明其可以有效吸附水中的重金屬Cd。盆栽試驗(yàn)說明其能夠降低Cd在煙苗體內(nèi)的積累，減少Cd的毒性，提高煙苗的抗氧化能力，促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育，顯著增加了代謝物含量，從而有效提高Cd脅迫下煙苗的耐受性，是一種理想的水體重金屬污染吸附劑和土壤重金屬污染改良劑。