水稻甜質(zhì)胚乳突變體m5788的鑒定及基因定位

鄭思怡 楊 曄 宋遠(yuǎn)輝 花 芹 林泉祥 張海濤 程治軍

（1安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，230036，安徽合肥；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，100081，北京）

水稻（Oryza sativa L.）是世界上主要的糧食作物之一。淀粉是稻米的主要成分（占90%以上），胚乳中淀粉的組成、性狀和排列方式對(duì)稻米的外觀和食味品質(zhì)起著至關(guān)重要的作用[1]。隨著人們生活質(zhì)量的提高，對(duì)稻米品質(zhì)的要求也隨之提高，稻米品質(zhì)改良逐漸成為水稻育種家們重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題。淀粉主要有直鏈淀粉和支鏈淀粉2種形式。前者是由D-葡萄糖基以α-1,4-糖苷鍵連接的線性葡聚糖鏈，后者除此之外，還有α-1,6-糖苷鍵連接的分支鏈[2]。

研究[3]表明，直鏈淀粉和支鏈淀粉的生物合成涉及ADP-葡萄糖焦磷酸酯酶（ADP-glucose pyrophosphorylases，AGPase）、淀粉合成酶（granule bound starch synthase，GBSS）、可溶性淀粉合成酶（soluble starch synthase，SS）、淀粉分支酶（starch branching enzyme，BE）、淀粉去分支酶（starch debranching enzyme，DBE）和質(zhì)體淀粉磷酸化酶（plastidial starch phosphorylase，Pho)等路徑。高等植物中的DBE存在著支鏈淀粉酶（pullulanasetype，PUL）和異淀粉酶（isoamylase-type，ISA）2種不同的底物特異性酶。PUL主要參與普魯蘭多糖和支鏈淀粉的支鏈修飾，ISA通過(guò)去除BE形成的支鏈淀粉過(guò)度分支，從而將植物支鏈淀粉和糖原轉(zhuǎn)變?yōu)榻M織更強(qiáng)、支鏈較少的支鏈淀粉[4]。

在玉米中，Sugary 1基因編碼ISA1的等位基因，突變體sugary 1胚乳淀粉含量減少，可溶性糖積累，籽粒皺縮[5]。2019年，Takahashi等[6]分離出了一種新型甜米突變體hemisugary1，其籽粒中含有未去分支的短鏈高分子，植物糖原由于ISA活性降低而積累，從而改善了甜質(zhì)胚乳突變體典型的皺縮表型，外觀表現(xiàn)為籽粒中等皺縮。在其他作物如硬粒小麥中，敲除ISA1會(huì)導(dǎo)致胚乳中的淀粉含量降低，植物糖原和植物葡聚糖含量增加，改變了支鏈淀粉的精細(xì)結(jié)構(gòu)[7]。在馬鈴薯中同時(shí)降低3個(gè)ISA基因（ISA1、ISA2和ISA3）的表達(dá)量會(huì)導(dǎo)致淀粉代謝缺陷，使得塊莖中淀粉含量降低和淀粉顆粒尺寸減小[8]。在水稻中，Peng等[9]發(fā)現(xiàn)突變體isa1的含糖胚乳缺少淀粉顆粒，基因ISA1與FLO6（一種結(jié)合淀粉的碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白編碼基因）相互作用，作為淀粉結(jié)合蛋白參與淀粉合成和復(fù)合顆粒的形成。李家洋等[10]在第8號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)控制水稻甜質(zhì)胚乳的基因SU1，該突變體可溶性多糖含量高，胚乳帶有甜味，可能編碼一種參與支鏈淀粉生物合成的ISA。2015年，趙華等[11]通過(guò)組織培養(yǎng)得到了水稻糖質(zhì)胚乳突變體sug-11，胚乳呈甜味，籽粒皺縮，其成熟籽粒中的蔗糖和可溶性糖含量約為野生型中花11的3倍。2018年，Du等[12]在水稻中鑒定了一個(gè)編碼淀粉去分支酶ISA1突變的穗發(fā)芽突變體phs8，由于胚乳含糖量增加，導(dǎo)致OsABI3和OsABI5的表達(dá)量降低，對(duì)脫落酸敏感性降低，表明甜質(zhì)胚乳突變還會(huì)影響種子的休眠和萌發(fā)。

甜質(zhì)胚乳突變體是一種特異的淀粉合成突變體，被認(rèn)為是新型功能性食品開發(fā)的重要原料，也是健康食品的新材料。挖掘和利用甜質(zhì)胚乳突變體，對(duì)于開發(fā)具有保健功能的稻米產(chǎn)品具有積極意義。本研究以水稻甜質(zhì)胚乳突變體m5788為研究材料，在精細(xì)定位的基礎(chǔ)上，比較了突變體與之前報(bào)道的甜米材料的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)它是一個(gè)水稻ISA1位點(diǎn)新的等位變異，是研究該基因表達(dá)調(diào)控難得的材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

甜質(zhì)胚乳突變體m5788是從粳稻品種中花11組織培養(yǎng)后代中篩選得到的。在安徽合肥和北京自然環(huán)境條件下，經(jīng)多年種植，其綜合農(nóng)藝性狀與對(duì)照品種中花11十分相近，胚乳突變性狀均能穩(wěn)定遺傳，成熟胚乳呈甜味。2019年將其與正常胚乳品種IRAT129配制雜交組合，2019年冬，在海南南繁后收獲的F1種子脫殼磨米，挑選甜質(zhì)米，經(jīng)滅菌消毒后，無(wú)菌條件下培養(yǎng)成苗并進(jìn)行基因定位。田間管理同大田生產(chǎn)。種子自然風(fēng)干后測(cè)定千粒重。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 表型分析 大田材料成熟后，隨機(jī)選取突變體m5788與野生型各10株，考察株高、主莖穗長(zhǎng)、節(jié)間長(zhǎng)、主穗粒數(shù)、一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)和結(jié)實(shí)率等農(nóng)藝性狀。

1.2.2 理化性質(zhì)測(cè)定 中花11和m5788成熟種子風(fēng)干去殼后，利用Perten公司的DA7200型近紅外光譜儀測(cè)定直鏈淀粉含量、膠稠度、蛋白質(zhì)和水分含量等品質(zhì)指標(biāo)，每個(gè)材料測(cè)定3次。

采用蒽酮比色法[13]測(cè)定可溶性糖含量，待水稻在田間生長(zhǎng)發(fā)育至開花期，于上午11:00-11:30取生長(zhǎng)發(fā)育一致的植株的旗葉和穗，液氮冷凍，放入-80℃冰箱保存待測(cè)。待水稻在田間生長(zhǎng)發(fā)育至成熟期，取成熟籽粒，液氮冷凍，放入-80℃冰箱待測(cè)，每個(gè)材料測(cè)定3次。

1.2.3 I2-KI染色 取10粒種子，去粰殼，在30℃條件下清水浸種24h，設(shè)置3次重復(fù)。用濾紙吸干種子表面水分，加20μL 2% I2-KI溶液，完全浸染后用吸水紙吸干多余溶液，在BA410型顯微鏡下觀察染色情況并拍照。

1.2.4 目標(biāo)基因定位及分子標(biāo)記的開發(fā) 以中花11和IRAT129為親本，篩選出均勻分布于12條染色體具有多態(tài)性的197對(duì)SSR和Indel標(biāo)記，利用20株F2隱性極端個(gè)體，通過(guò)TPS法提取葉片總DNA，構(gòu)建DNA混池，篩選連瑣標(biāo)記。再根據(jù)連鎖結(jié)果，開發(fā)新的標(biāo)記，擴(kuò)大定位群體，對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行精細(xì)定位（表1）。利用Gramene（http://www.gramene.org）和 NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行新標(biāo)記開發(fā)，對(duì)比日本晴和9311基因組序列，尋找插入/缺失位點(diǎn)，用Primer 3.0（http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0）軟件開發(fā)SSR標(biāo)記，在RAP-DB/HOME的Blast網(wǎng)站（https://rapdb.dna.affrc.go.jp）比對(duì)特異性，將特異性較好的引物送至北京擎科生物有限公司合成。PCR擴(kuò)增采用10μL反應(yīng)體系：PremixTaq5μL、正反向引物（10μmol/L）共1μL、DNA模板1μL和 ddH2O 3μL。PCR 反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性2min；94°C 變性30s，55℃～58℃退火30s，72°C延伸1min，設(shè)置35個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min，4°C保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染顯色后觀察拍照并記錄。

表1 新開發(fā)的Indel和SNP分子標(biāo)記Table 1 New developed polymorphic Indel and SNP primers used for fine mapping

1.2.5 RNA提取與qRT-PCR表達(dá)量分析 取10cm幼穗，用RNA試劑盒（北京康潤(rùn)生物科技有限公司）提取總RNA，用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（江蘇愚公生命科技有限公司）獲得cDNA。利用ISA1和PUL基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物（表2），內(nèi)參采用水稻Ubiqutin（Os03g0234200），采用Takara公司試劑盒TB Green?Premix ExTaq?II（Tli RNaseH Plus）反應(yīng)體系，在BIO-RAD CFX96TMReal-Time System（BIO-RAD，美國(guó)）上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。每個(gè)樣品重復(fù)3次，以2-ΔΔCT計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表2 qRT-PCR所用引物Table 2 Primers used for qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 野生型和突變體m5788的表型分析

突變體m5788來(lái)自于粳稻品種中花11的組織培養(yǎng)后代，經(jīng)多年的田間觀察發(fā)現(xiàn)，籽粒皺縮性狀表現(xiàn)穩(wěn)定。農(nóng)藝性狀考察發(fā)現(xiàn)，m5788平均株高為100.2±2.7cm，低于野生型（117.0±2.8cm），突變體的各節(jié)間長(zhǎng)度都相對(duì)較短，穗長(zhǎng)縮短了14.9%（圖1a～b和表3）。m5788突變體的分蘗數(shù)（12.6±1.9）顯著多于野生型（9.5±2.1），有效穗數(shù)極顯著高于野生型。與野生型相比，m5788穗粒數(shù)（184.0±12.3）僅是野生型（278.0±45.8）的66.2%。突變體的千粒重（15.6±0.87g）僅為野生型（29.6±1.95g）的52.7%（表3）。野生型糙米飽滿、胚乳有堊白、部分透明，而m5788突變體糙米皺縮、胚乳透明（圖1c～d）。用I2-KI染色發(fā)現(xiàn)，野生型胚乳被染成紫黑色，m5788突變體胚乳被染成淡紫色，說(shuō)明野生型籽粒淀粉合成和積累正常，而突變體的籽粒淀粉積累不正常（圖1e）。

圖1 野生型和突變體m5788的表型鑒定Fig.1 Agronomic traits comparison between wild type and the mutant m5788

表3 野生型和突變體m5788農(nóng)藝性狀比較Table 3 Comparison of agronomic traits between wild type and the mutant m5788

2.2 野生型和突變體m5788籽粒品質(zhì)的理化指標(biāo)分析

對(duì)m5788和野生型籽粒中蛋白質(zhì)、直鏈淀粉、脂肪酸含量和膠稠度等幾個(gè)關(guān)鍵品質(zhì)性狀的測(cè)定結(jié)果（表4）表明，胚乳糖質(zhì)突變對(duì)稻米品質(zhì)的理化特性產(chǎn)生了較明顯的影響。m5788蛋白質(zhì)含量為7.58%，較野生型的5.67%增加了1.91個(gè)百分點(diǎn)，直鏈淀粉含量增加了0.36個(gè)百分點(diǎn)，脂肪酸含量增加了1.52個(gè)百分點(diǎn)。由于直鏈淀粉含量沒(méi)有下降，因此，突變體淀粉總量的減少可能發(fā)生在支鏈淀粉上，與支鏈淀粉有關(guān)的膠稠度降低了14.66個(gè)百分點(diǎn)，也間接支持這一結(jié)論。

表4 野生型和突變體品質(zhì)指標(biāo)比較Table 4 Comparison of quality index between wild type and the mutant %

2.3 野生型和突變體m5788籽粒灌漿特性分析

由于m5788籽粒皺縮，淀粉積累少，可能是突變體由糖到淀粉的合成步驟出了問(wèn)題。開花期旗葉、穗和成熟期籽?？扇苄蕴呛浚▓D2）表明，與野生型相比，m5788開花期旗葉葉片可溶性糖含量為0.33mmol/L，穗部可溶性糖含量為0.42mmol/L，野生型的相應(yīng)含量分別為0.21和0.23mmol/L，差異均達(dá)到了極顯著水平；在籽粒的灌漿過(guò)程中，野生型和m5788可溶性糖含量的差距逐漸增大。突變體成熟籽?？扇苄蕴呛繛?.83mmol/L，野生型為1.00mmol/L，突變體約為野生型的1.8倍。

圖2 野生型和突變體不同時(shí)期可溶性糖含量比較Fig.2 Comparison of soluble sugar content between wild type and mutant at different stages

2.4 遺傳分析

以突變體m5788為母本與正常胚乳品種IRAT129雜交，構(gòu)建遺傳作圖群體。F1植株所結(jié)種子的胚乳出現(xiàn)明顯的性狀分離，隨機(jī)抽取341粒F1成熟種子，將去殼糙米置于X線光片觀影燈下計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，其中正常胚乳籽粒和皺縮胚乳籽粒數(shù)目分別為277和64。符合3:1（χ2=1.09＜χ20.005=3.84）的理論分離比例。由此推斷，突變體m5788的皺縮胚乳性狀受1對(duì)隱性核基因控制。

2.5 精細(xì)定位

從F2群體中隨機(jī)選取20個(gè)突變體隱性單株構(gòu)建2組DNA混池，利用篩選出的分布于水稻全基因組的197對(duì)多態(tài)性引物，進(jìn)行突變基因的連鎖分析，初步確定第8號(hào)染色體上的Indel引物Z8-24和Z8-26.2與突變基因連鎖，再利用66個(gè)F2極端單株對(duì)2個(gè)標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證。利用Gramene網(wǎng)站（http://ensembl.gramene.org/genome）的秈粳稻基因組序列對(duì)比信息，在初定位區(qū)間新開發(fā)了4個(gè)SNP分子標(biāo)記（Z8-25.6、Z8-25.7、Z8-25.8和Z8-25.9），利用569個(gè)F2隱性突變體單株，最終將突變基因定位在了標(biāo)記Z8-25.8和Z8-25.9之間物理距離為110kb區(qū)間內(nèi)（圖3b）。

圖3 候選基因M5788的圖位克隆Fig.3 Schematic diagram of map-based cloning on the candidate gene M5788

根據(jù)水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http://rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/rice/），該區(qū)間內(nèi)存在14個(gè)基因和3個(gè)轉(zhuǎn)座子（表5），其中包含1個(gè)前人[12]已經(jīng)進(jìn)行功能驗(yàn)證的甜質(zhì)胚乳基因OsISA1。

表5 定位區(qū)間內(nèi)基因的功能注釋Table 5 Gene annotations in the mapping interval

利用phyto-zome（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）上公布的LOC_Os08g40930基因翻譯序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索顯示，水稻的ISA1與其他物種如擬南芥、大麥、小麥、玉米中的Sugary1蛋白高度同源（圖4）。且與已經(jīng)報(bào)道[12]過(guò)的玉米甜質(zhì)基因Sugary 1（GRMZM2G138060）的同源性高達(dá)82.2%。

圖4 LOC_Os08g40930與不同物種同源基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of LOC_Os08g40930 homologs

對(duì)LOC_Os08g40930的啟動(dòng)子和編碼區(qū)進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明在野生型和突變體之間序列不存在差異，但qRT-PCR的結(jié)果表明，突變體中該基因的表達(dá)水平下調(diào)，預(yù)示著表達(dá)水平的下降可能是導(dǎo)致表型變異的主要原因。對(duì)同屬于淀粉去分支酶基因OsPUL進(jìn)行了表達(dá)量分析，結(jié)果（圖5）表明在突變體m5788中OsPUL表達(dá)量也顯著下降。突變體胚乳DBE途徑中的2種底物特異性酶ISA1和PUL的基因表達(dá)量均大幅度降低，進(jìn)一步說(shuō)明了DBE途徑的代謝出現(xiàn)問(wèn)題，其主要原因是ISA1基因發(fā)生了突變，而PUL基因表達(dá)量變化可能是負(fù)調(diào)控的結(jié)果。

圖5 OsISA1和OsPUL在野生型和突變體中表達(dá)量的比較Fig.5 Comparison of expression levels of OsISA1 and OsPUL in wild type and mutant

3 討論

胚乳直接決定稻米的品質(zhì)和用途。甜質(zhì)水稻胚乳因可溶性糖含量多，淀粉含量少，被認(rèn)為是新型功能性食品原料。水稻甜質(zhì)胚乳突變體m5788是粳稻品種中花11的組織培養(yǎng)后代，籽粒自然風(fēng)干后胚乳皺縮，千粒重和穗粒數(shù)明顯下降，成熟籽粒中的可溶性總糖含量約是其野生對(duì)照品種中花11的1.8倍，胚乳呈甜味。突變基因被定位在8號(hào)染色體Z8-25.8和Z8-25.9之間物理距離為110kb的區(qū)間內(nèi)。區(qū)間內(nèi)LOC_Os08g40930基因的表達(dá)量在突變體內(nèi)顯著下調(diào)，該基因表達(dá)量的下降可能是造成突變體表型變化的原因。

DBE具有ISA和PUL 2種類型的酶。ISA主要分解植物糖原和支鏈淀粉，而PUL作用于普魯蘭多糖和支鏈淀粉，但不作用于植物糖原。在植物中至少存在3種ISA（ISA1、ISA2和ISA3）基因，但到目前為止PUL只報(bào)道了1種[14]。在淀粉生物合成中，ISA可以通過(guò)編輯過(guò)多支鏈或去除支鏈酶來(lái)去除不適當(dāng)分支的支鏈，以維持其簇狀結(jié)構(gòu)，形成淀粉顆粒中的結(jié)晶。研究[15]表明，缺乏DBE蛋白的擬南芥突變體isa1/isa2/isa3/lda的葉片中沒(méi)有淀粉顆粒，但積累了高度分支的葡聚糖。在本研究中，中花11糙米籽粒飽滿，胚乳有堊白，表現(xiàn)為部分透明，而m5788糙米皺縮，胚乳透明，幾乎不存在結(jié)晶，推測(cè)m5788中ISA基因受損，無(wú)法去除淀粉生物合成過(guò)程中形成的不適當(dāng)分支，導(dǎo)致支鏈淀粉的簇狀結(jié)構(gòu)無(wú)法維持。試驗(yàn)證實(shí)ISA1表達(dá)量降低與推測(cè)結(jié)論相符。但是另外2個(gè)ISA基因（ISA2和ISA3）對(duì)m5788突變表型的影響還需進(jìn)一步研究。

與ISA相比，另一個(gè)淀粉去分支酶類型PUL的生理功能研究報(bào)道較少。PUL參與淀粉的生物合成，PUL的水解活性有助于淀粉的分解代謝，補(bǔ)償了ISA部分缺陷，在谷類胚乳淀粉的生物合成過(guò)程中具有重要作用[16]。在水稻中，編碼普魯蘭酶的OsPUL基因在整個(gè)種子發(fā)育階段高度表達(dá)，在發(fā)育的中后期達(dá)到峰值[17]。Kawagoe等[18]利用淀粉糊質(zhì)的綠色熒光蛋白探究isa1突變體中的淀粉質(zhì)體和淀粉顆粒的形成，發(fā)現(xiàn)isa1突變體的含糖胚乳中沒(méi)有淀粉顆粒，表明ISA1在淀粉顆粒形成的早期至關(guān)重要。本研究中的突變體m5788與野生型相比籽粒更加透明，淀粉顆粒明顯減少，與上述報(bào)道相似。

在水稻ISA活性降低的sug1突變系中，高活性PUL會(huì)導(dǎo)致淀粉區(qū)域形成α-葡聚糖而不是植物糖原[19]。PUL功能失活的玉米突變體zpu1-204中的胚乳淀粉結(jié)構(gòu)和組成與野生型相比沒(méi)有顯著差異。但相較于野生型，Zpu1-204在胚乳發(fā)育過(guò)程中會(huì)積累分枝性麥芽低聚糖。表明PUL參與籽粒淀粉形成過(guò)程中的葡聚糖水解，有助于淀粉的分解代謝。ISA1功能失活突變體su1-st和zpu1-204純合子雙突變體與野生型相比，胚乳中植物糖原積累顯著[16]。Fujita等[20]研究表明，與野生型相比，在PUL突變體中，支鏈淀粉聚合度（DP）＜13的短鏈增加，但變化幅度遠(yuǎn)小于ISA1缺陷突變體sug1，但PUL突變體的α-葡聚糖和淀粉結(jié)構(gòu)基本一致。PUL/su1雙突變體保留了胚乳外層淀粉組織，但表現(xiàn)出比su1含量更高的可溶性多糖和更多的DP＜7短鏈。這表明PUL功能缺失對(duì)支鏈淀粉合成的影響雖小于su1，但PUL的活性對(duì)sug1表型的變化也具有一定的影響。在本研究中，m5788胚乳中的DBE途徑中的2種底物特異性酶基因OsISA1和OsPUL的表達(dá)量均顯著下降，ISA1功能損傷可能是導(dǎo)致突變體可溶性糖含量增加和淀粉含量下降的主要原因，而PUL對(duì)m5788表型變化也產(chǎn)生了一定的影響，與上述研究結(jié)果相符。但2015年趙華等[21]對(duì)Sug-11糖質(zhì)突變體與其野生對(duì)照籽粒灌漿中的ISA與PUL基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果顯示，ISA1基因的表達(dá)量并沒(méi)有明顯下降，但PUL的表達(dá)量出現(xiàn)了一定程度的下降。該結(jié)論與本研究有所區(qū)別，猜測(cè)可能是由于具有甜質(zhì)胚乳的水稻材料不同，導(dǎo)致ISA1活性差異。

East等[22]于1911年在玉米中首次描述了甜質(zhì)突變體su1以來(lái)，玉米中已經(jīng)鑒定了許多甜質(zhì)胚乳突變體，例如甜質(zhì)基因sugary 1和sugary 2，超甜突變基因sh2、bt1和bt2，加強(qiáng)甜突變基因sel等[23]。Nakamura等[24]在玉米糖質(zhì)胚乳突變體中發(fā)現(xiàn)，與DBE相關(guān)的ISA1基因表達(dá)活性顯著下降。隨后，通過(guò)對(duì)玉米ISA1同源性分析發(fā)現(xiàn)，在水稻的8號(hào)染色體上有1個(gè)它的同源ISA1。2005年，Kubo等[25]將小麥的甜質(zhì)胚乳基因組導(dǎo)入水稻ISA1基因損傷的甜質(zhì)胚乳突變體EM91中，在轉(zhuǎn)基因的T0水稻植株中，胚乳性狀恢復(fù)正常，胚乳中的可溶性糖含量降低，淀粉積累正常，證明了ISA1基因在淀粉合成過(guò)程中的作用。我們的突變體材料與報(bào)道的甜質(zhì)胚乳突變體籽粒表型相似。前人研究[7,10]表明，LOC_Os08g4093中堿基替換是導(dǎo)致水稻甜質(zhì)胚乳的遺傳基礎(chǔ)，而我們的試驗(yàn)結(jié)果表明，LOC_Os08g40930基因組在m5788與野生型中不存在堿基差異，水稻甜質(zhì)胚乳是由于ISA1表達(dá)量降低導(dǎo)致的，故M5788是水稻基因OsISA1的一個(gè)新的等位變異。但導(dǎo)致ISA1表達(dá)量降低的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)甜質(zhì)胚乳突變體m5788的研究發(fā)現(xiàn)，m5788表現(xiàn)出株高降低、籽粒皺縮和千粒重降低等表型。突變體碘染呈淺紫色，淀粉含量減少。生理試驗(yàn)表明，突變體可溶性糖含量增加是導(dǎo)致甜質(zhì)胚乳的主要原因。對(duì)蛋白質(zhì)和直鏈淀粉含量等幾個(gè)關(guān)鍵品質(zhì)性狀的測(cè)定結(jié)果表明，m5788蛋白質(zhì)含量增加了1.91個(gè)百分點(diǎn)，直鏈淀粉含量增加了0.36個(gè)百分點(diǎn)，脂肪酸含量增加了1.52個(gè)百分點(diǎn)，膠稠度降低了14.66個(gè)百分點(diǎn)。胚乳糖質(zhì)突變對(duì)稻米品質(zhì)的理化特性產(chǎn)生了較明顯的影響。遺傳分析表明，該性狀受1對(duì)隱形等位基因控制，突變體m5788目標(biāo)基因被精細(xì)定位在水稻8號(hào)染色體上標(biāo)記Z8-25.8和Z8-25.9之間物理距離為110kb的區(qū)間內(nèi)。該區(qū)間含有1個(gè)已經(jīng)報(bào)道的OsISA1甜質(zhì)基因，編碼1個(gè)名為異淀粉酶1的淀粉去分支酶蛋白[12]。測(cè)序分析表明，OsISA1基因組序列未發(fā)生變化，但是該基因的表達(dá)量明顯降低，同時(shí)與ISA1基因功能相似的OsPUL表達(dá)量也明顯降低。綜上，突變體m5788是一個(gè)新的甜質(zhì)胚乳材料，在培育功能性水稻品種中具有一定的利用價(jià)值。