基于Box-Behnken-Matlab分析法優(yōu)化高亞油酸含量南瓜籽油提取工藝研究

薛 山，黃藝婷，李冬冬

(閩南師范大學生物科學與技術學院1，漳州 363000) (菌物產(chǎn)業(yè)福建省高校工程研究中心；閩南師范大學2，漳州 363000)

南瓜籽是南瓜加工的副產(chǎn)品，其油脂質(zhì)量約占籽粒干重的35%～64%[1]。南瓜籽油是一種具有生物學活性的高品質(zhì)食用油脂，富含多不飽和脂肪酸(PUFA)，其中以亞油酸(LA)組分最具代表[2,3]。研究顯示，LA能夠有效抑制良性前列腺增生，預防、緩解和治療男性泌尿生殖系統(tǒng)疾病[4]。同時，南瓜籽粗油提取物中含有類胡蘿卜素、植物甾醇、α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚等高活性油脂伴隨物，其中總酚含量為167.21～204.50 mg/kg，不同產(chǎn)地、品種南瓜油功能性成分有所差異[5-7]。南瓜油因具有抗氧化、抗過敏、抗腫瘤、降三高、改善尿道疾病[8,9]、恢復運動員糖代謝能力[10]等保健功效，廣泛應用于食品、醫(yī)藥和精細化工領域。

南瓜籽油的提取工藝有物理壓榨法、有機溶劑浸提法、水酶法、超聲波輔助提取法[8,11]、亞臨界/超臨界流體萃取法[12]、水劑法[13]等。在其中，溶劑浸出法易于工業(yè)化生產(chǎn)，對工廠設備要求不高，也是目前廣泛使用的一種方法[3]。針對南瓜籽油提取工藝的優(yōu)化多以油脂浸提率為指標，以油脂功效成分含量為指標的工藝優(yōu)化鮮見報道。因此，LA作為南瓜籽油中的主要PUFA組分及功效活性成分，以其為評量指標的優(yōu)化研究具有重要應用價值。

本研究以新疆裸仁南瓜籽作為對象，通過考察單因素對低溫烘焙處理后南瓜籽油LA相對含量的影響，進而基于南瓜籽粗油LA相對含量和粗油得率雙重評量指標開展Box-Benhnken-Matlab工藝優(yōu)化試驗，為高比例LA南瓜籽油工業(yè)化開發(fā)生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

裸仁南瓜籽(油脂含量為45.70 g/100 g)，產(chǎn)自新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊。苯、石油醚(沸程30～60 ℃)、沒食子酸、碳酸鈉、福林酚試劑(分析純)、正已烷(色譜純)、三氟化硼甲醇溶液、37種脂肪酸甲酯混標(標準品)。

1.2 實驗儀器

DGG-9140B電熱恒溫鼓風干燥箱，VCX800超聲波破碎儀，AR124CN電子天平，DZF-6034A真空烤箱，HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，XW-80A漩渦混合器，7890B氣相色譜儀。

1.3 測定方法

1.3.1 南瓜籽油的提取

南瓜籽的篩選：剔除破損或開裂的南瓜籽籽粒，30 ℃鼓風干燥48 h，確保南瓜籽含水量≤4%，用塑料袋密封后于4 ℃陰涼處保存?zhèn)溆肹14]。南瓜籽油的提取參照Moo-Huchin等[15]方法略微修改。稱量約10.0 g南瓜籽，進行低溫錫箔烘烤處理(將南瓜籽樣品用錫箔紙包裹，放入真空烤箱125 ℃ 烘烤15 min，真空度達133 Pa)，待冷卻至室溫粉碎，按料液比1∶12 g/mL加入石油醚，320 W超聲一段時間后，于45 ℃索式萃取3.5 h，將提取后的混合液于45 ℃真空揮干溶劑，即得南瓜籽粗油。南瓜籽粗油得率以南瓜籽油質(zhì)量與南瓜籽初始質(zhì)量的比值進行計算。

1.3.2 南瓜籽油的LA分析

向南瓜籽粗油中加入3 mL苯-石油醚(1∶1)，將含有南瓜籽粗油的混合溶液轉(zhuǎn)移至10 mL具塞試管中，加入2 mL三氟化硼甲醇試劑，渦旋混勻振蕩后于50 ℃恒溫水浴鍋中加熱2 h，放置4 ℃冰箱過夜，使油脂充分甲酯化。氣相色譜上樣檢測前將混合體系加入1 mL正己烷(色譜純)，充分振蕩后再使之靜置分層，取1 mL上清液，過有機相濾膜(0.45 μm)后裝氣相瓶備用。

脂肪酸甲酯的測定采用7890B氣相色譜儀，使用 FID 檢測器和強極性二氰丙基-聚硅氧烷-非鍵合氣相色譜柱(SH-RtTM-2560,100 m×0.25 mm×0.20 μm)。程序參數(shù)為：分流比 10∶1，進樣量1 μL，載氣為氮氣，流速1.5 mL/min，進樣口和檢測器的溫度均設置250 ℃。柱箱的升溫程序為：起始溫度為140 ℃，保持1 min，以 4 ℃/min 升到240 ℃并保持5 min。脂肪酸的定性分析：比對樣品脂肪酸甲酯與37種混合脂肪酸甲酯標準品的保留時間；脂肪酸的定量：采用面積歸一化法進行分析[16]。包括LA在內(nèi)的脂肪酸相對含量用單個脂肪酸峰面積占總脂肪酸峰面積加和的比例(%)表示。

1.3.3 單因素實驗1.3.3.1 超聲時間

考察超聲時間5、10、15、20、25 min對南瓜籽油LA相對含量的影響。其他條件為：低溫錫箔烘烤處理125 ℃ 15 min，超聲功率320 W，料液比1∶35，提取溫度35 ℃，提取時間3.5 h。

1.3.3.2 料液比

考察料液比分別為1∶15, 1∶25, 1∶35, 1∶45, 1∶55對南瓜籽油LA相對含量的影響。其他條件為：超聲時間15 min，提取溫度35 ℃，提取時間3.5 h。

1.3.3.3 提取溫度

考察提取溫度分別為25, 30, 35, 40, 45 ℃對南瓜籽油LA相對含量的影響。其他條件為：超聲時間15 min，料液比1∶35，提取時間3.5 h。

1.3.3.4 提取時間

考察提取時間分別為1.5, 2.5, 3.5, 4.5, 5.5 h對南瓜籽油LA相對含量的影響。其他條件為：超聲時間15 min，料液比1∶35，提取溫度25 ℃。

1.3.4 雙響應面實驗

基于單因素實驗結(jié)果，按照Box-Behnken響應面分析法的因素與水平表(表1)，以LA相對含量(Y1)和粗油得率(Y2)為雙響應值，進行提取工藝條件優(yōu)化。

表1 響應面分析法的因素與水平表

1.3.5 最優(yōu)組合驗證實驗

依據(jù)Box-Behnken雙響應面實驗得到的最優(yōu)工藝參數(shù)結(jié)果，進行驗證。

1.3.6 Matlab優(yōu)化實驗

基于單因素實驗結(jié)果，利用Matlab軟件程序運算，量化料液比(A)，提取溫度(B)，提取時間(C)對南瓜籽LA相對含量(Y1)和粗油得率(Y2)的三維及四維交互影響。

1.3.7 總酚含量測定

總酚的提取和測定參考魏征等[17]方法。稱取1.000 0 g 南瓜籽粗油于50 mL離心管中，按料液比1∶1、1∶20加入正己烷和甲醇，分別漩渦30 s，置于超聲波清洗器中，在30 ℃、270 W、45 kHz 下超聲提取 30 min，7 600 g 離心 10 min，分離有機相，殘油重復提取2 次。合并3次有機相，40 ℃下真空旋蒸，2 mL甲醇復溶。

取20 μL樣液或各梯度標準液至 2 mL 離心管，依次加入780 μL蒸餾水、50 mL福林酚試劑和150 μL 20%的Na2CO3溶液。漩渦 30 s，40 ℃水浴 30 min，使用酶標儀在 760 nm 波長處測定吸光度。結(jié)果以沒食子酸當量表示(mg GAE/kg)，標準曲線y=0.001 2x+0.000 7(R2=0.999 8)，線性范圍 0～500 μg/mL。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理方法

實驗結(jié)果用3次重復的平均值±標準差表示。采用SPSS Statistics 24.0軟件對數(shù)據(jù)結(jié)果進行顯著性分析，P<0.05表示結(jié)果顯著，標示為不同字母。利用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件進行響應面優(yōu)化試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC分析南瓜籽油LA相對含量

南瓜籽油中含有多種人體所需脂肪酸，尤其是LA組分，南瓜籽油的提取利用能夠大大提升南瓜籽的附加值[18]。低溫烘焙作為一種相對健康、環(huán)保的烹飪加工方式在堅果、糧食谷物預處理方面已廣泛應用[19]。在前期成果的基礎上，為降低傳統(tǒng)烘焙處理對南瓜籽油PUFA的破壞，對南瓜籽進行低溫錫箔烘焙預處理，在超聲功率320 W，超聲時間15 min，石油醚料液比1∶35 g/mL，提取溫度35 ℃，提取時間3.5 h條件下經(jīng)GC分析鑒定出4種脂肪酸(圖1)：棕櫚酸(C16∶0)(14.92±0.21)%、硬脂酸(C18∶0)(6.72±0.10)%，油酸(C18∶1,cis-9)(31.10±0.37)%和LA (C18∶2,cis-9,12)(47.24±0.20)%，其中LA相對含量比Cuco等[12]加壓CO2法提取的還要高，且顯著高于南瓜籽油脂中其他種類脂肪酸[20,21]。

圖1 南瓜籽油脂肪酸甲酯氣相色譜圖

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 超聲時間對南瓜籽油LA相對含量的影響

從圖2可知，隨著超聲時間的延長，南瓜籽油LA相對含量有所升高，其中超聲時間10～25 min區(qū)間差異并不顯著(P>0.05)，綜合考慮LA相對含量升高幅度及能耗情況，選擇超聲時間15 min進行后續(xù)試驗。胡代花[22]采用超聲輔助溶劑法提取了大鯢肝臟油脂，適當?shù)某暻疤幚砟軌蛱嵘钟偷寐剩也黄茐挠椭械腜UFA組分。

圖2 超聲時間、料液比、提取溫度和提取時間對南瓜籽油LA相對含量的影響

2.2.2 料液比對南瓜籽油LA相對含量的影響

由圖2可知，在料液比1∶15～1∶55內(nèi)，南瓜籽粗油得率會隨著料液比增大呈現(xiàn)先顯著升高(P<0.05)后顯著下降(P>0.05)的趨勢變化。當料液比達到1∶35時，LA相對含量有最大值，故選擇此參數(shù)值。這可能是因為料液比適當?shù)脑黾幽軌蛱嵘椭牡寐?，尤其是更有效地提取油脂中的LA組分。

2.2.3 提取溫度對南瓜籽油LA相對含量的影響

由圖2可知，南瓜籽粗油中LA相對含量會隨著提取溫度的升高，先略微增大(P>0.05)，后顯著降低(P<0.05)，在30 ℃時達到最大值。產(chǎn)生該現(xiàn)象的原因可能是溫度適當升高有利于LA組分的提取，但是溫度過高也會造成LA提取率下降或氧化[23]。因此，選擇提取溫度為30 ℃。

2.2.4 提取時間對南瓜籽油LA相對含量的影響

由圖2可知，在提取時長為1.5～5.5 h范圍內(nèi)，LA相對含量先顯著升高后下降(P<0.05)，當提取時間2.5 h時LA相對含量達到最大。這可能是由于提取時間過長容易引起LA組分氧化所致。因此，選擇提取時間2.5 h。

2.3 Box-Behnken-Matlab實驗結(jié)果分析

2.3.1 Box-Behnken雙響應面優(yōu)化實驗結(jié)果

基于單因素實驗結(jié)果，采用Box-Behnken進行三因素(料液比(A)、提取溫度(B)、提取時間(C))三水平(-1，0，1)的實驗設計。LA相對質(zhì)量分數(shù)(Y1)和粗油得率(Y2)的雙響應面實驗設計與結(jié)果見表2，基于Y1和Y2的方差分析結(jié)果分別見表3和表4。

表2 Box-Behnken實驗設計與結(jié)果

表3 基于Y1的方差分析結(jié)果

表4 基于Y2的方差分析結(jié)果

經(jīng)多元回歸擬合，得到南瓜籽油LA相對含量(Y1)和粗油得率(Y2)對自變量料液比(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)的二次多項回歸方程分別為：

Y1=47.66-0.59A-0.4B+0.5C-0.18AB-0.05AC+0.23BC+0.13A2-0.39B2-0.51C2

(1)

Y2=25.14+0.89A-0.21B+0.32C+0.30AB+0.65AC-0.09BC-1.82A2-1.45B2-1.25C2

(2)

基于Y1和Y2優(yōu)化的二次模型的方差分析結(jié)果如表3和表4所示，Y1和Y22個模型均極顯著(P<0.01)，失擬項不顯著(P>0.05)，模型擬合性良好。Y1的回歸方程相關系數(shù)R2=0. 944 4，說明響應值的變化有94.44%來源于所選3個變量。同理，Y2的回歸方程相關系數(shù)R2=0.977 9，說明響應值的變化有97.79%來源于所選3個變量。通過F值分析可知，各因素對Y1和Y2影響的顯著性大小均為：料液比(A)>提取時間(C)>提取溫度(B)。2個模型的變異系數(shù)分別為0.56和1.60，均在可接受范圍內(nèi)，說明該模型的重復性良好。

2.3.2 Box-Behnken雙響應面相互作用

經(jīng)Box-Behnken雙響應面作圖分析，料液比(A)、提取溫度(B)和提取時間(C)3個因素的兩兩交互作用對南瓜籽油LA相對含量(Y1)的影響均不顯著(P>0.05)，其中BC>AB>AC；料液比與提取時間(AC)的交互作用對粗油得率(Y2)的影響較大，響應曲面的坡度也較陡，而AB和BC對試驗結(jié)果交互作用不顯著(P>0.05)，3個因素兩兩交互作用顯著程度為AC>AB>BC，與表3和表4的分析結(jié)果一致。

2.3.3 Matlab分析結(jié)果

Matlab科學計算功能強大，能夠通過程序代碼編寫建立數(shù)學模型有效計算出最優(yōu)解[24,25]。目前，Matlab已廣泛應用于工藝優(yōu)化，在食品領域的報道有食用油脂提取工藝優(yōu)化[3]、葡萄籽多酚提取工藝優(yōu)化[26]、菠蘿皮渣多酚提取工藝優(yōu)化[27]等。

通過建模得到料液比(A)、提取溫度(B)和提取時間(C)對Y1和Y2影響的四維效果圖(圖3，圖4)。當Y1取得理論最大值(48.552 1%)時，通過矩陣計算得到A為1∶40 g/mL，B為27.14 ℃，C為2.76 h；同理，當Y2取得理論最大值(25.302 6%)時，A為1∶36.33 g/mL，B為24.69 ℃，C為2.59 h。

圖3 基于Y1優(yōu)化的四維交互曲面

圖4 基于Y2優(yōu)化的四維交互曲面

為了更細致地描述分析各因素間的交互作用，分別繪制當C取下限值(2 h)，中間值(2.5 h)，上限值(3 h)時，A與B對Y1，Y2交互影響的三維旋轉(zhuǎn)曲面與等高線投影圖(圖5)。

當C取下限值(2 h)時，固定B，隨著A的升高，Y1(實線)逐漸增高；固定A值，隨著B的升高，Y1先升高后降低。固定B值，Y2(虛線)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，固定A值，Y2在提取溫度為20～30 ℃范圍內(nèi)先升高后降低，在25 ℃處取得最大值。此時，Y1為45.409 4%～47.427 8%，Y2為19.640 5%～23.581 4%。當A為1∶33～1∶38，B為22～28 ℃時，Y1和Y2可同時取得最大值。

a C取下限值(2 h)

b C取中間值(2.5 h)

當C取中間值(2.5 h)時，Y1和Y2的變化趨勢與C=2 h時一致。此時，Y1為46.241 4%～48.416 1%，Y2為20.477 5%～25.254 5%。當A為1∶34～1∶38，B為22～27 ℃時，Y1和Y2可同時取得最大值。

當C取上限值(3 h)時，Y1和Y2的變化趨勢與C=2 h和2.5 h時一致。此時，Y1為46.051 3%～48.448 4%，Y2為18.810 5%～24.539 2%。當A為1∶34～1∶40，B為21～27 ℃時，Y1和Y2可同時取得最大值。

因此，當C取上線值(3 h)時，Y1能夠取得最大理論值，當C取中間值(2.5 h)時，Y2能夠取得最大理論值。當C為2.5～3 h，A為1∶34～1∶39，B為22～27 ℃時，Y1和Y2均能夠取得理論較大值。

2.3.4 Box-Behnken-Matlab最佳工藝預測及驗證實驗

通過t軟件分析，得到最佳提取工藝參數(shù)的理論值為料液比(A)取1∶38.65，提取溫度(B)取25.75 ℃，提取時間(C)取2.695 h，南瓜籽粗油LA相對質(zhì)量分數(shù)(Y1)為48.31%，粗油得率(Y2)為24.91%。經(jīng)驗證，Y1實際值為(48.23±0.11)%，Y2實際值為(24.83±0.12)%，與理論值差異不顯著(P>0.05)，方法可行。此研究得到的南瓜籽粗油LA相對含量，顯著高于孫立斌等[28]以酶解冷榨法制取的南瓜籽粗油LA相對含量(38.02%)；由南瓜籽粗油含量(45.70 g/100 g)及得率(20.53%～25.56%)換算，本研究所得南瓜籽出油率為44.92%～55.93%，低于孫立斌等[28]研究結(jié)果(出油率為72.6%)。

2.4 南瓜籽粗油中總酚含量

經(jīng)測定，最優(yōu)條件下提取南瓜籽粗油中總酚含量為(968.71±13.96) mg GAE/kg，高于王璐等[29]研究結(jié)果(672.2～952.8)mg GAE/kg。植物油脂的保健功效與其油脂伴隨物中含有的天然抗氧化成分多酚密不可分[30]，且多酚的種類、含量和性質(zhì)，受原料來源、預處理、加工工藝，提取和測定方法等多種因素的共同影響[31,32]。南瓜籽粗油特征多酚種類、含量、生物活性及其在加工過程中的變化有待后續(xù)深入探究。

3 結(jié)論

本研究采用低溫錫箔烘焙處理裸仁南瓜籽，并以LA相對含量(Y1)與粗油得率(Y2)為雙指標的Box-Behnken-Matlab分析法對后的南瓜籽粗油進行超聲波輔助溶劑提取法工藝優(yōu)化，得到最優(yōu)提取工藝參數(shù)為：超聲時間15 min，料液比1∶38.65，提取溫度25.75 ℃，提取時間2.7 h，此時，Y1為(48.23±0.11)%，Y2為(24.83±0.12)%；當提取時間的范圍為2.5～3 h，料液比1∶34 ～1∶39，提取溫度22～27 ℃時，在此工藝參數(shù)區(qū)間Y1和Y2可同時取得較大理論值，此時粗油中總酚含量為(968.71±13.96)mg GAE/kg。Box-Behnken-Matlab分析法不僅能夠得到高LA相對含量南瓜籽油的最優(yōu)具體工藝參數(shù)，也可以在兼顧LA相對含量和粗油得率的情況得到較優(yōu)工藝參數(shù)范圍。