不同分子質(zhì)量水溶性大豆皮膳食纖維的單糖組成、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)研究

吳金祥，李榮麗，吳喆超，戴 煌，畢 潔，張 威，肖安紅

(武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；湖北省農(nóng)產(chǎn)品加工與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；大宗糧油精深加工省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430023)

膳食纖維作為一種食品原料，有益于控制體重、降低膽固醇、預(yù)防糖尿病和高血壓等。膳食纖維的單糖組成、分子質(zhì)量、結(jié)構(gòu)特征等不同，及其功能特性的差異，會(huì)影響其生理活性。劉靜娜等[1]研究分子質(zhì)量為499、2 750 ku殼聚糖對(duì)膽固醇的吸附能力，發(fā)現(xiàn)499 ku殼聚糖對(duì)膽固醇吸附能力更強(qiáng)。韓晴等[2]研究分子質(zhì)量為140、2 300 ku水溶性大豆多糖的乳化性和起泡性，發(fā)現(xiàn)2 300 ku的功能特性更好。何喜珍等[3]采用DPPH自由基、羥自由基清除法和鐵氰化鉀法研究分子質(zhì)量為550、347、285、21 ku大豆多糖的抗氧化能力，結(jié)果表明，285 ku大豆多糖的抗氧化效果最好，分子質(zhì)量為21 ku的大豆多糖抗氧化效果最差?？梢?，膳食纖維的性質(zhì)與其生物活性具有相關(guān)性，所以研究?jī)烧叩年P(guān)系具有重要意義。

大豆皮是大豆加工中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，約占籽粒的10%，含纖維性超過50%，是生產(chǎn)膳食纖維的良好資源。膳食纖維按溶解性可分為水溶性(SDF)和水不溶性(IDF)的膳食纖維，在性質(zhì)和生理作用上有較大差異，其中SDF因更容易添加到食品中而被廣泛使用。本實(shí)驗(yàn)研究了3種不同分子質(zhì)量水溶性大豆皮的膳食纖維的單糖種類、結(jié)構(gòu)及性質(zhì)上的差異，以期為充分利用大豆皮開發(fā)膳食纖維提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究室自制3種不同分子質(zhì)量水溶性大豆皮膳食纖維：SDF-1、SDF-2、SDF-3，其成分及分子質(zhì)量分布見表1和表2。一級(jí)玉米油；溴化鉀、剛果紅、氫氧化鋇、硝酸銀、冰乙酸、鄰苯二甲醛、氫氧化鈉、鹽酸、水楊酸、無(wú)水乙醇、濃硫酸、過氧化氫、硫酸亞鐵等均為分析純。

表1 SDF-1、SDF-2、SDF-3的基本成分/%(干基)

表2 SDF-1、SDF-2、SDF-3的分子質(zhì)量的分布情況

1.2 主要儀器與設(shè)備

210型高效液相色譜儀，NEXUS670傅里葉紅外光譜儀，銳影Empyrean高分辨率X-射線衍射儀，Q2000差示掃描量熱儀，NDJ-79旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)。

1.3 方法

1.3.1 組成膳食纖維分子的單糖成分的測(cè)定[4]

采用高效液相色譜法測(cè)定。制樣：取樣0.1 g，加入5 mL 1 mol/L H2SO4，90 ℃水解2 h，冷卻后用Ba(OH)2中和至pH 6.0，靜置過夜，離心(4 000 r/min,10 min)，取上清水解液。測(cè)定條件：ShodexSP0810色譜柱，90 ℃柱溫，水流動(dòng)相，流速0.6 mL/min，Optilab T-rEX示差檢測(cè)器，進(jìn)樣量20 μL，運(yùn)行時(shí)間30 min。

1.3.2 膳食纖維分子官能團(tuán)的測(cè)定

將1 mg樣品與0.1 g 溴化鉀用瑪瑙研缽研磨成均勻粉末，手動(dòng)壓力機(jī)壓制成薄片后，采用傅里葉紅外光譜在25 ℃，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為64次條件下進(jìn)行全波段掃描(4 000～400 cm-1)。

1.3.3 剛果紅實(shí)驗(yàn)[5]

取5 mg樣品，加入2.0 mL蒸餾水和2.0 mL 80 μmol/L的剛果紅試劑，加入1 mol/L的NaOH溶液，使反應(yīng)體系中的NaOH濃度分別達(dá)到0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L時(shí)，測(cè)其最大吸收波長(zhǎng)。以不加樣本的剛果紅溶液為實(shí)驗(yàn)對(duì)照。

1.3.4 膳食纖維分子的晶體結(jié)構(gòu)的測(cè)定[6]

取0.1 g樣品放在載玻片上，用蓋玻片壓平，在Cu-Kα靶、0.02°步寬、6(°)/min掃描速率、5°～60°掃描范圍的條件下，進(jìn)行X-射線衍射實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 膳食纖維熱穩(wěn)定性的測(cè)定[7]

采用差示掃描量熱儀分析，取3 mg樣品于鋁盤中并壓片，以空鋁盤為對(duì)照。在氮?dú)饬魉?0 mL/min，以10 ℃/min的升溫速率由20 ℃升至210 ℃。記錄此過程的起始溫度(T0)、峰值溫度(Tp)、終止溫度(Te)和熱焓變(ΔH)。

1.3.6 膳食纖維吸水(油)力的測(cè)定[8]

取樣品m0(小于3.0 g，水分為w)于質(zhì)量為m1的離心管中，加入25 mL蒸餾水或食用油，室溫靜置1 h后，離心(2 500 r/min,10 min)，棄去上清液，并用濾紙吸干離心管壁殘留水分或食用油，稱重樣品和離心管(m2，g)。按式(1)計(jì)算吸水力(W)或吸油力(H)。

W或H=[(m2-m1)-m0(1-w))/ (m0(1-w)]

(1)

1.3.7 膳食纖維吸水膨脹力的測(cè)定[9]

取樣品m0(小于1.0 g，水分為w)置于量筒中，記錄樣品體積v0(mL)，在量筒中加入10 mL蒸餾水，充分振蕩，室溫下靜置24 h，記錄膨脹后體積v1(mL)。按式(2)計(jì)算膨脹力(S)。

S=(v1-vo)/[m0(1-w)]

(2)

1.3.8 膳食纖維膽固醇吸附能力的測(cè)定[9]

1.3.8.1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確吸取0.25 mg/mL膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.16、0.32、0.48、0.64、0.80 mL于比色管中，加入冰乙酸至0.80 mL，再依次加入1 mg/mL鄰苯二甲醛0.4 mL及混合酸(冰乙酸∶濃硫酸=1∶1)8 mL，靜置10 min，于550 nm處測(cè)定吸光值(y)。y與x(膽固醇的質(zhì)量濃度，μg/mL)的關(guān)系曲線：y=0.000 4x-0.008 0，R2=0.997。

1.3.8.2 膽固醇吸附能力的測(cè)定

取鮮雞蛋蛋黃，加入9倍蒸餾水?dāng)嚧虺扇橐骸Ｈ?份蛋黃乳液(各30 mL)，其中2份加入樣品(m0=1.0 g，水分為w)，2份不加樣品，攪拌均勻。分別調(diào)節(jié)pH 2.0、7.0，37 ℃振蕩2 h后離心(4 000 r/min, 20 min)；各吸取0.1 mL上清液，按1.3.8.1步驟加入試劑，靜置后在550 nm處測(cè)吸光度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋黃中吸附前(m1)和吸附后(m2)的膽固醇量，按式(3)計(jì)算膽固醇吸附能力(D)。

D=(m1-m2)/[m0(1-w)]

(3)

1.3.9 膳食纖維與陽(yáng)離子交換能力的測(cè)定[4]

取1.0 g(水分w)樣品，加入30 mL 0.1mol/L HCl，常溫靜置24 h后過濾，用蒸餾水洗至中性，加入10% AgNO3溶液不產(chǎn)生沉淀(即不含氯離子)為止。60 ℃烘至恒重后，取0.25 g，加入100 mL 15%的NaCl，攪拌均勻，緩慢滴加0.01 mol/L NaOH，并記錄NaOH加入量和pH的變化。

1.3.10 膳食纖維對(duì)羥自由基清除能力的測(cè)定[8]

分別取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g樣品，依次加入9 mmol/L水楊酸-乙醇0.5 mL、9 mmol/L FeSO40.5 mL、蒸餾水3.5 mL、88 mmol/L H2O25.0 mL，搖勻后離心(4 000 r/min ,20 min)，取上清液，在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度值OD1；0.5 mL蒸餾水代替9 mmol/L FeSO4溶液測(cè)得吸光度值為OD2；蒸餾水代替樣品為空白對(duì)照測(cè)OD3。按式(4)計(jì)算羥自由基清除率(R)。

R=[1-(OD1-OD2)/OD3]×100%

(4)

1.3.11 膳食纖維水溶液黏度的測(cè)定[8]

將質(zhì)量濃度為10、20、50、100、150、200 mg/mL的樣品水溶液，分別采用0.5號(hào)轉(zhuǎn)筒，在750 r/min、剪切速率850 s-1的條件下測(cè)定黏度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3 次，結(jié)果以x±s(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，用Origin 9.0 繪制圖像，采用SPSS進(jìn)行單因素方差分析進(jìn)行差異顯著性比較，P<0.05 為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 水溶性大豆皮膳食纖維的單糖單元

纖維素(cellulose)是由D-葡萄糖單元通過β-1,4苷鍵連接組成、直鏈的大分子多糖。半纖維素是由多種單糖構(gòu)成的、不均一，且大多帶有短支鏈的復(fù)合聚糖，其主鏈糖基有D-葡萄糖糖基、D-木糖糖基、D-半乳糖糖基、L-阿拉伯糖糖基和D-甘露糖糖基等。由表3可知，SDF-1、SDF-2、SDF-3分子的單糖單元中均含有葡萄糖、木糖、半乳糖和果糖，SDF-1還含有阿拉伯糖，說明它們?cè)从诎肜w維素和纖維素。從含量上看，SDF-1和SDF-3的葡萄糖、木糖、半乳糖比較接近，SDF-3的果糖含量明顯高于SDF-1，達(dá)61.01%；SDF-2果糖含量最低，但葡萄糖含量最高，為41.09%，說明水溶性大豆皮膳食纖維雜多糖可能會(huì)存在果糖聚合的支鏈或片段。結(jié)果表明，3種分子質(zhì)量水溶性大豆皮膳食纖維的單糖單元不同，含量也不同，會(huì)對(duì)其性質(zhì)和功能產(chǎn)生影響。

表3 SDF-1、SDF-2、SDF-3的單糖單元及質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%

2.2 水溶性大豆皮膳食纖維的分子官能團(tuán)、三螺旋結(jié)構(gòu)、結(jié)晶和熱穩(wěn)定性

從圖1可見，3種分子質(zhì)量水溶性大豆皮膳食纖維均存在有典型的糖類特征吸收峰。3 414 cm-1處的吸收峰說明含有羥基[10]；2 920 cm-1處的吸收峰說明甲基和亞甲基存在[11]；1 731 cm-1處的吸收峰說明含有醛基[12]；1 612 cm-1吸收峰說明存在羧酸根離子[13,14]；在1 415 cm-1出現(xiàn)吸收峰說明存在羰基[15]；1 071 cm-1處的吸收峰說明存在醚鍵[16]；在890 cm-1處的吸收峰，說明存在β-型糖苷鍵[17]。在840 cm-1處的吸收峰說明存在α-型糖苷鍵[18]。

表4數(shù)據(jù)表明，SDF-1、SDF-2和SDF-3與剛果紅試劑形成了絡(luò)合物，最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生明顯的升高并出現(xiàn)峰值，說明它們均具有三螺旋結(jié)構(gòu)存在[19,20]，這是因?yàn)樯攀忱w維中纖維素的分子雖然沒有支鏈，但分子中鏈與鏈之間可借助分子間氫鍵像麻繩一樣擰緊的螺旋結(jié)構(gòu)[21]，并可形成一定的結(jié)晶。峰值過后，SDF-1和SDF-2隨著NaOH濃度增大，最大吸收波長(zhǎng)開始下降，這是因?yàn)檫^量的NaOH或在強(qiáng)堿環(huán)境下，破壞了與剛果紅試劑的絡(luò)合及三螺旋結(jié)構(gòu)，部分結(jié)晶也會(huì)遭到破壞，向無(wú)規(guī)則線團(tuán)鏈轉(zhuǎn)化[22]，甚至?xí)固擎溄到狻５玈DF-3最大吸收波長(zhǎng)基本沒有變化，說明膳食纖維分子質(zhì)量的大小會(huì)影響其螺旋結(jié)構(gòu)的緊密。分子質(zhì)量大，則分子中鏈與鏈之間形成三螺旋結(jié)構(gòu)和相互纏繞的機(jī)會(huì)更多，且更加緊密，不易被破壞。

圖1 SDF-1、SDF-2、SDF-3傅里葉紅外光譜圖

表4 SDF-1、SDF-2、SDF-3剛果紅實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果(最大吸收波長(zhǎng)/nm)

由表5可見，SDF-2、SDF-3在17.36°存在一個(gè)弱衍射峰，即出現(xiàn)結(jié)晶區(qū)，而SDF-1沒有出現(xiàn)衍射峰，屬于無(wú)定形結(jié)構(gòu)。說明分子質(zhì)量大利于形成結(jié)晶，而SDF-1分子質(zhì)量小，鏈短則鏈間利用氫鍵的形成的纏繞機(jī)會(huì)少且穩(wěn)定性差，無(wú)法形成定型結(jié)構(gòu)即結(jié)晶；SDF-2結(jié)晶區(qū)最大，可能與其葡萄糖單元含量最高，利于借助氫鍵形成鏈間穩(wěn)定的螺旋纏繞[20]有關(guān)。同理，具有結(jié)晶和結(jié)晶區(qū)大的SDF-2的熱穩(wěn)定性也最強(qiáng)，見表6，而分子質(zhì)量最小、無(wú)結(jié)晶的SDF-1的熱穩(wěn)定明顯不如SDF-2和SDF-3。

表5 SDF-1、SDF-2、SDF-3的X-衍射實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表6 大豆皮水溶性膳食纖維的DSC分析結(jié)果

2.3 水溶性大豆皮膳食纖維性質(zhì)

由表7可知，隨著分子質(zhì)量的增大，3種分子質(zhì)量水溶性大豆皮膳食纖維的吸水力、吸水后的膨脹力、黏性增大，即SDF-1

當(dāng)天然有機(jī)纖維與油料接觸時(shí)，油分子首先通過物理作用附著在纖維和半纖維表面，然后通過毛細(xì)管作用進(jìn)入纖維間隙，最后油分子聚集在纖維內(nèi)部間隙里[24]。因此，3種分子質(zhì)量水溶性大豆皮膳食纖維均具有吸附油脂的作用。但隨著分子質(zhì)量的增大，吸油量增大不明顯，可能是由于靜置時(shí)間僅1 h，物理吸附作用僅限于纖維表面，未能深入至纖維內(nèi)部間隙中。

對(duì)于3種分子質(zhì)量的水溶性大豆皮膳食纖維對(duì)陽(yáng)離子的吸附作用比較來看，來源纖維素和半纖維素的SDF-1、SDF-2、SDF-3的分子中均含有較多羧酸根離子，明顯表現(xiàn)出弱酸性，酸性多糖類膳食纖維具有較強(qiáng)的離子交換能力[25]，即與陽(yáng)離子螯合，呈現(xiàn)出一種能維持pH穩(wěn)定的作用。從圖2可見，隨分子質(zhì)量增大，弱酸性增強(qiáng)，因此，pH在堿性環(huán)境中上升也最慢，穩(wěn)定作用最好。分子質(zhì)量最小的SDF-1羧酸根離子相對(duì)少，但由于為無(wú)定形狀態(tài)，羧酸根離子暴露容易，與陽(yáng)離子螯合的空間障礙也小，因此，更容易與陽(yáng)離子螯合并達(dá)到飽和，從而對(duì)維持pH穩(wěn)定的作用有限。SDF-2、SDF-3分子質(zhì)量大，羧酸根離子相對(duì)多，但因分子鏈間纏繞并形成部分結(jié)晶，須在NaOH濃度不斷增大，使其纏繞和結(jié)晶被解析后，羧酸根離子逐步暴露，與陽(yáng)離子螯合；另外，分子質(zhì)量越大則空間障礙增大，也影響與與陽(yáng)離子螯合，因此，隨分子質(zhì)量增大，膳食纖維與陽(yáng)離子螯合不斷隨羧酸根離子的暴露而進(jìn)行，從而起到維持pH穩(wěn)定的作用。

圖2 SDF-1、SDF-2、SDF-3的陽(yáng)離子交換能力

由表7可見，3種分子質(zhì)量水溶性大豆皮膳食纖維在pH2.0和7.0環(huán)境下，對(duì)膽固醇吸附能力均為SDF-1> SDF-3> SDF-2。膳食纖維對(duì)膽固醇吸附屬于多層吸附，羰基是吸附膽固醇的活性基團(tuán)[26]，因此，纖維的孔密度和比表面積的大小，對(duì)吸附效果影響較大。分子質(zhì)量小的SDF-1，比表面積最大，空間障礙最小，因此，吸附膽固醇的效果最好；SDF-3的吸附效果優(yōu)于SDF-2，可能是同它們的單糖單元組成有關(guān)。由表2可知，葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖為醛糖，果糖為酮糖，SDF-2所含果糖含量最低，所具有的吸附膽固醇的活性羰基也最少，所以對(duì)膽固醇的吸附作用最小。

羥自由基由人體經(jīng)過新陳代謝所產(chǎn)生，氧化能力很強(qiáng)，會(huì)引起組織細(xì)胞氧化損傷，從而導(dǎo)致機(jī)體膜過氧化和蛋白質(zhì)交聯(lián)變性等，對(duì)人體健康傷害較大。由表7可見，3種分子質(zhì)量水溶性大豆皮膳食纖維對(duì)羥自由基的清除能力為SDF-1> SDF-2> SDF-3。膳食纖維多糖的羥基能夠在氧化還原反應(yīng)中提供電子或者氫原子[27]，可終止氧化鏈反應(yīng)，因此，3種分子質(zhì)量膳食纖維均具有清除羥自由基的能力。

表7 SDF-1、SDF-2、SDF-3的性質(zhì)測(cè)定結(jié)果

膳食纖維通過羧基與金屬離子(陽(yáng)離子)螯合[26]，抑制了金屬離子催化過氧化氫產(chǎn)生羥自由基的鏈反應(yīng)，從而抑制了它在Fenton反應(yīng)中的活性從而起到清除羥基自由基的作用[28]。從與陽(yáng)離子交換能力來看，SDF-1能更易、更快地螯合金屬離子(陽(yáng)離子)，另外，由X-射線衍射實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得知，SDF-1無(wú)結(jié)晶形態(tài)，屬于無(wú)定形結(jié)構(gòu)，羧基暴露多，空間障礙小，利于與羥自由基結(jié)合，所以大豆皮SDF表現(xiàn)出低分子質(zhì)量組分清除能力顯著好于高中分子質(zhì)量組分現(xiàn)象，這與Kitts等[29]的研究一致。SDF-2和SDF-3，雖然分子質(zhì)量較大，所含羧基更多，但因分子間纏繞更多、羧基無(wú)法暴露，空間障礙也大，因此，清除羥自由基的清除能力反而不如小分子質(zhì)量的膳食纖維多糖。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)中水溶性大豆皮膳食纖維具有典型糖類結(jié)構(gòu)特征基團(tuán)，其分子借助氫鍵作用均可形成鏈間的三螺旋結(jié)構(gòu)，且隨分子質(zhì)量增大，鏈間螺旋加纏繞更加緊密，可形成結(jié)晶部分，熱穩(wěn)定性也隨之增強(qiáng)，分子質(zhì)量最小的SDF-1，雖然分子間可以形成一定的三螺旋結(jié)構(gòu)，但無(wú)法形成結(jié)晶。隨分子質(zhì)量增大，水溶性大豆皮膳食纖維中的羥基、羧基等極性基團(tuán)增多，吸水力、吸油力、吸水膨脹力、黏度增大，與陽(yáng)離子交換和清除羥自由基的能力減小。SDF-1因呈無(wú)定型狀態(tài)，羧基等基團(tuán)暴露充分、空間障礙小，與陽(yáng)離子交換、清除羥自由基和吸附膽固醇的能力最強(qiáng)。