PRRSV類NADC30感染狀態(tài)下母豬血液內(nèi)毒素水平變化規(guī)律

趙星嵐，梁嘉婧，李亞杰，王 碩，張夢然，胡文翔，吳晨晨

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊陵 712100）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）俗稱豬藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種嚴(yán)重危害全球養(yǎng)豬業(yè)的疾病，妊娠母豬易感。臨床上分為急性型、慢性型和亞臨診型，其中慢性型PRRS是在規(guī)模化豬場的主要表現(xiàn)形式，PRRSV可在豬體內(nèi)持續(xù)幾個月甚至更長時間，但臨床癥狀不明顯。近年來，我國陸續(xù)報道PRRSV類NADC30毒株的流行和類NADC34毒株的出現(xiàn)，給豬場PRRS防控帶來新的挑戰(zhàn)。感染豬藍(lán)耳病后，豬體會長時間帶毒，導(dǎo)致機(jī)體免疫功能受到抑制，容易繼發(fā)感染細(xì)菌性疾病，如沙門氏菌，鏈球菌病和大腸桿菌等。細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的一種成分，細(xì)菌在存活狀態(tài)時不能釋放出來，只有當(dāng)細(xì)菌死亡、自溶或黏附在其他細(xì)胞時，才表現(xiàn)其毒性，內(nèi)毒素的主要化學(xué)成分是脂多糖。很多報道中均發(fā)現(xiàn)了豬藍(lán)耳病與革蘭氏陰性菌混合感染的情況。試驗主要監(jiān)測了感染豬藍(lán)耳病的豬場和健康豬場，通過分析2個豬場內(nèi)毒素水平的變化規(guī)律，進(jìn)一步確診內(nèi)毒素對母豬繁殖性能的影響，以期明確豬只感染豬藍(lán)耳病病毒后混合感染的細(xì)菌對豬場繁殖性能的影響，也為以后規(guī)?；i場豬藍(lán)耳病的監(jiān)測提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗選擇了西北地區(qū)生物安全基礎(chǔ)較好的2個同等規(guī)模的母豬場，均是按照豬藍(lán)耳病陽性穩(wěn)定豬場進(jìn)行管理，免疫程序基本一致。豬場1母豬血液檢測檢出PRRSV 類NCDC30陽性，豬場2為豬場1的正常對照豬場，豬血液中未檢測出任何豬藍(lán)耳病病原。分別選取2個豬場妊娠3周、6周、9周、12周和15周的母豬，每場各6頭進(jìn)行前腔靜脈采血，每頭5 mL，采集完畢后置于離心機(jī)，在3 000 r/min條件下離心20 min，用于分離血清/血漿，-20℃冰箱凍存?zhèn)錂z。收集血漿進(jìn)行豬藍(lán)耳病抗原、抗體水平的監(jiān)測以及內(nèi)毒素、降鈣素原和超敏C蛋白水平的分析，同時，實時記錄母豬妊娠周齡的流產(chǎn)率等情況。

1.2 主要試劑

采集豬血及血清檢測實驗操作中所使用到的相關(guān)化學(xué)試劑見表1。

表1 主要化學(xué)試劑

1.3 主要儀器設(shè)備

采集豬血及血清檢測實驗操作中所使用到的相關(guān)儀器設(shè)備見表2。

表2 主要儀器設(shè)備

1.4 ELISA樣品檢測方法

實驗開始前20 min從冰箱中將備檢血清應(yīng)用ELISA方法檢測各個妊娠階段母豬的豬藍(lán)耳病抗體、內(nèi)毒素（LPS）、降鈣素原（PCT）和超敏C蛋白（hs-CRP）。具體操作步驟如下：打開鋁箔密封袋，小心取出包被板，使用自封袋將計劃未使用的包被板封閉完好后放回冰箱；分別設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白孔（不加血清、稀釋液和酶標(biāo)試劑）和待測血清孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔依次加不同濃度（按濃度高低順序依次加樣）的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL ；血清5倍稀釋：先加備檢豬只血清10 μL于樣品孔中，再加40 μL稀釋液；標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔中每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體100 μL，封板膜封孔完好后，放于恒溫箱（提前30 min打開，設(shè)置為37℃）中溫育60 min；洗滌：溫育完畢后棄去液體，濾紙上拍打甩干，加滿提前配好的洗滌液（使用純水稀釋20×濃縮洗滌液至1倍），靜置40 s，倒掉洗滌液，濾紙上拍打甩干，反復(fù)洗滌5次（也可用洗板機(jī)洗滌包被板）；每孔加入顯色劑A、B各50 μL，輕輕震蕩后封板，于37℃避光條件下溫育15 min；溫育完畢后加入終止液50 μL，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定各孔的OD值，此操作在15 min內(nèi)完成。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗數(shù)據(jù)由軟件ELISACalc回歸擬合計算程序計算獲得，采用SPSS 26.0軟件中的One-Way ANOVA進(jìn)行分析，對比各個母豬場間同階段數(shù)據(jù)的差異性。a,b,c代表不同字母的值差異顯著（P＜ 0.05）， 利 用 軟 件 GraphPad Prism 5.0作圖，所制作的圖像以平均數(shù)（X）±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）形式表示。

2 結(jié)果

2.1 豬場1與豬場2豬繁殖與呼吸綜合征的病原、抗體檢測結(jié)果

從表3結(jié)果發(fā)現(xiàn)，豬場1母豬與豬場2母豬，各個周齡妊娠母豬檢測抗體水平均呈陽性；單一從豬場2的數(shù)據(jù)看，豬藍(lán)耳病疫苗免疫后豬群抗體陽性率為100%，揭示免疫豬藍(lán)耳病疫苗后豬群可以產(chǎn)生抗體，鑒于豬場1檢測時已經(jīng)確認(rèn)該豬場有PRRSV類NADC30檢出，據(jù)此不能完全判斷豬場1的抗體陽性率100%是正常免疫導(dǎo)致的，可能存在PRRSV類NADC30感染后導(dǎo)致的抗體出現(xiàn)，需要進(jìn)一步評估。

表3 2個母豬場豬藍(lán)耳病毒抗體結(jié)果檢測

對送檢的樣本進(jìn)行PRRSV類NADC30及PRRSV-歐洲株的檢測（見表4），豬場1妊娠3周、6周、9周、12周、15周母豬的血清中均檢測出PRRSV類NADC30病原，PRRSV-歐洲株未檢出；豬場2作為對照組PRRSV類NADC30及PRRSV-歐洲株均未檢出，提示目前的豬場1存在PRRSV類NADC30感染的情況。

表4 2個母豬場豬藍(lán)耳病病毒抗原結(jié)果檢測

2.2 妊娠母豬階段流產(chǎn)率的統(tǒng)計

對豬場1妊娠母豬流產(chǎn)情況按照妊娠0—3周、4—6周、7—9周、10—12周、13周以上進(jìn)行統(tǒng)計（見圖1），共統(tǒng)計325頭流產(chǎn)母豬，其中母豬妊娠0—3周齡流產(chǎn)數(shù)量為9頭，流產(chǎn)比率為2.77%；母豬妊娠4—6周齡流產(chǎn)數(shù)量為45頭，流產(chǎn)比率為13.85%；母豬妊娠7—9周齡流產(chǎn)數(shù)量為123頭，流產(chǎn)比率為37.85%；母豬妊娠10—12周齡流產(chǎn)數(shù)量為63頭，流產(chǎn)比率為19.38%；母豬妊娠13周齡以上流產(chǎn)數(shù)量為85頭，流產(chǎn)比率為26.15%，其中妊娠7周以上的流產(chǎn)母豬合計占比83.38%，說明豬場流產(chǎn)主要集中在妊娠中后期的母豬，同時對于妊娠早期（6周前）的母豬也有一定的影響，流產(chǎn)率占比為16.62%。

圖1 豬場1妊娠母豬階段流產(chǎn)數(shù)目和比率

2.3 母豬內(nèi)毒素、降鈣素原和超敏C蛋白的水平

對2個豬場的妊娠母豬的LPS的含量進(jìn)行檢測分析（見圖2），發(fā)現(xiàn)豬場1母豬妊娠9周齡、12周齡、15周齡血液中內(nèi)毒素的含量顯著高于同豬場妊娠3周、6周母豬水平（P＜0.05），這與圖1顯示的妊娠7周以上的流產(chǎn)母豬合計占比83.38%的高流產(chǎn)率的結(jié)果呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)，暗示革蘭氏陰性菌在豬藍(lán)耳病發(fā)病期間可能加劇了豬場母豬的發(fā)病流產(chǎn)的程度，與豬場2妊娠正常母豬對照群比較，差異也十分顯著 （P＜0.05），進(jìn)一步證實革蘭氏陰性菌會加劇豬藍(lán)耳病感染后的流產(chǎn)程度。

圖2 2個豬場母豬血液內(nèi)毒素、超敏C蛋白和降鈣素原的含量

對豬場1和豬場2的母豬群的hs-CRP的含量進(jìn)行檢測分析，發(fā)現(xiàn)2個豬場的母豬在妊娠3周齡、6周齡、9周齡、12周齡和15周齡血液hs-CRP的含量之間無顯著性差異（P＞0.05）。

對豬場1和豬場2的母豬群PCT的含量進(jìn)行監(jiān)測分析，發(fā)現(xiàn)豬場1流產(chǎn)母豬血液PCT的含量顯著高于同群未流產(chǎn)母豬，同樣流產(chǎn)母豬血液PCT的含量也明顯高于豬場2的對照母豬群血液PCT的含量；與此同時，妊娠9周齡血液中豬降鈣素原的含量顯著高于同豬場其他妊娠周齡的母豬群（P＜0.05），這與LPS的檢測結(jié)果的趨勢一致，進(jìn)一步證實革蘭氏陰性菌會加劇豬藍(lán)耳病感染后的流產(chǎn)程度。

3 討論

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由PRRSV感染而引起的一種烈性傳染病，患病母豬通常會產(chǎn)生早產(chǎn)、流產(chǎn)以及死胎數(shù)增加等不良臨床表現(xiàn)，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的損失。豬藍(lán)耳病感染后機(jī)體的免疫能力會降低，進(jìn)而導(dǎo)致了豬體的抗病能力下降，容易繼發(fā)感染細(xì)菌性疾病，加重病情的發(fā)展。相關(guān)報道了母豬易繼發(fā)感染沙門氏菌、大腸桿菌、巴氏桿菌等大量的革蘭氏陰性菌，細(xì)菌不斷在豬體內(nèi)生長繁殖并黏附在其他細(xì)胞上可釋放大量內(nèi)毒素，進(jìn)入血液中引起內(nèi)毒素血癥，加劇病情的發(fā)生發(fā)展，因此通過監(jiān)測內(nèi)毒素的變化對于進(jìn)一步印證豬場感染豬藍(lán)耳病后是否存在細(xì)菌的混合感染，大量細(xì)菌的繁殖增生是否釋放其毒素，加重對其豬只免疫系統(tǒng)的破壞具有明顯的診斷意義。在本案例中，通過前期的病原篩查已經(jīng)確認(rèn)了豬場1有PRRSV NADC30的陽性檢出，同時豬群也出現(xiàn)明顯的流產(chǎn)癥狀，這對于分析豬藍(lán)耳病感染后的內(nèi)毒素的變化提供了具有直接生產(chǎn)指導(dǎo)意義的數(shù)據(jù)分析基礎(chǔ)，與此同時，在同地區(qū)的未檢出PRRSV NADC30陽性的豬場2在豬場設(shè)計工藝、生物安全基礎(chǔ)、飼養(yǎng)規(guī)模、飼養(yǎng)管理方式，生產(chǎn)節(jié)律以及免疫程序都是基本一致的，這也為本次科學(xué)分析內(nèi)毒素在豬藍(lán)耳病感染中的繼發(fā)影響最大程度提供了客觀的可比性。經(jīng)查閱資料，本次對比分析中優(yōu)先選取了內(nèi)毒素、超敏C蛋白和降鈣素原，從目前的實驗室研究結(jié)果看，這3個指標(biāo)具備明顯典型性，符合作為有效臨床監(jiān)測指標(biāo)準(zhǔn)確性、靈敏性及快速性的特點。超敏C反應(yīng)蛋白是由肝臟合成的全身性炎癥反應(yīng)急性期的非特異性標(biāo)志物，在臨床上常作為鑒別是否是細(xì)菌感染主導(dǎo)還是病毒感染主導(dǎo)的重要監(jiān)測指標(biāo)。在本案例中，2個豬場的母豬在妊娠3周齡、6周齡、9周齡、12周齡和15周齡血液hs-CRP的含量之間均無顯著性差異（P＞0.05），提示豬場1的發(fā)病主因是病毒性感染為主。LPS與PCT均是細(xì)菌感染程度分析的重要指標(biāo)。內(nèi)毒素的主要化學(xué)成分是脂多糖，與革蘭氏陰性菌的感染程度有明顯的正相關(guān)性。降鈣素原是一種蛋白質(zhì)，當(dāng)嚴(yán)重細(xì)菌、真菌、寄生蟲感染以及膿毒血癥和多器官功能衰竭時其在血漿中的水平升高，局部有限的細(xì)菌感染、輕微的感染和慢性炎癥不會導(dǎo)致其升高。豬場1母豬妊娠9周齡、12周齡、15周齡血液中內(nèi)毒素的含量顯著高于同豬場妊娠3周、6周的母豬群（P＜0.05），這與妊娠7周以上的流產(chǎn)母豬合計占比83.38%的高流產(chǎn)率的結(jié)果呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)，與豬場2妊娠正常母豬對照群比較，差異也十分顯著，證實革蘭氏陰性菌會加劇豬藍(lán)耳病感染后的流產(chǎn)程度，且對妊娠中后期的母豬影響高于對妊娠早期母豬的影響。豬場1流產(chǎn)母豬血液PCT的含量顯著高于同群未流產(chǎn)母豬，與此同時流產(chǎn)母豬血液PCT的含量也明顯高于豬場2的對照母豬群血液PCT的含量；妊娠9周齡母豬血液中豬降鈣素原的含量顯著高于同豬場其他妊娠周齡的母豬群，這與LPS的檢測結(jié)果的趨勢一致，進(jìn)一步證實革蘭氏陰性菌會加劇豬藍(lán)耳感染后的流產(chǎn)程度。

經(jīng)過系統(tǒng)的對比分析，可以確定豬場1的感染主要以病毒感染為主，細(xì)菌感染參與了繼發(fā)感染，加劇了臨床發(fā)病的速度以及流產(chǎn)的嚴(yán)重程度，這與豬場的實際生產(chǎn)數(shù)據(jù)變化高度一致。一個有效的監(jiān)測指標(biāo)在生產(chǎn)實踐過程中對疾病的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷具有明顯的實際意義和經(jīng)濟(jì)意義，因此選擇靈敏度高、穩(wěn)定、快速、典型的監(jiān)測指標(biāo)一直是一線生產(chǎn)者、獸醫(yī)等從業(yè)人員關(guān)注的重點。內(nèi)毒素、超敏C蛋白和降鈣素原這3個指標(biāo)可以快速地進(jìn)行豬場疾病的分型以及對疾病發(fā)展程度進(jìn)行初步準(zhǔn)確的判斷，結(jié)合豬場的實際情況，以及后續(xù)的實驗室檢測結(jié)果，更加精準(zhǔn)地進(jìn)行疾病的防控。與此同時，在生產(chǎn)實踐中很多情況發(fā)生疾病的原因是多樣性的，因此單一的檢測某一指標(biāo)已經(jīng)跟不上豬場的需求，綜合性的檢測分析是豬場未來檢測的重點，據(jù)此，本次對比分析不僅為解決當(dāng)前發(fā)生問題的控制提供了至關(guān)重要的決策依據(jù)，還建立了完整的、完全符合養(yǎng)豬生產(chǎn)特點的綜合性診斷方法，為以后規(guī)模化豬場的病毒和細(xì)菌性疾病的監(jiān)測提供數(shù)據(jù)支持，也為提高豬場的健康養(yǎng)殖奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。