蜜蜂遺傳育種新技術(shù)（一）
——蜜蜂轉(zhuǎn)基因與克隆

薛運(yùn)波│文 李志勇│圖

1.蜜蜂轉(zhuǎn)基因技術(shù)

蜜蜂轉(zhuǎn)基因育種（transgenic breeding）是通過基因工程技術(shù)將外源目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，整合到受體細(xì)胞基因組中，并使外源基因得到表達(dá)和遺傳，以此獲得新品種。該技術(shù)的根本意義在于它克服固有的生殖隔離，實(shí)現(xiàn)物種間遺傳物質(zhì)的交換，在改良蜜蜂抗病和經(jīng)濟(jì)性狀以及生物反應(yīng)器利用等方面展示了良好的應(yīng)用前景。

自從1982年成功研究出首例轉(zhuǎn)基因果蠅以來，轉(zhuǎn)基因昆蟲的研究便引起科學(xué)家們極大的興趣。目前，已經(jīng)獲得成功的轉(zhuǎn)基因昆蟲有黑腹果蠅、海地果蠅、地中海實(shí)蠅、家蠶、蚊子等。鑒于蜜蜂特殊的社會(huì)行為和級(jí)型分化現(xiàn)象，有學(xué)者認(rèn)為以下兩種方法是蜜蜂轉(zhuǎn)基因較好的途徑：一是以蜜蜂人工授精技術(shù)為基礎(chǔ)的精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因法，二是蜜蜂卵或幼蟲的轉(zhuǎn)基因操作與蜜蜂人工孵育技術(shù)相結(jié)合的方法。

（1）精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因法

1971年，Brackett 等發(fā)現(xiàn)精子細(xì)胞具有自發(fā)地吸收外源DNA，并可在受精的過程中將外源DNA 攜帶進(jìn)卵內(nèi)。用精子作為轉(zhuǎn)移外源DNA 的載體，將DNA 溶液和動(dòng)物精子共浴，精子能主動(dòng)吸附外源DNA，利用這一點(diǎn)可以很容易地將外源DNA 導(dǎo)入精子細(xì)胞或結(jié)合于精子細(xì)胞表面。再通過人工授精，將外源DNA 帶入受精卵進(jìn)而發(fā)育成個(gè)體（圖1），從而生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。利用精子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因蜜蜂的研究也有成功報(bào)道。1991年，Atkinson 等首次將蜜蜂精子與外源DNA 進(jìn)行共培養(yǎng)，證實(shí)蜜蜂精子也能夠吸收其他動(dòng)物的DNA。2000年，Robinson 等研究精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法用于蜜蜂轉(zhuǎn)基因的可行性。結(jié)果表明，蜜蜂精子能將外源線性質(zhì)粒DNA 攜帶進(jìn)入卵子，外源DNA能在受體蜜蜂個(gè)體中存在數(shù)月之久，能在幼蟲期進(jìn)行表達(dá)，至少能穩(wěn)定遺傳三代。盡管沒有找到外源DNA 整合到蜜蜂基因組上的證據(jù)，但該研究證明蜜蜂精子同樣具有攜帶外源DNA 進(jìn)入卵子的能力?；诿鄯淙斯な诰夹g(shù)的精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因，操作簡(jiǎn)便，成功率高，成本低廉，便于大批量篩選，不但可以用于蜜蜂的分子育種，培育出具有抗殺蟲劑特性、抗病蟲害以及耐寒等蜜蜂品種，而且可以用于蜜蜂基因功能分析及用作生物反應(yīng)器等研究。

圖1 介導(dǎo)后的卵在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)出蜜蜂

（2）顯微注射法

借助光學(xué)顯微鏡，直接把外源性DNA 注射到蜜蜂卵或者幼蟲體內(nèi)，獲得轉(zhuǎn)基因蜜蜂。與其他昆蟲相比，蜜蜂卵的個(gè)體和卵黃區(qū)均較大，卵殼韌性不易破碎，卵孔明顯，很適合于進(jìn)行顯微注射操作（圖2）。由于蜂卵產(chǎn)下后1 ～2 小時(shí)內(nèi)卵孔是開啟的，顯微注射操作可以在此時(shí)進(jìn)行，通過卵孔將外源DNA 注入卵內(nèi)。人為操作勢(shì)必會(huì)在卵體上留下異味，遭到蜂群的清理，以此，蜜蜂幼蟲的室內(nèi)人工哺育技術(shù)可以作為蜂卵顯微注射后的輔助技術(shù)。Milne 等對(duì)意蜂卵顯微注射技術(shù)做了初步研究，他們?cè)谑覝叵聦?日齡卵固定在玻璃片上，在卵上覆蓋一層低粘度石蠟油，使用顯微操作器向卵注射石蠟后，將其放入35℃保溫箱內(nèi)孵化，觀察卵的發(fā)育。注射石蠟油的卵的孵化率降至21%，孵化時(shí)間延長(zhǎng)。外源DNA 能否通過顯微注射技術(shù)整合到蜜蜂基因組上并有效的表達(dá)和遺傳尚不得而知，顯微注射法用于蜜蜂轉(zhuǎn)基因研究還有很長(zhǎng)的路要走。

圖2 轉(zhuǎn)基因顯微注射設(shè)備

2.基因克隆

克隆技術(shù)是指從眾多的基因或細(xì)胞群體中通過無性繁殖和選擇，獲得目的基因或篩選細(xì)胞的技術(shù)操作。基因克?。╣ene cloning）是上世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一項(xiàng)具有革命性的研究技術(shù)，是基因工程的上游工程。美國(guó)斯坦福大學(xué)的Berg 等人于1972年把一種病毒的DNA 與λ 噬菌體DNA 用同一種限制性內(nèi)切酶切割后，再用DNA 連接酶把這兩種DNA 分子連接起來，于是產(chǎn)生一種新的重組DNA 分子，從而產(chǎn)生了基因克隆技術(shù)。1973年，Cohen 等人把一段外源DNA 片段與質(zhì)粒DNA 連接起來，構(gòu)成一個(gè)重組質(zhì)粒，并將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)至大腸桿菌，第一次完整地建立起基因克隆體系。采用重組DNA 技術(shù)，將不同來源的DNA 分子在體外進(jìn)行特異切割，重新連接，組裝成一個(gè)新的雜合DNA分子，將這個(gè)雜合分子轉(zhuǎn)移至一定的宿主細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，形成大量的子代分子，此過程即是基因克隆?；蚩寺∵^程會(huì)涉及到一系列的分子生物學(xué)技術(shù)（圖3），包括目的DNA 片段的獲得、載體的選擇、工具酶的選用、體外重組、宿主細(xì)胞導(dǎo)入和重組子篩選技術(shù)等等。基因克隆技術(shù)的出現(xiàn)為蜜蜂轉(zhuǎn)基因育種奠定基礎(chǔ)。

圖3 基因克隆技術(shù)檢測(cè)設(shè)備