CDC20、TOP2A、NEK2的表達與食管鱗狀細胞癌分期和預后的相關性及其對腫瘤細胞增殖和轉移的影響*

付 民 尹先哲 尹 星 常 歡 周 陽 邢艷麗

（南陽市第二人民醫(yī)院腫瘤一病區(qū)，南陽 473000）

食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cancer，ESCC）是一種高發(fā)病率和死亡率的食管癌[1]。由于ESCC患者的5年生存率低，因此迫切需要探索新的早期診斷標志物[2]。細胞分裂周期20同源物（CDC20，也稱為Fizzy相關蛋白1）是一種具有致癌功能的蛋白，參與調控ESCC耐藥性的增加[3]。另外，拓撲異構酶Ⅱα（TOP2A）可參與DNA復制，不僅與蒽環(huán)霉素抗癌敏感性有關，而且與腫瘤的發(fā)病機制具有密切關系[4]。已知非有絲分裂相關激酶2（NEK2）也參與可腫瘤的發(fā)生、耐藥性和腫瘤的進展[5]。然而，CDC20、TOP2A及NEK2三者與ESCC分期和預后的關系并不清楚。本研究通過檢測CDC20、TOP2A和NEK2在ESCC中的表達，并分析它們與臨床病理參數(shù)的關系，分析CDC20、TOP2A和NEK2的表達與ESCC的預后關系，體外實驗進一步檢測3個基因過表達對ESCC細胞增殖和遷移的影響，為尋找食管癌增殖和轉移的靶基因奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 患者和組織樣本

收集2011年1月至2017年12月間112例食管癌病例。納入標準如下：診斷為食管鱗狀細胞癌的患者；術前無放療或化學療法；食管部位為主要病灶。排除標準如下：食管腺癌；手術前接受過放療或化療的患者；腫瘤轉移到食管；不包括其他國家和民族患者。本研究選擇了30例接受手術治療、未進行術前放化療的ESCC患者的新鮮組織以及石蠟包埋組織和各自匹配的癌旁組織。記錄每位患者的以下信息：年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤大小、分化程度、TNM分期[TNM分期是美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）發(fā)布的食管癌第8版分期]、淋巴結狀態(tài)、血管浸潤、神經(jīng)浸潤、術后放化療和疾病進展。本研究經(jīng)南陽市第二人民醫(yī)院倫理委員會的審查批準（20170410022）。病歷隨訪至2018年12月。

1.2 試劑耗材

Cdc20（CDC20）、TopⅡα（TOP2A）、Nek2（NEK2）的一抗購于美國Abcam公司；PrimeScript RT試劑盒、TRIzol試劑、SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒均購于大連TaKaRa公司；細胞計數(shù)Kit-8（CCK-8）試劑盒和組織蛋白提取試劑盒購于碧云天生物科技有限司；PVDF膜購于美國Millipore公司；CDC20、TOP2A、NEK2各自的過表達重組質粒依次為pcDNA3.1-CDC20（pcCDC20）、pcDNA3.1-TOP2A（pcTOP2A）、pcDNA3.1-NEK2（pcNEK2）及各自的陰性對照pcDNA3.1-CDC20-negative control（pcCDC20-NC）、pcDNA3.1-TOP2A-negative control（pcTOP2A-NC）、pcDNA3.1-NEK2-negative control（pcNEK2-NC）均購于上海吉瑪公司。

1.3 實時熒光定量PCR

通過實時熒光定量PCR分析了112對ESCC組織及匹配的癌旁組織（no-tumor， NT）中CDC20、TOP2A、NEK2的mRNA表達。根據(jù)說明使用TRIzol試劑提取總RNA。用PrimeScript RT試劑盒從1 mg總RNA逆轉錄得到cDNA 。以2 μL cDNA為模板，用SYBR Premix Ex TaqⅡ進行實時熒光定量PCR。GAPDH作為內參基因。各基因的引物見表1。

表1 引物序列

1.4 蛋白免疫印跡實驗檢測

使用組織蛋白提取試劑盒提取總蛋白，并使用BCA分析定量。用SDS-PAGE凝膠分離等量的蛋白裂解物，然后電轉移到PVDF膜上。然后將在4 ℃下過夜孵育一抗CDC20（1∶500）、TOP2A（1∶800）、NEK2（1∶500）。GAPDH（1∶5 000）用于內參蛋白。與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗孵育后，用ECL檢測試劑檢測印跡信號。使用Image J 1.8分析條帶灰度值。

1.5 免疫組織化學顯色

將石蠟包埋的樣品切成4 μm切片，并在65℃下烘烤1 h。將切片用二甲苯脫蠟并水化，浸入0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH=6.0）抗原回收緩沖液中，并微波處理以進行抗原回收。它們在室溫下用0.3% H2O2處理15 min以封閉內源性過氧化物酶。隨后，將載玻片與正常山羊血清溫育30 min以減少非特異性結合。隨后，將載玻片與抗CDC20（1∶1 000）、TOP2A（1∶800）、NEK2（1∶500）。在4℃下孵育過夜。洗滌后，將載玻片與相應的二抗在37℃溫育30 min，隨后用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色。最后，將切片用蘇木精和曙紅復染，用分級乙醇脫水并用中性膠固定。通過用無關的兔IgG mAb代替一抗來進行陰性對照。兩位獨立的病理實驗工作者對染色進行評估。根據(jù)以下標準評價染色強度：0（不染色），1（弱染色，亮黃），2（中等染色，棕色），3（強染色，深棕色）。陽性細胞百分比遵循以下標準：0（陽性染色腫瘤細胞：0%～9%），1（陽性染色腫瘤細胞：10%～25%），2（陽性染色腫瘤細胞，26%～50%），3（陽性染色的腫瘤細胞，占51%～75%），4（陽性染色的腫瘤細胞，＞ 75%）。染色指數(shù)=陽性細胞百分比×染色強度。

1.6 細胞培養(yǎng)和質粒轉染

使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在5%CO2及37℃濕潤無菌環(huán)境下培養(yǎng)ESCC細胞系KYSE-150，細胞生長到對數(shù)期時，對細胞分別轉染 10 μg pcCDC20和10 μg pcCDC20-NC，2 μg pcTOP2A和2 μg pcTOP2A-NC，1 μg pcNEK2 和1 μg pcNEK2-NC 24 h。細胞分組 為pcCDC20、pc CDC20-NC、pc TOP2 A、pc TOP2 A-NC、pcNEK2、pcNEK2-NC，無處理組為對照組。

1.7 CCK-8實驗

細胞計數(shù)Kit-8（CCK-8）法檢測KYSE-150細胞的增殖率，嚴格采用CCK-8試劑盒并按照說明書進行，在450 nm處進行分光光度法測定吸光度。

1.8 傷口愈合實驗

轉染24 h后，待以上各組KYSE-150細胞生長至融合度為100%，用無菌移液管尖端在6孔塑料培養(yǎng)板上劃直線，用無血清DMEM洗滌細胞后，進行常規(guī)培養(yǎng)，在劃痕后0 h和24 h時間點拍照。

1.9 統(tǒng)計學處理

臨床和病理因素包括年齡：≤65歲vs＞65歲；性別：男性vs女性；腫瘤部位：胸上段、胸中段、胸下段；腫瘤大?。盒∮? cmvs≥4 cm；組織學分級G1、G2、G3；TNM階段：侵襲深度T1-T2、T3-T4；B；淋巴結轉移：否，是；TNM分級：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ。通過Spearman相關分析使用CDC20，TOP2A和NEK2之間的關系?？偵嫫诙x為手術日期與死亡日期或最后一次隨訪日期之間的時間間隔。χ2檢驗用于分析基因表達與臨床病理參數(shù)的相關性。應用Kaplan-Meier生存分析比較總生存期，并使用對數(shù)秩檢驗比較它們之間的差異。使用Cox比例風險回歸模型進行單因素和多元回歸分析，以分析影響預后的獨立因素。所有統(tǒng)計檢驗均為雙面檢驗。使用t檢測統(tǒng)計分析細胞的增殖率變化和細胞遷移率差異，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。所有統(tǒng)計分析均使用SPSS 18.0軟件。

2 結果

2.1 患者基線特征

患者的基線特征如表2所示，確診的患者年齡范圍為42歲到76歲（中位數(shù)，65歲），以男性為主（112人中有87人，77.7%）。其中，非吸煙患者（30人）占36.8%，吸煙患者占63.2%。按解剖部位分，腫瘤位于食管中段的（94人）占83.9%，位于上、下段的占16.1%。

根據(jù)AJCC第7版的分期系統(tǒng)，患者病理腫瘤分期的分布為Ⅰ期7例，Ⅱ期32例，Ⅲ期73例。49例（43.8%）的患者有淋巴結轉移（表2）。

表2 ESCC患者病理特征

2.2 CDC20、TOP2A、NEK2基因在ESCC組織中的表達

首先利用qRT-PCR法對CDC20、TOP2A、NEK2基因的轉錄水平表達進行檢測。選擇ESCC組織及匹配的癌旁非腫瘤組織（no-tumor， NT）。結果顯示，與NT組比，ESCC組織中CDC20、TOP2A、NEK2 mRNA水平都高于非腫瘤組織，差異均有統(tǒng)計學意義（圖1A～C）。隨后使用蛋白免疫印跡法檢測CDC20、TOP2A、NEK2在ESCC組織中的蛋白表達，結果與qRT-PCR結果一致，與NT組比，ESCC組織中CDC20、TOP2A、NEK2 的蛋白水平都高于NT組，差異均有統(tǒng)計學意義（圖1D）。免疫組織化學結果與qRT-PCR和免疫印跡結果一致（圖2）。

圖1 CDC20、TOP2A、NEK2基因在ESCC組織中的表達

圖2 免疫組織化學法檢測CDC20、TOP2A、NEK2基因在ESCC組織中的表達

2.3 CDC20、TOP2A、NEK2基因表達之間的關系

結果顯示（表3），在ESCC中，通過Spearman相關分析，CDC20的表達與TOP2A呈正相關（P=0.002，r=11.265）（表3）；CDC20的表達與NEK2呈現(xiàn)正相關性（P=0.008，r=7.217）（表3）。同時，TOP2A和NEK2間有相關性（P=0.028，r=4.410）（表3）。在112例ESCC中，通過免疫組織化學檢測ESCC組織的Ki-67表達。CDC20與Ki-67之間呈正相關（P=0.034，r=1.348）（表3）。TOP2A與Ki-67之間呈正相關（P=0.027，r=2.514）（表3）。NEK2與Ki-67之間呈正相關（P=0.039，r=3.771）（表3）。

表3 CDC20、TOP2A、NEK2、Ki-67基因表達之間的相關性

2.4 CDC20、TOP2A、NEK2基因表達與臨床病理變量的關系

CDC20、TOP2A、NEK2表達與ESCC臨床分期的關聯(lián)分析結果（表4）顯示，CDC20與ESCC與腫瘤大小相關（P=0.015），與腫瘤侵襲深度（P=0.028）、淋巴結轉移（P=0.041）和TNM階段（P=0.022）均相關。

表4 CDC20、TOP2A、NEK2表達與ESCC臨床分期的相關性分析

結果表明，TOP2A在 ESCC與腫瘤大小有關（P=0.036），與腫瘤侵襲深度（P=0.019）、淋巴結轉移（P=0.047）和TNM階段（P=0.023）均相關。

NEK2與ESCC與腫瘤大小有關（P=0.013），與腫瘤侵犯深度（P=0.054）、淋巴結轉移（P=0.063）和TNM階段（P=0.077）無關。

CDC20、TOP2A、NEK2的表達與性別、年齡、吸煙史和組織學分級均無關（P＞0.05）。

2.5 CDC20、TOP2A、NEK2基因表達與總生存率的關系

CDC20表達與ESCC生存期顯著相關（P=0.014），而CDC20低表達組生存期較好（圖3A）。CDC20高表達組生存期中位數(shù)（18.6個月）較CDC20低表達組生存期中位數(shù)（47.0個月）明顯較短（圖3A～C）。

TOP2A表達與ESCC生存期顯著相關（P=0.033），TOP2A低表達組生存期較好。TOP2A高表達組生存期中位數(shù)（19.8個月）較TOP2A低表達組生存期（39.6個月）短得多（圖3B）。

NEK2表達與ESCC生存期顯著相關（P=0.042），NEK2低表達組生存期較好。NEK2高表達組生存期中位數(shù)（20.6個月）較NEK2低表達組生存期（31.5個月）較短（圖3C）。

圖3 Kaplan-Meier曲線分析總生存率的變化

2.6 CDC20、TOP2A、NEK2基因過表達對ESCC細胞增殖的影響

對2種ESCC細胞分別進行了CDC20、TOP2A、NEK2基因的過表達，與pcCDC20-NC比較，pcCDC20上調CDC20的表達，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與pcTOP2A-NC比較，pcTOP2A上調TOP2A的表達，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與pcNEK2-NC比較，pcNEK2上調NEK2的表達，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

與pcCDC20-NC比 較，pcCDC20上 調ESCC細胞的增殖率，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖4A）。與pcTOP2A-NC比較，pcTOP2A上調ESCC細胞的增殖率，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖4B）。與pcNEK2-NC比較，pcNEK2上調ESCC細胞的增殖率，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖4C）。

2.7 CDC20、TOP2A、NEK2基因過表達對ESCC細胞遷移率的影響

與pcCDC20-NC比較，pcCDC20上調ESCC細胞的遷移率，差異有統(tǒng)計學意義（圖4D，P＜0.05）。與pcTOP2A-NC比較，pcTOP2A上調ESCC細胞的遷移率，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與pcNEK2-NC比較，pcNEK2上調ESCC細胞的遷移率，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖4 CDC20、TOP2A、NEK2基因過表達后ESCC細胞KYSE-150的增殖率和遷移率變化

3 討論

ESCC是最普遍和最具侵襲性的腫瘤之一，是原發(fā)性惡性腫瘤，預后差，發(fā)病率高，目前尚無有效治療手段，因此需要廣泛發(fā)現(xiàn)及深入研究ESCC的標志物，為提高ESCC診斷和治療提供新的有效靶點。CDC20在多種惡性腫瘤中高表達[10]，而且CDC20的高表達與膀胱癌、宮頸癌、結腸癌、子宮內膜癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、前列腺癌和腎癌的高腫瘤分級有關[6]。據(jù)報道，CDC20與胰腺癌、肺癌、膀胱癌、結腸癌、口腔鱗狀細胞癌和乳腺癌的不良預后顯著相關[7-10]。在一項研究中，CDC20的過表達增強了胰腺癌細胞的增殖和侵襲，而下調CDC20則抑制胰腺癌細胞的腫瘤活性[11]。本研究結果顯示，大多數(shù)ESCC患者體內CDC20的mRNA水平和蛋白表達均增加，本研究結果的部分差異可能與受試者的個體差異和樣本量有關。本研究結果顯示，CDC20 mRNA高水平與ESCC不良預后和淋巴結轉移密切相關。CDC20與Ki67的表達呈正相關關系；而在胰腺導管腺癌和胃癌中，同樣顯示高CDC20的水平與不良預后有關[12]。體外實驗表明，高表達CDC20可以明顯增強ESCC細胞的增殖和遷移率，因此，以上證據(jù)支持CDC20是ESCC疾病的潛在治療靶點之一。

近年來研究表明，TOP2A被證實是一種潛在的癌癥治療生物標志物，在多種類型的癌癥表達，包括乳腺癌、肝細胞癌和神經(jīng)膠質瘤[13-14]。據(jù)報道，TOP2A參與調節(jié)細胞發(fā)育、增殖、凋亡，在細胞侵襲和細胞遷移中起關鍵作用[24]。先前的研究表明，體內立早基因（immediate early，IE）1和IE2在膠質母細胞瘤中高度表達，并增加TOP2A表達[25-26]。而且TOP2A在多種類型的癌癥中高度表達，包括乳腺癌、肝細胞癌、神經(jīng)膠質瘤，并作為這些癌癥的生物標志物[29-30]。與這些結果類似， TOP2A同樣在ESCC組織中高水平表達，CDC20的表達與ESCC不良預后和淋巴結轉移均密切相關。CDC20的表達與Ki67的表達呈正相關關系；過表達ESCC可以促進ESCC細胞遷移率。研究表明高表達TOP2A是促進ESCC發(fā)展的重要靶基因之一，是一種ESCC診斷和治療的潛在靶點。

絲氨酸/蘇氨酸激酶NEK2是一種細胞周期相關蛋白，其表達定位于中心體，可通過啟動中心體的分離而幫助細胞雙極紡錘體建立。在多種人類惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)了NEK2的過度表達，包括胃癌，口腔鱗癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌[27-28]。關于NEK2的研究已經(jīng)涉獵到惡性轉化的各個方面，包括腫瘤發(fā)生、藥物抗性和腫瘤進展。NEK2與癌癥之間的密切關系使其成為抗癌治療發(fā)展的誘人靶標[29]。研究表明，NEK2抑制劑可通過誘導細胞周期停滯和凋亡而有效抑制癌細胞的增殖，并顯著抑制體內腫瘤的生長[30，31]。本研究結果顯示NEK2在ESCC患者體內高水平表達，且NEK2與ESCC的不良預后和Ki67的表達呈正相關關系；而胃癌和口腔鱗癌中，同樣發(fā)現(xiàn)高NEK2的水平與不良預后有關[5]。本研究結果顯示高表達CDC20可以明顯增強ESCC細胞的增殖，而且促進ESCC細胞的遷移，表明NEK2可作為關鍵的腫瘤生長標志物，并支持NEK2作為ESCC疾病的潛在治療靶點。

綜上所述，CDC20和TOP2A的高表達與癌細胞浸潤程度和淋巴結轉移密切相關；CDC20、TOP2A、NEK2的高表達與ESCC的不良預后有關，三者均參與ESCC的發(fā)生和發(fā)展。單因素和多因素分析的結果表明，CDC20、TOP2A、NEK2均對預后有影響，而CDC20和TOP2A可能通過調節(jié)ESCC的生長和轉移影響預后，NEK2則通過調節(jié)ESCC的細胞周期影響腫瘤生長。因此，CDC20、TOP2A、NEK2均可作為ESCC篩查和預后的分子標志物，CDC20、TOP2A是潛在的ESCC治療靶點。