同時(shí)檢測(cè)食品中多種類真菌毒素的研究進(jìn)展

戴海蓉，梁思慧，王春民，許 茜，3*

（1 蘇州市疾病預(yù)防控制中心 江蘇蘇州 215100 2 東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 南京 210009 3 東南大學(xué) 環(huán)境與醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南京 210009）

1 食品中真菌毒素污染及危害的特點(diǎn)

真菌毒素是由真菌在適宜環(huán)境條件下產(chǎn)生的一系列有毒次生代謝產(chǎn)物，膳食是機(jī)體攝入真菌毒素的主要方式[1]。食品中檢出率較高的真菌毒素主要由曲霉菌屬（Aspergillus）、青霉菌屬（Penicillium）以及鐮刀菌屬（Fusarium）等菌屬產(chǎn)生[2]，包括黃曲霉毒素 （Aflatoxin，AFT）、赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）、雜色曲霉素（Sterigmatocystin，ST）、展青霉素（Patulin，PAT）、伏馬菌素（Fumonisin，F(xiàn)B）、玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）、嘔吐毒素（Deoxynivalenol，DON）、雪腐鐮刀菌烯醇（Nivalenol，NIV）、T-2 毒素等[3]。根據(jù)其主要產(chǎn)毒菌屬和化學(xué)結(jié)構(gòu)可對(duì)其分類，結(jié)果見表1。

大量研究表明，攝入真菌毒素可對(duì)機(jī)體產(chǎn)生免疫、生殖、肝、腎及DNA 損傷等多種毒性[19]，且在低濃度真菌毒素暴露（μg/kg 水平）即可致肝臟、腎臟和胃腸道病變，甚至可致癌、致畸、致突變等[20]。OTA、FB、DON、ZEN 和PAT 的暫定每日最大耐受量 （Provisional maximum tolerable daily intake，PMTDI）僅為17.1 ng/kg，2，1，0.5 μg/kg 和0.4 μg/kg[21-22]，這提示不能因?yàn)槠涞退降奈廴径雎云錆撛诙拘?。AFB1作為已知的化學(xué)物質(zhì)中致癌性最強(qiáng)的一種，被國際癌癥研究所（IARC）歸為1A 類致癌物[23]。OTA 和FB 均被認(rèn)定為2B 類致癌物，其它一些真菌毒素，如FUSX、CIT、DON、NIV、PAT、ZEN、T-2 和PA 等亦具有致癌性[24]。據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）報(bào)道，全球至少25%的糧食作物受到真菌毒素的污染，其中約2%失去營養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[25]，造成全球數(shù)百萬美元的經(jīng)濟(jì)損失[26]。根據(jù)2006-2016年間全球報(bào)告數(shù)據(jù)顯示，原糧中AFT、OTA、FB、DON 和ZEN 的樣本陽性率分別為55%，29%，61%，58%和46%[27]。作為以大米、小麥、玉米、花生等為主要糧食經(jīng)濟(jì)作物和食品原料的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大國，我國同樣也飽受真菌毒素污染問題的困擾[28]。除水稻、小麥、玉米、燕麥、高粱等糧食作物外[27]，大豆、油菜籽、花生等油料作物及食用油制品[6]，蘋果、柑橘、番茄等蔬果及其制品[29]，醬油、食醋、花椒等調(diào)味品[30]，啤酒、葡萄酒等發(fā)酵品[31]以及肝、腎、肌肉、乳汁及禽蛋等動(dòng)物源性食品中均廣泛存在真菌毒素的污染[7]。

如表1所示，食品中廣泛存在真菌毒素的污染，且一種食品中通常存在多種毒素共同污染[32]。Streit 等[33]對(duì)來自歐洲、美國和澳大利亞的83 份玉米、小麥、大麥和飼料樣品進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)所有樣品均被7～69 種真菌毒素或其毒性次生代謝產(chǎn)物共同污染。這是由于大多數(shù)真菌產(chǎn)毒具有非單一性的特點(diǎn)，即一種真菌能夠同時(shí)產(chǎn)生幾種真菌毒素，而同一種毒素也可由多種真菌產(chǎn)生[34]，因此多種類真菌毒素同時(shí)污染食品的情況非常普遍。當(dāng)多種真菌毒素同時(shí)存在時(shí)，常有毒性加成或協(xié)同作用而展現(xiàn)出比單一毒素更大的毒性作用[35-37]，又因大多數(shù)真菌毒素化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，對(duì)熱處理、酸處理或者紫外處理等具有不同程度的抗性[38]，普通的食品加工和制備過程無法完全破壞其毒性[39]，使真菌毒素污染食品所致的健康危害更為堪憂。

表1 常見的真菌毒素類別及其產(chǎn)毒菌屬和污染的主要食品Table 1 Classification of common mycotoxins and their toxigenic bacteria and contaminated food

面對(duì)食品中普遍存在多種類型的真菌毒素共同污染的現(xiàn)實(shí)，同時(shí)監(jiān)測(cè)其中多種類真菌毒素的污染狀況，對(duì)于及時(shí)發(fā)現(xiàn)食品安全隱患，切實(shí)保障食品安全具有重要意義。食品安全監(jiān)測(cè)的樣品數(shù)量巨大而且性質(zhì)各異，如何快速、高效地同時(shí)檢測(cè)其中的多種類真菌毒素，是實(shí)際工作面臨的主要挑戰(zhàn)。本文將從樣品前處理方法和檢測(cè)技術(shù)兩個(gè)方面介紹食品中多種類真菌毒素同時(shí)監(jiān)測(cè)的研究進(jìn)展（表2）。

2 同時(shí)提取和凈化多種真菌毒素的樣品前處理技術(shù)

食品中的真菌毒素往往以較低的含量水平（μg/kg）存在于復(fù)雜的、大量的基質(zhì)成分中，為保證分析結(jié)果的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度，必須進(jìn)行樣品前處理以凈化基質(zhì)、富集目標(biāo)物[92]。由于各種真菌毒素化學(xué)結(jié)構(gòu)不同、物理性質(zhì)各異，且在實(shí)際樣品中含量水平相差較大，因此為了同時(shí)檢測(cè)食品中的多種類真菌毒素，亟需研發(fā)同時(shí)高效提取多種類真菌毒素的前處理技術(shù)。如表2所示，目前同時(shí)提取、凈化多種真菌毒素的樣品前處理方法多為液液萃?。↙iquid-liquid extraction，LLE），固相萃?。⊿olid-phase extraction，SPE），免疫親和柱法（Immunoaffinitycolumn，IAC）和QuECHERS法（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）。

表2 同時(shí)監(jiān)測(cè)多種類真菌毒素的樣品前處理及檢測(cè)方法Table 2 Sample pretreatment and detection methods for simultaneous monitoring of multiple mycotoxins

（續(xù)表2）

（續(xù)表2）

由于絕大部分真菌毒素易溶于乙腈、甲醇等極性有機(jī)溶劑，在這些溶劑中加入少量的水，可以潤濕樣品基質(zhì)，增強(qiáng)有機(jī)溶劑在樣品中的滲透能力，有利于提高萃取效率，再加入適當(dāng)?shù)乃?，則有利于對(duì)酸敏感的真菌毒素的提取且一定程度上會(huì)降低基質(zhì)效應(yīng)。因此，常用酸化的乙腈-水或者甲醇-水溶液實(shí)現(xiàn)對(duì)多種真菌毒素的提取[93]。LLE 法常需將固體樣品制成樣品溶液[41]或者直接對(duì)母乳[40]、牛乳[42]、食用油[43]等液態(tài)樣品進(jìn)行提取，并通過低溫或者石油醚、己烷等非極性溶劑去除油脂或其它非極性雜質(zhì)。例如，針對(duì)玉米、大米、小麥樣品的甲醇-水提取液，利用三氯甲烷進(jìn)行兩次LLE處理可以凈化樣品中的基質(zhì)，實(shí)現(xiàn)AFT 和OTA 的同時(shí)富集與純化[41]。EOM 等以酸化的乙腈提取大豆油、玉米油中4 種AFT、3 種FB、OTA、ZEN、DON、T-2 等6 類共11 種真菌毒素后，使用正己烷進(jìn)行脫脂，實(shí)現(xiàn)了凈化[43]。LLE 方法雖然操作簡單，但若要同時(shí)高效提取多種真菌毒素，須對(duì)萃取劑類型及其與水的比例進(jìn)行繁復(fù)的優(yōu)化，且LLE法有機(jī)溶劑使用量大，處理單個(gè)樣品常會(huì)用到十幾毫升的有機(jī)溶劑[43]，在處理的樣品數(shù)量較大時(shí)，其不利于環(huán)保的問題更加凸顯。

分散液液微萃取 （Dispersive liquid-liquid microextraction，DLLME） 作為一種新型的LLE，具有成本低、溶劑使用量少和富集效率高等優(yōu)點(diǎn)[94]，通過分散劑的作用，萃取劑與樣品充分接觸，可以大大提高真菌毒素的提取效率，同時(shí)顯著減少有機(jī)溶劑的用量。在渦旋輔助條件下，同時(shí)提取、富集黃酒中AFT、ST、OTA、MPA 等4 類共8 種真菌毒素時(shí)僅需800 μL 萃取劑 （二氯甲烷）和866 μL 分散溶劑（乙腈）[44]。Han 等[45]采用酸輔助的DLLME 法，僅用60 μL 萃取劑（三氯苯胺）以及1 500 μL 分散劑（HCL），即可實(shí)現(xiàn)對(duì)果汁中AFT、OTA、CIT 和鏈格孢霉毒素等4 類共8 種真菌毒素的富集、凈化。DLLME 雖較LLE 在減少有機(jī)溶劑使用量方面有了進(jìn)步，但單位時(shí)間可同時(shí)處理樣品的數(shù)量，即樣品處理通量，仍有待提高。

SPE 作為一類重要的樣品前處理技術(shù)，通過固相吸附劑與目標(biāo)物或雜質(zhì)的結(jié)合，從而達(dá)到富集或凈化樣品的效果，可以結(jié)合12 位、24 位或96孔板商品化固相萃取儀，同時(shí)處理12、24 或96 個(gè)樣品，較之LLE 和DLLME 等液相萃取法，其處理樣品通量較高，可顯著提高檢測(cè)工作的效率。Deng等[95]和Li 等[96]采用96 孔SPE 法分別建立了同時(shí)凈化處理 NIV、DON、3-ACDON、15-ACDON、DON-3G、DOM-1 和ZEN、ZAN、α-ZEL、β-ZEL、α-ZAL、β-ZAL 的高通量樣品處理方法。目前在多種類真菌毒素的檢測(cè)中，SPE 法更多地是被應(yīng)用于吸附雜質(zhì)以凈化樣品，收集SPE 小柱流出液進(jìn)行后續(xù)分析，且多采用商品化的SPE 小柱。例如，C18 柱可以吸附茶葉中的基質(zhì)，用于茶葉中AFT、OTA、FB、ZEN、ST、CIT、A/B 類單端孢霉烯族毒素、鏈格孢霉毒素、恩鐮孢霉毒素等10 類共42 種真菌毒素多殘留的凈化[82]，以極性、非極性及離子交換樹脂等作為復(fù)合吸附材料的Myco Sep 226多功能凈化柱可用于花生油和玉米油中AFT、ZEN、FB、A/B 類單端孢霉烯族毒素等5 類共13種真菌毒素的同時(shí)凈化[48]。Oasis PRi ME HLB 柱可以吸附液態(tài)乳樣品溶液中的干擾物，使真菌毒素與樣品基質(zhì)分離，直接收集流出液即可對(duì)其中的AFT、OTA、FB、ZEN、ST、CIT、A/B 類單端孢霉烯族毒素等8 類共14 種真菌毒素進(jìn)行檢測(cè)，使用時(shí)無需進(jìn)行SPE 柱的活化和平衡，樣品溶液經(jīng)過該柱后亦無需淋洗，大大簡化了樣品處理過程[46]。王蒙等[49]將親水親脂平衡（Hydrophilic-lipophilic balanced，HLB）與混合模式陽離子交換（Mixedmode cationic exchange，MCX）2 種填料混合作為吸附填料自制了SPE 柱，實(shí)現(xiàn)了對(duì)果蔬樣品基質(zhì)中干擾物的有效吸附，建立了同時(shí)凈化并檢測(cè)包括OTA、CIT 和鏈格孢霉毒素等在內(nèi)的共5 類真菌毒素的方法。

采用SPE 法亦可吸附并富集食品中的真菌毒素，Mccullum 等[97]研制的聚多巴胺涂層的Fe3O4納米顆粒和Dong 等[98]研制的多壁碳納米管能分別吸附AFT 或A 類單端孢霉烯族毒素等真菌毒素。涂覆有雙層SiO2的Fe3O4納米顆粒[52]和氨基修飾的磁性多壁碳納米管[53]均可以作為有效的真菌毒素吸附劑，分別可以實(shí)現(xiàn)對(duì)植物油中FB1、ZEN 和OTA[52]以及小麥中AFB1 和ZEN[53]的同時(shí)富集，且這些磁性吸附劑與傳統(tǒng)的C18和N-丙基乙二胺（Primary secondary amine，PSA） 吸附劑相比，不僅提高了目標(biāo)物的富集效率，還可利用磁性實(shí)現(xiàn)固液兩相的快速分離，縮短了樣品預(yù)處理時(shí)間。然而，由于各類真菌毒素結(jié)構(gòu)和性質(zhì)各不相同，目前的SPE 法仍存在對(duì)部分類別的真菌毒素吸附作用較弱、回收率低的問題。吸附劑作為SPE 技術(shù)的核心，可以對(duì)其進(jìn)行多種功能化修飾，使其可依據(jù)疏水作用、π-π 鍵作用、靜電力、氫鍵等不同的作用機(jī)理實(shí)現(xiàn)對(duì)多種真菌毒素的同時(shí)高效吸附。

QuECHERS 法是在多種真菌毒素同時(shí)檢測(cè)中應(yīng)用較為廣泛的樣品前處理方法。該方法是一種將提取與凈化結(jié)合的快速樣品前處理方法，它通過乙腈對(duì)樣品進(jìn)行提取后，向提取液中添加無機(jī)鹽，使水相和有機(jī)相鹽析分層，隨后向其添加吸附劑結(jié)合雜質(zhì)，從而達(dá)到凈化、富集目的，類似于LLE 與SPE 的結(jié)合使用。該法最初多用于農(nóng)藥分析，對(duì)試劑類型、用量和比例進(jìn)行優(yōu)化后在多種真菌毒素的同時(shí)提取、凈化中的應(yīng)用日益廣泛[99]。在應(yīng)用于真菌毒素的提取、凈化時(shí)，通常在乙腈中添加適量酸，以使含較多羧酸基團(tuán)的OTA 和FBs 保持其分子形式，更易于提取，從而保證較高的回收率[100]；隨后加入無水硫酸鎂去除有機(jī)相中的水分，加入氯化鈉促使各種真菌毒素進(jìn)入有機(jī)相而將基質(zhì)干擾物保留在水層，最后利用C18、PSA 或石墨化碳黑（Graphitized carbon black，GCB）等吸附劑除去有機(jī)相中的糖、脂質(zhì)、有機(jī)酸和色素等，進(jìn)一步達(dá)到凈化的目的。Colli 等[58]利用QuECHERS法在同時(shí)提取、凈化燕麥樣品中的AFT、OTA、ST、PAT、FB、ZEN、鏈格孢霉毒素、A/B 類單端孢霉烯族毒素和恩鐮孢霉毒素等10 類共42 種真菌毒素時(shí)結(jié)合了機(jī)械輔助，通過實(shí)現(xiàn)震蕩步驟的自動(dòng)化提高了工作效率，可使每人每日分析樣品數(shù)達(dá)60～70 個(gè)。

QuECHERS 法仍存在一定的局限性，如其常用的吸附劑中，PSA 易吸收FB1和FB2等酸性真菌毒素，而GCB 則易于吸附具有平面結(jié)構(gòu)的真菌毒素，例如AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和ST，造成對(duì)這些目標(biāo)物的回收率較低，不利于靈敏檢測(cè)[58，101]，無法完全適用于嬰幼兒食品等真菌毒素限量要求較嚴(yán)格的樣品分析[102]。QuECHERS 與其它方法聯(lián)合使用，或可更好地達(dá)到同時(shí)富集、凈化多種類別真菌毒素的目 的。Bessaire 等[59]將QuECHERS 法與免疫親和柱法（Immunoaffinity column，IAC）聯(lián)合使用，可對(duì)食品中AFT、OTA、ZEN、FB、A/B 類單端孢霉烯族毒素等6 類共12 種真菌毒素進(jìn)行多殘留分析，方法靈敏度滿足可對(duì)嬰幼兒食品安全檢測(cè)的要求。

IAC 法基于抗原抗體特異性結(jié)合原理，通過在IAC 柱中填充鍵合了真菌毒素特異性抗體的填料，當(dāng)樣品提取液通過色譜柱時(shí)，其中的真菌毒素即與填料上鍵合的抗體特異性結(jié)合而被富集，并與樣品基質(zhì)分離。串聯(lián)IAC 將多個(gè)單克隆抗體IAC 柱連接使用，復(fù)合IAC 則將多種真菌毒素單克隆抗體共同鍵合在填料上，制成多抗體免疫親和柱，兩者均能實(shí)現(xiàn)對(duì)多種真菌毒素的同時(shí)凈化與富集，改善了傳統(tǒng)IAC 只能提取單一真菌毒素的局限，展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景[61]。通過串聯(lián)使用IAC，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)糧食樣品中OTA 和ZEN[103]以及谷物、動(dòng)物飼料和嬰兒食品中AFT、OTA、FB、ZEN、A/B 類單端孢霉烯族毒素等6 類共11 種真菌毒素的同時(shí)凈化與富集[62]。IAC 與SPE 的聯(lián)合使用可實(shí)現(xiàn)茶葉中AFT、OTA、ZEN、FB、A/B 類單端孢霉烯族毒素等6 類共10 種真菌毒素的同時(shí)凈化，有效減少了雜質(zhì)的干擾[61]。此外，Zhang 等[60]利用聚苯乙烯-二乙烯基苯作為抗氧化劑，制備了含有ZEN，DON，T-2 和HT-2 4 種毒素抗體的復(fù)合IAC 柱，用于面粉樣品的前處理。IAC 法對(duì)目標(biāo)物分離純化時(shí)具有高特異性、高富集程度的優(yōu)點(diǎn)，可以高選擇性地去除樣品基質(zhì)中的干擾物，也是我國現(xiàn)行的各種行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、地方標(biāo)準(zhǔn)和國家標(biāo)準(zhǔn)中多采用的方法（如表3所示）。然而，IAC 柱在使用時(shí)需多次淋洗及洗脫，過程中還需控制流速，較為繁瑣、費(fèi)時(shí)，試劑消耗也較多。為實(shí)現(xiàn)多種類的真菌毒素同時(shí)提取，需要在填料上固定不同類型的抗體，導(dǎo)致IAC 柱的制備成本較高，且使用期限短，保存條件要求高，這些都限制了IAC 法的廣泛應(yīng)用。

3 同時(shí)檢測(cè)多種類真菌毒素的方法

如表3所示，目前可實(shí)現(xiàn)多種類真菌毒素同時(shí)檢測(cè)的方法主要分為2 類：免疫分析法和色譜法。

3.1 免疫學(xué)分析法

免疫學(xué)分析法常使用膠體金、量子點(diǎn)、酶和熒光素等標(biāo)記抗體或抗原，通過抗原抗體特異性結(jié)合后產(chǎn)生熒光強(qiáng)度的改變對(duì)真菌毒素進(jìn)行檢測(cè)。曹德康等[66]通過將3 種膠體金試紙條組裝成三聯(lián)檢測(cè)卡實(shí)現(xiàn)了對(duì)谷物中AFB1、ZEN、DON 的同時(shí)檢測(cè)。在檢測(cè)多種目標(biāo)分析物時(shí)，若使用單色標(biāo)記的免疫層析試紙會(huì)出現(xiàn)多個(gè)相同顏色的條帶不易分辯的問題，Duan 等[67]基于微乳液技術(shù)，以不同比例將兩種發(fā)射波長分別為575 nm 和615 nm 的CdSe/ZnS 量子點(diǎn)進(jìn)行封裝，合成了3 種不同顏色的量子點(diǎn) （黃綠、橙色和紅色），并將其分別與ZEN、OTA、FB1單克隆抗體偶聯(lián)，采用量子點(diǎn)熒光免疫法實(shí)現(xiàn)了玉米中ZEN、OTA、FB1的同時(shí)檢測(cè)。此外，通過在生物芯片上固定酶標(biāo)記的真菌毒素特異性抗體，當(dāng)真菌毒素與酶競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體時(shí)導(dǎo)致熒光信號(hào)發(fā)生改變，也可實(shí)現(xiàn)多種真菌毒素的同時(shí)檢測(cè)[68]，目前已被應(yīng)用于水中AFB1、AFM1、DON、OTA、T-2、ZEN 的檢測(cè)[69]以及飼料中AFB1、AFG1、FB1、OTA、DON、T-2、ZEN 的半定量篩查[71]。

基于免疫學(xué)原理的檢測(cè)法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，因此樣品前處理較為簡單，僅需將樣品經(jīng)有機(jī)試劑提取后，經(jīng)離心、稀釋即可直接進(jìn)行檢測(cè)，無需進(jìn)一步的凈化過程（見表2）。然而，該法存在著僅可定性或半定量分析的局限性，且因真菌毒素相對(duì)分子質(zhì)量低且僅含單個(gè)抗原決定簇，屬于半抗原，其抗原性較弱，使得制備抗體的成本較高。

3.2 色譜法

高效液相色譜法 （High performance liquid chromatography，HPLC）作為一種分離方法，常常配備熒光檢測(cè)器（Fluorescence detector，F(xiàn)LD）進(jìn)行AFT、OTA 等自身具有熒光基團(tuán)的真菌毒素的檢測(cè)[104]，我國現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)即多用HPLC-FLD 檢測(cè)食品中的AFT（見表3）。一些真菌毒素自身不具有熒光基團(tuán)（如FB），或在進(jìn)行反相色譜分離過程中會(huì)發(fā)生熒光猝滅（如AFT、OTA 等），常使用柱前或柱后衍生使其生成有熒光的衍生物，從而提高檢測(cè)靈敏度[105]。傳統(tǒng)的化學(xué)柱前或柱后衍生化法常需要用到有毒和腐蝕性的化學(xué)試劑，需要額外的泵和檢測(cè)池，且形成的衍生物可能會(huì)造成干擾。光化學(xué)衍生法利用紫外光輻射對(duì)真菌毒素進(jìn)行衍生化，可克服這些缺點(diǎn)。Irakli 等[75]在HPLC 柱后連接光化學(xué)反應(yīng)器進(jìn)行光化學(xué)衍生后，以FLD 同時(shí)檢測(cè)了麥麩中的AFT、DON、OTA 和ZEN。Lee 等[106]也應(yīng)用光化學(xué)衍生來增強(qiáng)飼料中的AF、OTA 和ZEN 熒光。然而，由于可采用化學(xué)或光化學(xué)方法進(jìn)行熒光衍生的真菌毒素種類較少，因此HPLCFLD 的應(yīng)用也比較有限。

表3 我國對(duì)多種真菌毒素同時(shí)檢測(cè)的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Current standards for simultaneous detection of multiple mycotoxins in China

（續(xù)表3）

色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法結(jié)合了色譜高效的分離能力和質(zhì)譜優(yōu)越的檢測(cè)能力，在真菌毒素檢測(cè)方面得以廣泛應(yīng)用。氣相色譜-質(zhì)譜法 （Gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS）可定量檢測(cè)揮發(fā)性的真菌毒素，如玉米赤霉烯酮類、A/B 類單端孢霉烯族類真菌毒素[84]。然而，由于大部分真菌毒素沸點(diǎn)較高，揮發(fā)性較弱，極性較強(qiáng)，因此在GC-MS 檢測(cè)時(shí)常需要先進(jìn)行衍生化，將真菌毒素轉(zhuǎn)化為更具揮發(fā)性，極性較小且熱穩(wěn)定的衍生物[107]。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLCMS/MS）不受真菌毒素?fù)]發(fā)性和熱穩(wěn)定性的制約，兼之得益于高分辨二級(jí)質(zhì)譜強(qiáng)大的定性及定量檢測(cè)能力，僅需以有機(jī)試劑對(duì)樣品進(jìn)行簡單的提取，經(jīng)稀釋后即可進(jìn)行定性、定量分析，甚至可以進(jìn)行多組分非靶標(biāo)性鑒定，成為目前同時(shí)檢測(cè)多種類真菌毒素的主流方法，其中三重四極桿（Triple quadrupole，QQQ）和四極桿串聯(lián)高分辨率的飛行時(shí)間（Quadrupole-time of flight，QTOF）檢測(cè)器被廣泛使用。研究者們通過對(duì)啤酒樣品進(jìn)行QuECHERS 處理去除糖、色素或有機(jī)酸等多種雜質(zhì)后，采用UPLC-MS/MS（QQQ）對(duì)啤酒中AFT、ZEN、FB、OTA、A/B 型單端孢霉烯族毒素以及恩鐮孢霉毒素等7 類共23 種真菌毒素進(jìn)行同時(shí)定性和定量分析[76]，采用UPLC-MS/MS（QTOF）實(shí)現(xiàn)了飼料[78]和小麥[80]中真菌毒素多目標(biāo)、非靶標(biāo)性的測(cè)定。HPLC-MS/MS 和UPLC-MS/MS 已然成為同時(shí)高效檢測(cè)目前食品中多種類真菌毒素的主流方法。

3.3 實(shí)時(shí)直接分析（DART）技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)的聯(lián)用

實(shí)時(shí)直接分析（Direct analysis in real time，DART）是2005年由Cody 教授等[78]發(fā)明的非表面接觸的熱解吸和離子化技術(shù)，是目前商品化最為成功的新型原位電離技術(shù)之一，與高分辨率質(zhì)譜儀結(jié)合后形成的DART-MS 法具備快速、實(shí)時(shí)、直接分析的能力。不同于色譜-質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)，DART-MS 技術(shù)不需要前端的色譜分離過程，樣品中的目標(biāo)物分子可直接由DART 離子源在常壓下電離后即刻進(jìn)行MS 分析。該方法尤其適于多個(gè)目標(biāo)物的同時(shí)檢測(cè)，具有近乎實(shí)時(shí)的高通量檢測(cè)的特點(diǎn)[108]。DART-MS 已被應(yīng)用于各種食品樣品中違禁藥品、活性成分、獸藥、農(nóng)藥的高通量篩查，近年也開始用于食品中真菌毒素的檢測(cè)，然而，在多種類真菌毒素同時(shí)檢測(cè)方面還少見報(bào)道[109-110]，目前僅見Vaclavik 等[91]將DART 與超高分辨力Orbitrap MS 結(jié)合，嘗試對(duì)小麥和玉米中多種真菌毒素進(jìn)行檢測(cè)。采用QuECHERS 法對(duì)目標(biāo)物提取、凈化后，評(píng)估了DART 技術(shù)對(duì)真菌毒素的電離效率，發(fā)現(xiàn)T-2、HT-2、AFB1、AFM1等電離較弱，極性較大的FB、OTA、DON-3G 和麥角生物堿較難電離，致使MS 在檢測(cè)這些目標(biāo)物時(shí)靈敏度不夠、或不可行，推測(cè)DART 電離效率可能會(huì)受真菌毒素的極性和分子質(zhì)量等影響，最終以DART-MS法對(duì)11 種電離效率高的真菌毒素（DON、NIV、ZEN、3-ACDON、DOM-1、FUSX、ALT、AOH、AOHCH3、DAS 和ST）進(jìn)行快速定量分析。在此研究的基礎(chǔ)上，Busman 等[111-113]優(yōu)化了DART 使用時(shí)分析物板和氦等離子體發(fā)射器的位置、電離氣體溫度、氦等離子體發(fā)射器的柵極電壓等參數(shù)后，提高了DART 對(duì)AFB1、T-2 和HT-2、AFM1的電離效率，并將建立的DART-MS 方法應(yīng)用于玉米、牛奶等實(shí)際樣品的檢測(cè)。若在提高真菌毒素的電離效率方面有更大突破，DART-MS 將具有很大的應(yīng)用潛力。

4 總結(jié)與展望

食品中廣泛存在多種類真菌毒素的共同污染，必須高效、快速地進(jìn)行多種真菌毒素的同時(shí)檢測(cè)，以全面、準(zhǔn)確地評(píng)估健康風(fēng)險(xiǎn)。目前的免疫學(xué)方法已不再局限于單一真菌毒素的檢測(cè)，可以做到多達(dá)6 個(gè)種類真菌毒素的同時(shí)檢測(cè)。UPLC 和HPLC-MS/MS 成為食品中真菌毒素多殘留分析應(yīng)用最廣泛的技術(shù)，在高分辨率質(zhì)譜的發(fā)展帶動(dòng)下，已可對(duì)痕量水平的多種真菌毒素進(jìn)行同時(shí)定性與定量檢測(cè)，甚至可以在無需標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的情況下進(jìn)行非靶標(biāo)性測(cè)定，展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，成為食品中多種真菌毒素同時(shí)檢測(cè)的主流方法。發(fā)展DARTMS 等新型高通量檢測(cè)技術(shù)在食品中多種類真菌毒素檢測(cè)中的應(yīng)用，具有重要的意義。

研發(fā)能同時(shí)提取多種類型真菌毒素的樣品預(yù)處理技術(shù)仍然是瓶頸問題，常用的LLE 法、SPE法、QuEChERS 法、IAC 法等仍存在使用有機(jī)溶劑過多、多種真菌毒素共存時(shí)不能完全吸附或抗體制備成本高等局限性。此外，針對(duì)不同樣品基質(zhì)常需要各種不同處理方法，然而，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)和檢測(cè)方法適用的樣品范圍較為單一。面對(duì)檢測(cè)樣品數(shù)量巨大、樣品類型繁多的現(xiàn)實(shí)情況，亟待研發(fā)適用于各類食品的、可同時(shí)高效凈化、富集不同目標(biāo)物的預(yù)處理新技術(shù)，結(jié)合后續(xù)的高通量分析方法，方可真正實(shí)現(xiàn)食品中多種類真菌毒素的高效、高通量檢測(cè)。