植物乳桿菌NCU137培養(yǎng)基成分與培養(yǎng)條件的優(yōu)化

孫雨佳，黃 輝，劉長根，熊 濤

（南昌大學食品學院 南昌 330031）

植物乳桿菌是乳酸菌之一，屬于主導腸道微生物區(qū)系的厚壁菌門，廣泛分布于蔬菜、發(fā)酵食品和健康人體腸道黏膜等生態(tài)環(huán)境中[1]。植物乳桿菌不僅具有降低膽固醇[2]，調(diào)節(jié)免疫力[3]，預防癌癥[4]，治療腸易激綜合癥[5]及高血壓[6]等作用，也是生產(chǎn)細菌素的重要菌種之一[7-9]。

植物乳桿菌NCU137 是一株來自桑葚果漿中的優(yōu)良菌株，不僅具有耐酸、耐膽鹽、耐高滲、抑菌等良好的生物學特性，而且在果蔬發(fā)酵中得到很好的應用。蘇能能等[10]用植物乳桿菌NCU137 發(fā)酵桑葚，發(fā)酵后的桑葚營養(yǎng)和香氣物質(zhì)種類增加，抑菌性能和穩(wěn)定性均顯著提高；Yin 等[11]用植物乳桿菌NCU137 發(fā)酵薏苡仁，顯著降低了有害物質(zhì)2-戊基呋喃的含量，增加了可溶性膳食纖維的含量，得到了感官品質(zhì)更好的產(chǎn)品；程浩等[12]用植物乳桿菌NCU137 發(fā)酵枸杞，并對其進行噴霧干燥制成粉末，得到的產(chǎn)品香氣濃郁，口感細膩，穩(wěn)定性高。然而，作為一種具有廣闊應用前景的果蔬發(fā)酵劑，植物乳桿菌NCU137 高密度培養(yǎng)的研究尚未見報道，亟需開展植物乳桿菌NCU137 高密度培養(yǎng)技術(shù)的相關(guān)研究。

本文以植物乳桿菌NCU137 為研究對象，以MRS 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，活菌數(shù)作為指標，通過對培養(yǎng)基成分和靜態(tài)培養(yǎng)條件的單因素實驗、Plackett-Burman、最陡爬坡及中心組合等試驗，確定最佳培養(yǎng)基成分與培養(yǎng)條件，為果蔬高活性菌劑制備奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌NCU137，保藏于南昌大學食品科學與技術(shù)國家重點實驗室植物基發(fā)酵益生菌資源庫。

葡萄糖，上海豪申化學試劑有限公司；蛋白胨、牛肉粉、酵母粉，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；磷酸氫二鉀，天津市大茂化學試劑廠；檸檬酸三銨，天津市永大化學試劑有限公司；硫酸鎂，上海市青析化工科技有限公司；無水乙酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鉀、七水合硫酸亞鐵、CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O、可溶性淀粉、海藻糖、乳清粉、胰蛋白胨、尿素、硫酸銨、硝酸銨，西隴化工股份有限公司；吐溫80，上海市青析化工科技有限公司；MnSO4·H2O、MgSO4·7H2O，廣東汕頭市西隴化工廠；PBS 緩沖液、麥芽糖、蔗糖、乳糖、果糖、甘露醇、菊粉、大豆蛋白胨、魚蛋白胨、酪蛋白胨、苯丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、鳥嘌呤、尿嘧啶、VB1、VB2、VB5、VC、VE，北京Solarbio 科技有限公司；麥芽糖漿、果葡糖漿、葡萄糖漿，浙江華康藥業(yè)股份有限公司；谷氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、腺嘌呤、胸腺嘧啶，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甘氨酸，國藥集團化學試劑有限公司；VB6，上海展云化工有限公司。所用試劑均由南昌大學食品科學與技術(shù)國家重點實驗室提供。

1.2 儀器與設(shè)備

JA2003N 電子天平，上海精密科學儀器有限公司；MLS-3751L-PC 高壓蒸汽滅菌鍋，松下健康醫(yī)療器械株式會社；CJ-1680 超凈工作臺，蘇州市凈化設(shè)備有限公司；DNP-9272 型生化培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；KLF 3.7 L 小型發(fā)酵罐，瑞士比歐生物工程公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化 植物乳桿菌NCU137 菌株用脫脂乳冷凍保藏在凍干管中（-80 ℃），每次試驗前取適量菌粉于MRS 液體培養(yǎng)基中活化兩次后劃線，生長24～48 h 后挑取單菌落接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，傳代兩次后進行后續(xù)試驗。

1.3.2 單因素實驗

1.3.2.1 碳源 以MRS 為基礎(chǔ)，分別以2%的麥芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、海藻糖、甘露醇、菊粉、可溶性淀粉、果葡糖漿、麥芽糖漿、葡萄糖漿代替培養(yǎng)基中的葡萄糖為碳源進行單因素實驗。確定碳源后，分別以質(zhì)量濃度為10，15，20，25，30，35，40 g/L 的碳源進行單因素實驗。

1.3.2.2 氮源 在上一步實驗基礎(chǔ)上，分別以25 g/L 蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸粉、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨、魚蛋白胨、尿素、（NH4）2SO4、NaNO3、代替MRS 中的氮源進行單因素實驗。根據(jù)實驗結(jié)果，對氮源復配（表1）復配并確定最佳氮源的復配比例。之后，分別加入質(zhì)量濃度為10，15，20，25，30，35，40，45，50 g/L 的復合氮源進行單因素實驗。

表1 不同氮源的復配比例Table 1 The composition ratio of different nitrogen sources

1.3.2.3 微量元素 在上一步實驗基礎(chǔ)上，分別加入不同種類、不同質(zhì)量濃度的微量元素（FeSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、Mg-SO4·7H2O）進行單因素實驗。

1.3.2.4 生長因子 加入氨基酸類（谷氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、酪氨酸、天冬氨酸）、核苷酸類（腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、尿嘧啶）、維生素類（VB1、VB2、VB5、VB6、VC、VE）等生長因子進行單因素實驗。

1.3.3 Plackett-Burman 試驗設(shè)計 以碳源、氮源、微量元素、生長因子、吐溫-80 等因素為考察對象，采用Plackett-Burman 試驗設(shè)計，以植物乳桿菌NCU137 的活菌數(shù)為響應值，篩選出對植物乳桿菌NCU137 生長具有顯著影響的因子。

1.3.4 最陡爬坡試驗設(shè)計 根據(jù)Plackett-Burman試驗設(shè)計得到的回歸系數(shù)，確定顯著影響因子的最陡爬坡試驗的方向和梯度，從而獲得中心組合試驗因素的中心點。

1.3.5 中心組合試驗設(shè)計 根據(jù)Plackett-Burman試驗和最陡爬坡試驗確定的試驗因素和中心點，采用Design-Expert 軟件進行響應面優(yōu)化，以獲得響應變量與各因素變量關(guān)系的二次多項回歸擬合方程。根據(jù)方程計算得到植物乳桿菌NCU137 最佳增殖培養(yǎng)基配方。

1.3.6 靜態(tài)培養(yǎng)條件的優(yōu)化 以不同初始pH值、接種量、溫度進行單因素實驗，根據(jù)實驗結(jié)果以活菌數(shù)為指標進行L9（34）正交試驗（表2），確定最佳靜態(tài)培養(yǎng)條件。

表2 正交試驗因素及水平設(shè)計Table 2 The design levels and factors of orthogonalexperimental

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 軟件進行響應面試驗設(shè)計與分析，采用SPSS 25.0 進行差異性分析，采用Origin 2018 進行圖形的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 碳源對植物乳桿菌NCU137 活菌數(shù)的影響 碳源是微生物生長必不可少的條件之一，它可以調(diào)節(jié)微生物的生長代謝及胞內(nèi)生物活性[13]。由圖1和2 可知，麥芽糖促進植物乳桿菌NCU137生長效果最顯著，且隨著麥芽糖添加量的增加，活菌數(shù)呈先上升后下降的趨勢，在添加量為25 g/L時達到最高。綜上，最優(yōu)碳源添加量為麥芽糖25 g/L。

圖1 不同碳源對植物乳桿菌NCU137 活菌數(shù)的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on viable count of L.plantarum NCU137

2.1.2 氮源對植物乳桿菌NCU137 活菌數(shù)的影響 由圖3可知，魚蛋白胨、酵母浸粉、大豆蛋白胨作為氮源活菌數(shù)均較高，而與MRS 培養(yǎng)基中復配氮源相比活菌數(shù)略有降低。綜上，選擇魚蛋白胨、酵母浸粉、大豆蛋白胨3 種氮源進行復配（表1），并對結(jié)果進行方差分析。

圖3 不同氮源對植物乳桿菌NCU137 活菌數(shù)的影響Fig.3 The effects of different nitrogen sources on viable count of L.plantarum NCU137

由圖4和5 可知，以15 g/L 的酵母浸粉和10 g/L 的大豆蛋白胨作為復配氮源時，活菌數(shù)最高。隨著氮源添加量的升高，活菌數(shù)呈先上升后下降的趨勢，當添加量為40 g/L 時達到最高，然而，與氮源添加量為35 g/L 相比，活菌數(shù)無顯著性差異，從成本上考慮選擇35 g/L 的添加量，既最優(yōu)氮源：酵母浸粉21 g/L，大豆蛋白胨14 g/L。

圖2 不同麥芽糖質(zhì)量濃度對植物乳桿菌NCU137活菌數(shù)的影響Fig.2 The effects of different maltose mass concentrations on viable count of L.plantarum NCU137

圖4 不同復配氮源對植物乳桿菌NCU137活菌數(shù)的影響Fig.4 Effects of different mixed nitrogen sources on viable count of L.plantarum NCU137

2.1.3 微量元素對植物乳桿菌NCU137 活菌數(shù)的影響 微量元素是一類量極微卻對微生物生長有促進作用的元素，也是某些活性物質(zhì)的組成成分或者酶的激活劑[14]。由圖6可知，添加Cu2+、Fe2+、Zn2+對植物乳桿菌NCU137 的生長沒有促進作用，而Mg2+和Mn2+對植物乳桿菌NCU137 的生長有明顯的促進作用。當MgSO4·7H2O 和MnSO4·H2O 分別為0.15 g/L 和0.06 g/L 時活菌數(shù)達到最高，因此選擇其作為微量元素最優(yōu)添加量。

圖5 不同氮源質(zhì)量濃度對植物乳桿菌NCU137活菌數(shù)的影響Fig.5 The influence of different nitrogen mass concentrations on viable count of L.plantarum NCU137

圖6 不同質(zhì)量濃度Cu2+、Fe2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+對植物乳桿菌NCU137 活菌數(shù)的影響Fig.6 The effects of different mass concentrations of Cu2+，F(xiàn)e2+，Zn2+，Mg2+ and Mn2+on viable countof L.plantarum NCU137

2.1.4 生長因子對植物乳桿菌NCU137 活菌數(shù)的影響 生長因子是一類調(diào)節(jié)微生物正常生長代謝所必需的物質(zhì)[15]。由圖7可知，氨基酸類物質(zhì)中苯丙氨酸對植物乳桿菌NCU137 的生長具有顯著的促進作用，核苷酸類物質(zhì)中腺嘌呤增菌效果顯著，維生素類物質(zhì)對植物乳桿菌NCU137 生長的均無顯著促進作用，甚至添加VB1、VE 等維生素會抑制植物乳桿菌NCU137 的生長。由圖8可知，苯丙氨酸和腺嘌呤的最佳添加量分別為0.04 g/L 和0.10 g/L。

圖7 不同生長因子對植物乳桿菌NCU137活菌數(shù)的影響Fig.7 The effects of growth factors on the viable count of L.plantarum NCU137

圖8 不同苯丙氨酸和腺嘌呤質(zhì)量濃度對植物乳桿菌NCU137 活菌數(shù)的影響Fig.8 The effects of different mass concentrations of phenylalanine and adenine on viable count of L.plantarum NCU137

2.2 Plackett-Burman 試驗篩選顯著影響因子

Plackett-Burman 試驗設(shè)計及結(jié)果如表3所示。以麥芽糖（A）、酵母浸粉（B）、大豆蛋白胨（C）、MgSO4·7H2O（D）、MnSO4·H2O（E）、苯丙氨酸（F）、腺嘌呤（G）、吐溫-80（H）添加量作為Plackett-Burman 試驗的因素及3 個虛擬因素 （J、K、L），根據(jù)結(jié)果篩選出對植物乳桿菌NCU137 活菌數(shù)有顯著影響的因素。

表3 Plackett-Burman 試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Plackett-Burman experiment design and results

由表4可得模型顯著（P<0.05），相關(guān)系數(shù)R2=0.9633，說明相關(guān)性較好，且麥芽糖、大豆蛋白胨、苯丙氨酸3 個因素為顯著因素（P<0.05），其余因素為非顯著因素。根據(jù)Design Expert 軟件預測，非顯著因素的優(yōu)化結(jié)果為：酵母浸粉21.8 g/L、MnSO4·H2O 0.06 g/L、MgSO4·7H2O 0.15 g/L、腺嘌呤0.13 g/L、吐溫-80 1 mL/L。

2.3 最陡爬坡試驗

由表4可知，大豆蛋白胨響應值為正值，其最陡爬坡試驗值隨試驗編號的增加而增加，相應的，麥芽糖和苯丙氨酸響應值為負值，其最陡爬坡試驗值隨試驗編號的增加而減少。由表5可知，試驗號3 號活菌數(shù)最高，既最陡爬坡試驗拐點，因此選擇第3 組數(shù)據(jù)作為后續(xù)中心組合試驗設(shè)計的中心點。

表4 Plackett-Burman 試驗方差分析Table 4 Variance analysis of Plackett-Burman design

表5 最陡爬坡試驗及其結(jié)果Table 5 Steepest climb design with experimental results

2.4 中心組合試驗

根據(jù)Plackett-Burman 試驗和最陡爬坡試驗結(jié)果，以活菌數(shù)為響應值，選取麥芽糖、大豆蛋白胨和苯丙氨酸添加量3 個因素進行響應面中心組合試驗（表6），試驗設(shè)計和結(jié)果如表7、8 所示。

表6 中心組合設(shè)計因子水平表Table 6 Level table of central composite design factors

表7 中心組合試驗設(shè)計結(jié)果Table 7 Results of central combination test design

通過軟件Design-Expert 8.0.6 對試驗結(jié)果進行二次多元擬合，得到的方程為Y=6.479×109-3.707 ×107A +7.122 ×107C +7.971 ×107F +1.019 ×107AC-1.681×108AF-5.562×106CF-2.052×108A2-2.194×108C2-1.169×108F2。

由表8可知：F、AF、A2、C2影響極顯著（P＜0.01），C 和F2影響顯著（P＜0.05）；模型效應極顯著（P＜0.01）；失擬項不顯著（P＞0.05）。模型R2=0.9549，說明該方程與實際情況擬合良好。

表8 響應面二次模型方差分析結(jié)果Table 8 ANOVA for response surface quadratic model

依據(jù)以上回歸模型，得到麥芽糖與大豆蛋白胨、麥芽糖與苯丙氨酸、大豆蛋白胨與苯丙氨酸的交互作用圖。由圖9～11 可知，等高線圖呈橢圓形，均存在極點，說明兩者之間交互作用顯著，與二次模型方差分析結(jié)果一致。根據(jù)回歸模型，得出最優(yōu)麥芽糖添加量為26.73 g/L，大豆蛋白胨添加量為16.59 g/L，苯丙氨酸添加量為0.051 g/L，此時預測活菌數(shù)為7.0126×109CFU/mL。在此條件下進行驗證試驗，此時活菌數(shù)為6.95×109CFU/mL，與模型預測值擬合率為99.0%，說明該模型能夠較好地預測培養(yǎng)基組成對活菌數(shù)的影響。

圖9 麥芽糖和大豆蛋白胨交互作用響應面圖Fig.9 Response surface map of interaction between maltose and soybean peptone

圖10 大豆蛋白胨和苯丙氨酸交互作用響應面圖Fig.10 Response surface map of interaction between soybean peptone and phenylalanine

圖11 麥芽糖和苯丙氨酸交互作用響應面圖Fig.11 Response surface map of interaction between maltose and phenylalanine

2.5 初始pH 值、接種量與溫度對活菌數(shù)的影響

2.5.1 單因素實驗 合適的初始pH 值可以使細胞膜脂肪酸不飽和度增加，從而細胞膜流動性增加，保持較好的細胞膜完整性[16]。接種量的大小會影響整個發(fā)酵過程，接種量過大時將會導致溶解氧快速耗盡，從而抑制菌株的快速生長與代謝產(chǎn)物的生成[17]。溫度可一定程度上影響細胞中的酶、蛋白質(zhì)、DNA、RNA 等大分子的合成與活性[18]。植物乳桿菌NCU137 靜態(tài)培養(yǎng)條件試驗結(jié)果如圖12所示，調(diào)整優(yōu)化培養(yǎng)基初始pH 值分別為5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，隨著初始pH 值的上升，植物乳桿菌NCU137 活菌數(shù)呈先上升后下降的趨勢，在初始pH 為7.0 時活菌數(shù)達到最高。對植物乳桿菌NCU137 接種量分析表明，接種量在1%～3%范圍內(nèi)時，隨著接種量的增加活菌數(shù)升高，當接種量超過3%后，活菌數(shù)開始下降。由此得最適初始pH值為7.0，接種量為3%。改變培養(yǎng)溫度時，植物乳桿菌NCU137 活菌數(shù)呈先上升后下降的趨勢，發(fā)現(xiàn)在45 ℃培養(yǎng)時植物乳桿菌NCU137 活菌數(shù)降低，表明培養(yǎng)溫度過高不利于菌株生長并導致其死亡，培養(yǎng)溫度30 ℃和25 ℃時活菌數(shù)無顯著性差異，達8.5×109CFU/mL，顯著高于在37 ℃下培養(yǎng)的活菌數(shù)。

圖12 初始pH 值、接種量與溫度對植物乳桿菌NCU137 活菌數(shù)的影響Fig.12 Effects of initial pH value，inoculation amount and culture temperature on viable count of L.plantarum NCU137

2.5.2 正交試驗 由表9結(jié)果可知，影響活菌數(shù)的主次因素為：溫度>初始pH 值>接種量。試驗結(jié)果確定出的最佳培養(yǎng)條件為：M2N3O2，即接種量3%，初始pH 7.0，溫度30 ℃，此時活菌數(shù)為9.2×109CFU/mL。

表9 培養(yǎng)條件正交試驗結(jié)果Table 9 L9（34） orthogonal array design and results

3 結(jié)論

本研究通過對植物乳桿菌NCU137 的培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。得到最優(yōu)條件：麥芽糖26.73 g/L，酵母浸粉21.8 g/L，大豆蛋白胨16.59 g/L，MgSO4·7H2O 0.15 g/L，MnSO4·H2O 0.06 g/L，腺嘌呤0.13 g/L，苯丙氨酸0.051 g/L，吐溫80 1 mL/L，初始pH 值7.0，接種量3%，培養(yǎng)溫度30℃，最終活菌數(shù)達到9.2×109CFU/mL，在此優(yōu)化條件下，于3.5 L 發(fā)酵罐中培養(yǎng)，活菌數(shù)為1.1×1010CFU/mL，是基礎(chǔ)MRS 普通培養(yǎng)條件的3.67 倍。