超高壓處理對羊骨膠原蛋白三級結(jié)構(gòu)的影響

劉彥秋，都日瑪，白 楊，娜荷芽，喬丹丹，王月宏，格日勒圖，莎日娜*

（1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 呼和浩特市 010018 2 卓資縣農(nóng)牧和科技局 內(nèi)蒙古烏蘭察布 012300）

膠原蛋白是一種呈白色或乳白色、不透明、無支鏈的水不溶性纖維蛋白[1]。膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)使其分子結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，具有低抗原性、生物降解性、生物相容性和生物活性等特性，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)學(xué)、美容等方面[2-3]。

超高壓技術(shù)是在100～1 000 MPa 壓力下，以水等液體為介質(zhì)，將物料放在高壓容器中作用一定時間，以改變食品活性的一類食品處理手段[4]。該技術(shù)可改變材料的孔徑、結(jié)構(gòu)和功能。Javier 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，β-乳球蛋白經(jīng)200 MPa 超高壓處理后更易被胃蛋白酶水解。Ana 等[6]指出，400 MPa 壓力下可加快卵清蛋白被胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶水解的速度。

本研究以羊骨粉為原料，分別以100，200，300，400，500 MPa 超高壓，保壓時間2，5，8，11，14 min 為條件，研究膠原蛋白經(jīng)超高壓處理后，微觀形態(tài)、熱變性溫度以及膠原蛋白吡啶交聯(lián)和空間結(jié)構(gòu)的變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊骨粉，內(nèi)蒙古鄂爾多斯市中科萬欣富硒清真食品有限責(zé)任公司提供；胃蛋白酶、羥脯氨酸含量試劑盒、十二烷基磺酸鈉（SDS）、考馬斯亮藍-R250、甘氨酸，北京索萊寶科技有限公司；冰乙酸、無水乙醇、甲醇，天津市致遠化學(xué)試劑有限公司；羊賴氨酸吡啶啉（LP）酶聯(lián)免疫試劑盒、羊羥賴氨酸吡啶啉（HP）酶聯(lián)免疫試劑盒，江蘇晶美生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超高壓設(shè)備，包頭科發(fā)高壓科技有限責(zé)任；SIGMA 離心機，西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；壓蓋型冷凍干燥機，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；生化培養(yǎng)箱，山東博科儀器有限公司；醫(yī)用冷藏冷凍冰箱，青島海爾特種電器有限公司；傅里葉紅外光譜儀，美國賽默飛世爾公司；差式掃描儀，美國TA 公司；酶標(biāo)儀，美國寶特公司。

1.3 方法

1.3.1 膠原蛋白的制備 試驗組：羊骨粉→超高壓處理→脫脂（無水乙醇）→脫鈣（0.5 mol/L 鹽酸）→除雜蛋白（0.1 mol/L 氫氧化鈉）→酸法酶解（0.5 mol/L 乙酸溶液和不同百分比胃蛋白酶）→鹽析（0.9 mol/L 氯化鈉）→透析 （5 mmol/L 乙酸、蒸餾水）→冷凍干燥；

對照組：羊骨粉不進行超高壓處理，制備方法同試驗組。

1.3.2 羊骨膠原蛋白結(jié)構(gòu)表征鑒定

1.3.2.1 膠原蛋白SDS-PAGE 凝膠電泳 取適量凍干的羊骨膠原蛋白，溶于0.5 moL/L 冰乙酸溶液中，使用2 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)其pH 值至中性，將樣品溶液與SDS-PAGE 蛋白質(zhì)緩沖液（5×）以4∶1的體積比混勻。100 ℃水浴中煮沸樣品5 min，冷卻后上樣（樣品和Marker 上樣量均為10 μL）。采用2%的濃縮膠和5%的分離膠[7]，電壓調(diào)至120 V，電泳2～3 h。

1.3.2.2 紫外光譜分析 將凍干后的膠原蛋白樣品用0.5 mol/L 冰乙酸溶解，并配置成2 mg/mL 的溶液，常溫下用紫外-可見分光光度計進行掃描[8]，掃描波長200～400 nm，以0.5 mol/L 冰乙酸作為空白。

1.3.2.3 傅里葉紅外光譜分析 取膠原蛋白樣品與干燥的光譜溴化鉀晶體混合均勻并壓成薄片，置于樣品室內(nèi)進行掃描分析。掃描波數(shù)為500～4 000 cm-1，次數(shù)為64 次，速度為0.2 cm/s，分辨率為4 cm-1[9]。

1.3.3 掃描電子顯微鏡（SEM）分析 取膠原蛋白樣品置于載物臺上，經(jīng)離子濺噴金處理后，用掃描電鏡在10.0 kV 的電壓下放大200 倍觀察其微觀結(jié)構(gòu)[10]。

1.3.4 膠原蛋白熱變特性分析 稱取約10 mg 樣品，放入鋁制坩堝中，壓片密封，置于樣品室進行測量，以空鋁制坩堝作對照。從25 ℃升溫到100℃，升溫速度2 ℃/min[11]。

1.3.5 膠原蛋白的吡啶交聯(lián)分析 參照盧桂松等[12]的方法。采用雙抗體夾心法測定羊骨膠原蛋白吡啶交聯(lián)的含量。以標(biāo)準(zhǔn)物含量為橫坐，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過線性回歸得到羥賴氨酸吡啶啉（HP）的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0252x+0.0299（R2=0.9974），和賴氨酸吡啶啉（LP）的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0233x+0.0319（R2=0.9981）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各吸光值對應(yīng)的樣品含量。由此計算羊骨膠原蛋白HP 和LP 的含量。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 本試驗使用統(tǒng)計分析軟件SPSS 26.0、Design Expert11；辦公軟件Microsoft Office Excel 2010 與Microsoft Office Word 2010；繪圖軟件GraphPad prism 5.0，對試驗數(shù)據(jù)結(jié)果進行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊骨膠原蛋白的結(jié)構(gòu)表征鑒定

2.1.1 SDS-PAGE 凝膠電泳結(jié)果 對試驗所提取的羊骨膠原蛋白進行SDS-PAGE 凝膠電泳分析，結(jié)果如圖1所示。膠原蛋白約在200 ku 附近出現(xiàn)一條β 帶，在約120 ku 出現(xiàn)α1和α2兩條條帶，表明羊骨提取的膠原蛋白為Ⅰ型膠原蛋白，并且具有完整的三螺旋結(jié)構(gòu)。

2.1.2 羊骨膠原蛋白紫外光譜分析 對羊骨膠原蛋白進行紫外光譜分析，結(jié)果如圖2所示。羊骨膠原蛋白結(jié)構(gòu)在波長235 nm 處達到最大吸收。這是由于肽鍵C=O 的躍遷所致，符合Ⅰ型膠原蛋白三股螺旋結(jié)構(gòu)的紫外吸收特征；而在波長280 nm 處沒有出現(xiàn)吸收峰，這符合Ⅰ型膠原蛋白的一級結(jié)構(gòu)中缺乏如酪氨酸、苯丙氨酸等具有共軛雙鍵的芳香族氨基酸。

圖2 羊骨膠原蛋白紫外光譜圖Fig.2 Ultraviolet spectrum of sheep bone collagen

2.1.3 羊骨膠原蛋白紅外光譜分析 對羊骨膠原蛋白進行紅外光譜分析，結(jié)果如圖3所示。各特征峰及譜帶歸屬見表1。羊骨膠原蛋白具的特征主要包括酰胺A、酰胺B、酰胺I、酰胺Ⅱ、酰胺Ⅲ特征吸收峰，分別在3 299.64，2 924.81，1 650.56，1 550.71，1 223.88 cm-1附近出現(xiàn)峰值，說明所提取的羊骨蛋白主要以膠原蛋白為主，并具有完整的三螺旋結(jié)構(gòu)。

圖3 羊骨膠原蛋白紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectrum of sheep bone collagen

表1 FTIR 膠原蛋白特征峰及譜帶歸屬[13]Table 1 Characteristic peaks and bands assignments of FTIR collagen[13]

2.2 羊骨膠原蛋白的微觀結(jié)構(gòu)分析

采用掃描電鏡法（SEM）對試驗組和對照組的膠原蛋白進行微觀結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果如圖4所示。由圖4a 可知，對照組的膠原蛋白結(jié)構(gòu)松散。經(jīng)過超高壓處理后，膠原蛋白發(fā)生了短暫的聚合（圖4b～4d），這可能是因為蛋白質(zhì)分子內(nèi)的非共價相互作用受到超高壓的影響，分子間鍵或分子內(nèi)鍵發(fā)生重組導(dǎo)致聚合[14]。Perreault 等[15]對亞麻籽進行了超高壓處理并分析時間對蛋白結(jié)構(gòu)影響，結(jié)果表明，超高壓壓力會使蛋白聚集為大分子聚合物。然而，當(dāng)超高壓壓力增大到400 MPa 后，膠原蛋白分子結(jié)構(gòu)又展開，如圖4e 和4f 所示，這可能是因為當(dāng)壓力增大到一定程度，膠原蛋白的巰基（SH）和二硫鍵（S-S）徹底斷裂導(dǎo)致的。Pin 等[16]也發(fā)現(xiàn)壓力處理能將蛋白質(zhì)中的二聚體分解成單體。綜上，膠原蛋白分子在加壓的時候先發(fā)生大分子聚合，在超過一定壓力以后，又被分解為小的單體。Zhang等[17]研究也認為，超高壓導(dǎo)致甘氨酸被分解成亞基，產(chǎn)生新的游離巰基殘基，其變性機理也可能與二硫鍵的斷裂有關(guān)。而甘氨酸作為膠原蛋白中含量最高、分子質(zhì)量最低的一種氨基酸，在α 鏈外僅有一個氫原子，其作用是使3 條α 鏈間結(jié)合的更緊密，從而有利于最終超螺旋結(jié)構(gòu)的形成[18]。綜上所述，超高壓可能使膠原蛋白中氨基酸α 鏈斷裂，從而導(dǎo)致膠原蛋白的超螺旋結(jié)構(gòu)被破壞。

圖4 膠原蛋白的電鏡分析圖Fig.4 Electron microscopy of collagen

2.3 羊骨膠原蛋白熱變特性分析結(jié)果

采用DSC 法對試驗組和對照組的膠原蛋白進行熱變性分析，結(jié)果如圖5所示。試驗組的膠原蛋白經(jīng)過超高壓處理以后，其變性溫度由44.9℃降低為31.7 ℃，這一結(jié)果與瞿怡等[19]研究的牛皮膠原蛋白熱變性溫度隨超聲波功率和超聲時間的提高而逐漸降低的結(jié)果一致。Balny 等[20]也認為在較高的壓力下，膠原蛋白的變性溫度通常降低。這一結(jié)果可以說明對照組膠原蛋白比試驗組膠原蛋白具有更強的熱穩(wěn)定性，羊骨經(jīng)過超高壓處理以后，使得膠原蛋白的部分氫鍵發(fā)生斷裂，三股螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的非共價結(jié)合力變?nèi)酰z原分子更易解纏繞。

圖5 羊骨膠原蛋白DSC 圖Fig.5 DSC diagram of sheep bone collagen

2.4 膠原蛋白吡啶交聯(lián)的分析結(jié)果

由表2可知，對照組膠原蛋白HP 含量為115.85 nmol/g，LP 含量為88.71 nmol/g。試驗組膠原蛋白HP 和LP 含量隨著超高壓壓力的增加呈顯著下降的趨勢（P<0.05）。由表3可知，超高壓壓力與HP 和LP 含量均呈極顯著負相關(guān)（P<0.01），相關(guān)系數(shù)分別為-0.989，-0.922，HP 含量與LP 含量呈現(xiàn)正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.931。

表2 超高壓壓力對HP 和LP 含量的影響Table 2 Effects of ultra-high pressure on the content of HP and LP

表3 超高壓壓力與HP 和LP 含量相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis between ultra-high pressure and the content of HP and LP

由表4可知，試驗組膠原蛋白經(jīng)過超高壓處理后，吡啶交聯(lián)的含量隨著保壓時間的延長，HP和LP 含量均呈顯著下降的趨勢（P<0.05）。由表5可知，保壓時間與HP 和LP 含量均呈極顯著負相關(guān)（P<0.01），相關(guān)系數(shù)分別為-0.955，-0.900；且保壓時間對HP 的影響高于與LP 的影響。HP 含量與LP 含量呈現(xiàn)正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.969。

表4 保壓時間對HP 和LP 含量的影響Table 4 Effects of pressure holding time on the content of HP and LP

表5 超高壓壓力與HP 和LP 含量相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis between ultra-high pressure and the content of HP and LP

超高壓處理改變了羊骨粉膠原蛋白的構(gòu)象，同時使得膠原蛋白吡啶諾啉的含量降低；進而導(dǎo)致膠原蛋白吡啶交聯(lián)程度降低。膠原分子賴氨酸、羥賴氨酸等基團都是帶電荷的。在天然的纖維中，大部分基團通過分子內(nèi)或分子間的相互作用形成離子鍵，給膠原纖維提供了很大的穩(wěn)定能。然而，壓力可以改變膠原蛋白纖維內(nèi)的靜電性質(zhì)，減弱了分子內(nèi)和分子間的靜電作用[21]，破壞其中的離子鍵，從而影響了膠原蛋白的構(gòu)象，使吡啶諾啉的含量減少，吡啶交聯(lián)程度降低。

Ⅰ型膠原蛋白的膠原纖維由2 個非螺旋區(qū)域（氨基N 肽端、羧基C 末端肽）和一個中央螺旋結(jié)構(gòu)組成。鄰近膠原分子的非螺旋與螺旋區(qū)域在膠原基質(zhì)的作用下形成交聯(lián)分子，而新合成的膠原纖維在鄰近膠原分子共價交聯(lián)的作用下趨向穩(wěn)定[22]。由此可知，吡啶交聯(lián)存在于膠原蛋白三級結(jié)構(gòu)中，而超高壓處理對蛋白的影響是主要破壞蛋白三級、四級結(jié)構(gòu)的非共價鍵[23]，從而導(dǎo)致膠原蛋白吡啶諾啉含量減少，吡啶交聯(lián)程度降低。

3 結(jié)論

羊骨膠原蛋白掃描電鏡結(jié)果表明，經(jīng)過超高壓處理的膠原蛋白在壓力為100～300 MPa 時出現(xiàn)短暫的聚合現(xiàn)象；當(dāng)壓力超過400 MPa 時，膠原蛋白又展開，說明超高壓壓力破壞了膠原蛋白的三級結(jié)構(gòu)。

經(jīng)過超高壓處理的膠原蛋白的熱變性溫度由44.9 ℃降低為31.7 ℃，說明超高壓處理會使膠原蛋白的熱變性溫度降低，使膠原蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)解旋，肽鏈發(fā)生斷裂，從而破壞膠原蛋白的三級結(jié)構(gòu)。

超高壓處理后，膠原蛋白的吡啶諾啉含量隨著超高壓壓力的增加和保壓時間的延長呈顯著下降的趨勢（P<0.05）；超高壓壓力與HP 和LP 含量呈極顯著負相關(guān) （P<0.01），相關(guān)系數(shù)分別為-0.989，-0.922；保壓時間與HP 和LP 的含量也呈極顯著負相關(guān) （P<0.01），相關(guān)系數(shù)分別為-0.955，-0.900。

綜上所述，羊骨膠原蛋白經(jīng)過超高壓處理后，其構(gòu)象發(fā)生變化，三級結(jié)構(gòu)遭到破壞，三股螺旋結(jié)構(gòu)更早發(fā)生解旋，肽鏈變得伸展，暴露了更多酶切位點，并且壓力的存在能夠有效地促進酶與底物的結(jié)合，促進膠原蛋白的進一步水解，從而促進肽的產(chǎn)生。本研究為提取膠原蛋白肽提供了理論依據(jù)。