諾麗發(fā)酵汁介導(dǎo)腸道菌群緩解小鼠DSS結(jié)腸炎

曲泰齊，張家超，汪瑞敏，劉四新，任發(fā)政，李從發(fā)*

（1 海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 ?？?570228 2 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)營養(yǎng)與健康系 北京 100193）

炎癥性腸?。↖nflammatory bowel disease，IBD） 是慢性免疫介導(dǎo)性疾病，包括克羅恩病(Crohn's disease，CD）和潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC），會(huì)引起從直腸到近端結(jié)腸不同程度的淺表黏膜炎癥[1]。潰瘍性結(jié)腸炎患病率逐年增加，已成為新的全球公共衛(wèi)生問題[2]。潰瘍性結(jié)腸炎典型的組織學(xué)改變包括隱窩密度降低，隱窩結(jié)構(gòu)被破壞，黏膜表面不規(guī)則以及黏膜炎癥。

大量研究證實(shí)，環(huán)境因素、飲食、藥物、機(jī)體免疫和腸道菌群變化與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。腸道菌群紊亂引起的免疫反應(yīng)失調(diào)是造成潰瘍性結(jié)腸炎的主要病因之一[3]。腸道菌群可通過影響機(jī)體消化、代謝和營養(yǎng)素的吸收來維持腸道上皮完整性以及防止有害微生物的入侵和生長來影響人體免疫狀態(tài)[4]。腸道作為人體最大的開放系統(tǒng)之一，表面布滿大量細(xì)菌、真菌和病毒[5]。一方面，腸道需要抵抗外來有害病原體入侵，另一方面需要耐受腸道中寄生的微生物[6]。當(dāng)腸屏障功能受損和腸道菌群失調(diào)時(shí)，腸道菌群與宿主之間的復(fù)雜相互作用可能被破壞，導(dǎo)致潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生[7]。潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生與腸道菌群的變化密切相關(guān)。

飲食在腸道菌群群落結(jié)構(gòu)中起著重要作用[8]?？茖W(xué)飲食可以有效協(xié)助治療IBD，并被認(rèn)為是目前可用的除醫(yī)學(xué)和外科療法之外的治療手段[9]。諾麗（Morinda citrifolia Linn，noni），又稱海巴戟天或海巴戟，主要分布在南太平洋諸島嶼、澳大利亞、東南亞，以及我國海南島、西沙群島和臺(tái)灣等地[10]。波利尼西亞人將它用作食品、藥品已有約2 000年歷史[11]。諾麗富含抗炎相關(guān)的生物活性物質(zhì)，如諾麗多糖、表兒茶素和東莨菪亭等[12]。諾麗果漿是新食品原料，諾麗發(fā)酵果汁（Fermented noni juice，F(xiàn)NJ） 是將整果在容器中密閉2～6 個(gè)月而成，是諾麗加工的主要產(chǎn)品。研究表明，諾麗果提取物可改善腸道菌群并在體外發(fā)揮抗炎作用[13]；諾麗果汁可降低炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)[14]；諾麗發(fā)酵汁具有調(diào)節(jié)免疫平衡和皮膚屏障功能[15]。

在UC 的發(fā)病過程中，腸道炎癥與腸道菌群失調(diào)之間的因果關(guān)系尚不清楚。從腸道菌群的角度看，F(xiàn)NJ 對UC 的影響未得到充分研究。本文從腸道菌群介導(dǎo)的角度研究FNJ 對UC 的免疫調(diào)節(jié)作用。通過分析組織病理學(xué)、血清中細(xì)胞因子水平和腸道菌群組成，闡明腸道菌群介導(dǎo)UC 的潛在機(jī)理以及FNJ 的藥用價(jià)值和保健作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性C57BL/6 小鼠，6 周齡，體質(zhì)量18～20 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室恒溫（22 ± 2）℃，恒濕【（55 ±5）%】，每12 h 晝夜交替。所有小鼠自由飲水采食。

1.1.2 試驗(yàn)原料 FNJ，海南方廣新農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司。

1.1.3 試劑 葡聚糖硫酸鈉 （Dextran sulfate sodium，DSS），上海翊圣生物科技有限公司；腫瘤壞死因子（TNF-α）檢測試劑盒、小鼠白細(xì)胞介素6（IL-6）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒，上海信裕生物科技有限公司；4 %多聚甲醛通用型組織固定液，索萊寶生物科技有限公司。

1.1.4 儀器與設(shè)備 Multiskan FC 酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技有限公司；BX51T-PHD-J11 顯微鏡、CMOS，日本Olympus 公司；Image-Pro Plus 多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)，美國Media Cybernetics 公司；RM2015 切片機(jī)，德國萊卡；Neofuge 15R 高速冷凍離心機(jī)，力康發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，將30 只小鼠隨機(jī)分為3 組，分別為空白組（C）、模型組（M）和FNJ 飼養(yǎng)組（N），每組10 只。M 組和N 組連續(xù)7 d 灌胃3%葡聚糖硫酸鈉溶液10 mL/（kg·d），C組灌胃生理鹽水。N 組小鼠連續(xù)14 d 灌胃0.2 mL/20 g FNJ，C 組和M 組灌胃生理鹽水。第15 天收集小鼠的糞便樣品，-80 ℃條件下保存。眼球摘除取血，4 ℃、3 000 r/m 離心10 min，分離血清。采血結(jié)束后，頸椎脫臼處死小鼠，解剖取結(jié)腸組織并測量長度后于-80 ℃保存。

1.2.2 結(jié)腸病理組織學(xué)分析 將結(jié)腸橫切并用4%多聚甲醛固定后石蠟包埋，4 μm 切片。使用二甲苯脫蠟，經(jīng)各級乙醇至水洗。使用蘇木素和伊紅染色。經(jīng)脫水、透明、封片后對結(jié)腸組織進(jìn)行組織病理學(xué)分析，評估潰瘍、炎癥浸潤和隱窩結(jié)構(gòu)異常。

表1 DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎的疾病活動(dòng)指數(shù)評分系統(tǒng)Table 1 Disease activity index scoring system of dextran sodium sulfate-induced colitis

1.2.3 血清細(xì)胞促炎因子測定 使用ELISA 試劑盒檢測血清細(xì)胞促炎因子TNF-α 和IL-6。用Multiskan FC 酶標(biāo)儀測定樣品在波長450 nm 處的吸光度值。以標(biāo)準(zhǔn)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的吸光度值由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相應(yīng)的質(zhì)量濃度，比較不同組間兩種血清細(xì)胞促炎因子質(zhì)量濃度差異。

1.2.4 16 S rDNA 測序 測序工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。采用CTAB 凍融法提取每組糞便樣品的總DNA，采用Nanodrop 對DNA 進(jìn)行定量，并通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)檢測DNA 質(zhì)量。然后，通過PCR 擴(kuò)增目標(biāo)片段。采用Illumina 公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep 試劑盒制備測序文庫后上機(jī)，進(jìn)行高通量測序。所得測序數(shù)據(jù)根據(jù)序列質(zhì)量初篩，重測、補(bǔ)測問題樣本。通過篩選的原始序列，按照index和barcode 信息進(jìn)行文庫和樣本劃分，同時(shí)去除barcode 序列。按照QIIME2 dada2 分析流程去噪、OTU 聚類。在OTU 層面進(jìn)行Alpha 多樣性和不同組間的Beta 多樣性差異及差異顯著性分析。利用LEfSe 在物種分類學(xué)組成層面衡量不同組間物種豐度組成差異，尋找標(biāo)志物種。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（x±s）表示。用SPSS 22.0 的單因素方差分析和Duncans 多重檢驗(yàn)比較均值。顯著性水平α=0.05。使用Origin 2019b 和R 繪制圖表。

2 結(jié)果

2.1 FNJ 干預(yù)對大鼠體質(zhì)量的影響

從體質(zhì)量和疾病活動(dòng)指數(shù)兩個(gè)方面評估FNJ對DSS 誘導(dǎo)的UC 的緩解效果。通過灌胃DSS 誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎，并每周進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)（Disease activity index，DAI）評分。在實(shí)驗(yàn)開始前，3 組小鼠的體質(zhì)量之間沒有顯著性差異。DSS灌胃1 周后，C 組的體質(zhì)量從（22.44±0.35）g 增到（23.74±0.26）g，而其它兩組的體質(zhì)量有下降趨勢（P<0.001）。干預(yù)1 周后，N 組小鼠在一定程度上恢復(fù)了體重（圖1b 和1c）。此外，灌胃DSS 1 周后，小鼠出現(xiàn)明顯的腹瀉和輕微出血，這在DAI 中得到反映（圖1a）。兩周后，N 組的DAI 與C 組沒有顯著差異，而M 組的DAI 高于其它兩組 （圖1a）。

圖1 各組小鼠的疾病活動(dòng)指數(shù)得分（a）、體質(zhì)量變化（b 和c）Fig.1 The DAI index （a) and weight changes （b and c） of mice

2.2 FNJ 對小鼠組織病理學(xué)的影響

DSS 誘發(fā)的結(jié)腸炎與結(jié)腸長度的顯著減少有關(guān)，它通常被用作DSS 結(jié)腸炎炎癥程度的形態(tài)學(xué)參數(shù)[8]。M 組的結(jié)腸長度顯著小于C 組和N 組，并且C 組和N 組之間沒有顯著性差異，這說明FNJ的干預(yù)緩解了結(jié)腸的損傷（圖2a）。

通過組織病理學(xué)進(jìn)一步觀察結(jié)腸損傷程度（圖2b）。C 組腸黏膜和隱窩結(jié)構(gòu)完整，無潰瘍和破損。與C 組相比，M 組被觀察到結(jié)腸組織病變，腸黏膜破損以及腸上皮細(xì)胞的死亡和脫落，肌肉層出現(xiàn)炎性水腫和少量炎性細(xì)胞浸潤。同時(shí)，F(xiàn)NJ 的干預(yù)使得N 組的病變減輕。N 組的隱窩深度介于C 組和M 組之間，M 組的隱窩深度最小。M 組的腸壁厚度明顯更薄，與其它兩組相比依次為：C>N>M。

圖2 小鼠結(jié)腸長度比較（a）、小鼠結(jié)腸100x 代表性HE 染色組織學(xué)觀察（b）Fig.2 Colon length comparison （a) and representative histological observation （b) of HE mice colon at original magnification of 100x

2.3 FNJ 對小鼠血清炎癥因子的影響

血清中的TNF-α 和IL-6 是兩種典型促炎細(xì)胞因子。結(jié)果如圖3a 所示，M 組的TNF-α 水平【（55.20±2.21）pg/mL】顯著高于C 組【（28.53±4.78）pg/mL】和N 組【（37.47±8.52）pg/mL，P<0.001】。同時(shí)，M 組的IL-6 水平【（15.26±1.35）pg/mL】與C 組【（11.02±0.72）pg/mL，P<0.001】和N 組【（10.17±0.43）pg/mL，P<0.001】有顯著差異（圖3b）。綜上所述，F(xiàn)NJ 干預(yù)顯著降低了結(jié)腸炎小鼠血清中TNFα 和IL-6 的含量。

圖3 FNJ 對小鼠血清生化因子的影響Fig.3 Effects of FNJ on the serum biochemical factorinmice

2.4 FNJ 對小鼠腸道菌群α、β 多樣性的影響

使用QIIME 分析平臺(tái)比較腸道菌群的α 多樣性。Chao1 指數(shù)用于表征樣品中物種的豐度，而Shannon 指數(shù)用于表征微生物多樣性。各組的Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)沒有顯著差異（圖4a～b）。β 多樣性分析是對不同樣品、不同組間樣品的微生物群落構(gòu)成進(jìn)行比較分析。通過主坐標(biāo)分析圖觀察到明顯的聚類現(xiàn)象。圖中的圓圈表示50%的置信區(qū)間（圖4c）。PCoA 圖顯示，M 組和C 組之間的微生物結(jié)構(gòu)具有顯著性差異。此外，N 組的微生物組成與M 組相比也有顯著差異，與對照組更為相似。圖4d 表示每組樣本與C 組之間的距離，距離越大菌群差異越大。N 組和C 組之間的距離較M 組更短，這表明N 組與C 組腸道菌群的物種組成更為相似。

圖4 FNJ 對小鼠腸道微生物群α 和β 多樣性的影響Fig.4 Effects of FNJ on the α and β diversity of gut microbiota in mice

2.5 FNJ 對小鼠腸道微生物組成的影響

進(jìn)一步分析每組在門和屬水平上的腸道菌群。對相對豐度大于1%以上的物種進(jìn)行分析，所有相對豐度小于1%的菌群合并為其它。經(jīng)篩選和優(yōu)化后，共檢測到10 個(gè)門，20 個(gè)綱，30 個(gè)目，51個(gè)科和61 個(gè)屬（圖5a～b）。在門水平上，與C 組相比，M 組中厚壁菌門的相對豐度顯著增加 （P<0.05），而擬桿菌門的相對豐度降低（圖5a）。與對照組相比，F(xiàn)NJ 的干預(yù)使得N 組恢復(fù)了厚壁菌門（P<0.05）和擬桿菌門相對豐度水平。在屬水平上（圖5b），與C 組相比，M 組DSS 處理上調(diào)了雙歧桿菌屬和乳桿菌屬的相對豐度（P<0.01）。同時(shí)N組瘤胃球菌屬相對豐度顯著低于模型組（P<0.05）。采用線性判別效應(yīng)量分析方法（LEfSe）鑒定生物標(biāo)志物，找出每組的優(yōu)勢微生物 （圖5c～d）。C 組、M 組和N 組在不同水平上分別有3，5 和11 個(gè)顯著不同的分類單元 （LDA 得分>2）。M 組中，LDA 得分最高的為厚壁菌門，其次為乳桿菌屬。N 組中柄桿菌目、嗜酸菌屬是優(yōu)勢類群。C 組是厭氧棒狀菌屬、紅球菌屬和諾卡氏菌科為優(yōu)勢類群。M 組和N 組的分類單元相互獨(dú)立。

圖5 FNJ 對小鼠腸道微生物組成的影響Fig.5 Effects of FNJ on the composition of gut microbiota in mice

2.6 血清炎癥因子與腸道菌群相關(guān)性分析

菌群與血清炎癥因子的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果如圖6所示。S24-7、普雷沃氏菌和擬桿菌與IL-6 和TNF-α 呈負(fù)相關(guān)，而梭菌、瘤胃球菌、螺桿菌和雙歧桿菌與IL-6 和TNF-α 正相關(guān)。此外，阿洛巴氏菌屬與TNF-α 正相關(guān)，乳桿菌屬和IL-6 呈正相關(guān)（圖6）。

圖6 血清細(xì)胞因子與微生物群的相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis between serum cytokines and microbiota

3 討論

利用DSS 誘導(dǎo)的UC 模型探討FNJ 對UC 的藥用價(jià)值。研究結(jié)果表明，飼喂FNJ 可以顯著緩解小鼠UC 的臨床表觀病理性狀，抑制血清中的促炎細(xì)胞因子分泌，還可有效減輕由UC 引起的腸道菌群紊亂現(xiàn)象。

促炎因子TNF-α 和IL-6 在腸道炎癥的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[16]，其增加與UC 的嚴(yán)重程度有關(guān)[17]。本研究中，F(xiàn)NJ 處理降低了血清促炎細(xì)胞因子TNF-α 和IL-6 的產(chǎn)生，這可能是由于FNJ中的抗壞血酸和類黃酮苷對NF-κB 信號通路起到抑制作用[18]。研究表明，TNF-α 主要由巨噬細(xì)胞響應(yīng)各種病理過程而產(chǎn)生，并具有與結(jié)腸炎有關(guān)的多種生物學(xué)活性。TNF-α 刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生和釋放其它細(xì)胞因子、趨化因子、炎性脂質(zhì)前列腺素E2以及活性氧和氮[19]，而FNJ 處理后TNF-α 的減少可能抑制上述下游反應(yīng)。IL-6 可以通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化，控制促炎T 細(xì)胞亞群 （例如Th1 或Th17 細(xì)胞） 與免疫抑制性調(diào)節(jié)T 細(xì)胞之間的平衡[20]。M 組中升高的IL-6 打破了這一平衡，N 組的FNJ 處理則將IL-6 下調(diào)至與正常組相近的水平，恢復(fù)了兩種細(xì)胞亞群間的平衡關(guān)系。

目前，越來越多的證據(jù)表明，腸道菌群在IBD的發(fā)展和治療中起著重要的作用[21]。通常，腸道菌群與宿主共生并處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)[22]。腸道菌群本身或其代謝產(chǎn)物（如脂多糖等）可以用作抗原性物質(zhì)，通過刺激腸道上皮細(xì)胞或免疫細(xì)胞來促進(jìn)宿主免疫功能的改善[23]。當(dāng)腸道菌群失衡時(shí)，腸黏膜屏障將被破壞，導(dǎo)致大量病原微生物的入侵并在腸道內(nèi)引發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，這將進(jìn)一步加劇腸道菌群紊亂，并最終導(dǎo)致或加劇UC 的發(fā)生[24-25]。維持腸道菌群的穩(wěn)態(tài)在UC 中起著不可忽略的作用。本研究中，通過16S rDNA 基因測序研究了FNJ 對DSS 誘導(dǎo)的UC 小鼠腸道菌群的影響。研究結(jié)果表明，F(xiàn)NJ 的攝入可以調(diào)節(jié)腸道菌群群落結(jié)構(gòu)至接近對照組水平。根據(jù)PCoA 圖，DSS 誘導(dǎo)的UC 小鼠的細(xì)菌群落與治療組明顯不同，這表明FNJ 可以調(diào)節(jié)與UC 相關(guān)的腸道菌群的紊亂。在DSS 誘導(dǎo)的模型組中擬桿菌屬的相對豐度降低，雙歧桿菌屬和乳桿菌屬的相對豐度增加，與先前的研究結(jié)果一致[26]。雙歧桿菌和乳酸菌作為常見的益生菌被學(xué)者們關(guān)注[27]。Leccese 等[28]發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌可以通過影響IL-23/Th17 軸來調(diào)節(jié)UC。通常，攝入足夠量的益生菌對宿主的健康有益。然而，Mileti 等[29]發(fā)現(xiàn)副干酪乳桿菌可以延遲UC 的發(fā)展并降低疾病的嚴(yán)重性，植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌GG 卻促進(jìn)了DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的發(fā)展。Tsilingiri 等[30]發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，植物乳桿菌可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的健康組織炎癥反應(yīng)的發(fā)生，這與沙門氏菌的誘導(dǎo)反應(yīng)相似。雙歧桿菌和乳桿菌在結(jié)腸炎中雖起重要的作用，但其益生和致病作用仍需進(jìn)一步證實(shí)。

本研究中，F(xiàn)NJ 明顯減輕了小鼠DSS 引起的UC 病理學(xué)臨床指標(biāo)，并調(diào)節(jié)小鼠的腸道菌群紊亂。FNJ 在預(yù)防DAI 升高和治療結(jié)腸組織損傷方面有顯著功效。此外，F(xiàn)NJ 通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)相關(guān)的血清促炎細(xì)胞因子水平，發(fā)揮相關(guān)抗炎作用。研究結(jié)果為維持腸道穩(wěn)態(tài)和UC 的治療方法提供新的思路。今后需進(jìn)一步確定FNJ 的特定活性成分在調(diào)節(jié)腸道菌群和炎癥相關(guān)信號通路中的作用，探討其藥用價(jià)值。