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    天冬多糖的結(jié)構(gòu)、免疫調(diào)節(jié)活性及體外抗氧化活性

    2022-09-07 07:42:16薩仁高娃陳永福蘇日娜
    中國食品學(xué)報(bào) 2022年8期
    關(guān)鍵詞:標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量

    牧 丹,薩仁高娃,包 良,陳永福,蘇日娜*

    (1 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 呼和浩特 010010 2 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 呼和浩特 010010)

    天冬(Radix asparagi) 為百合科植物天門冬【Asparagus cochinchinensis(Lour.)Merr.】的干燥塊根,是國家衛(wèi)生部公布的第三批藥食兩用資源之一[1],是一種既可食用也可藥用的珍品,經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高。其味甘、苦,性寒,歸肺腎經(jīng),具有養(yǎng)陰潤燥、清肺生津的功效,用于肺燥干咳、頓咳痰黏、咽干口渴、腸燥便秘等癥[2]。根據(jù)《現(xiàn)在蒙醫(yī)藥學(xué)》的記錄,天冬、喜馬拉雅紫茉莉、黃精與玉竹并列在蒙醫(yī)藥四大傳統(tǒng)的根類補(bǔ)益藥材之中,并具有滋補(bǔ)、固精、祛協(xié)日烏蘇、鎮(zhèn)赫依(指各生理功能的動力)等功效[3-4],主治協(xié)日烏蘇病,身體虛弱、頭暈、婦赫依癥、腎寒、遺精、陽痿、陰伏熱、陳熱等病癥[5]?!睹t(yī)別錄》載“去寒熱,養(yǎng)肌膚,益氣力”,《月華于本草》載“鎮(zhèn)心,潤五臟,益皮膚,悅顏色”,能使肌膚艷麗,保持青春活力[6]。由此可見,天冬滋養(yǎng)肌膚的功能明顯,民間有采用“天冬煮豬蹄”“天冬煮火腿”“天冬燉母雞”制作的食譜,極大地豐富了人們的養(yǎng)生美食范圍[7]。常食天冬能夠改善肌膚的血液循環(huán),增強(qiáng)代謝功能,具有抗衰老的作用,尤其適合愛美人士食用。據(jù)研究報(bào)道,天冬主要化學(xué)成分包括19 種氨基酸、多糖與其它活性小分子化合物,如β-谷甾醇、胡蘿卜甾醇、9-二十七烷、異菝葜皂甙元、薯蕷皂甙元、洋菝葜皂甙元-3-O-β-D-糖苷-脒蚜胺及甾體皂苷等。其中,多糖是天冬較為重要的組成,具有多種治療特性,包括抗氧化[8]、抗菌及抗炎[9-12]、抗腫瘤[13-14]、降血糖[15]、抗疲勞[16]及止咳等功效[17]。多糖作為非特異性免疫增強(qiáng)化合物,能提高機(jī)體的免疫功能[18-20]。我國十分重視糖類藥物的開發(fā),國家科技部已將“糖生物學(xué)與重大疾病發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制研究”列入未來十年對生物經(jīng)濟(jì)起引導(dǎo)作用的重大生命科學(xué)的應(yīng)用基礎(chǔ)研究課題[21-23]。近年來研究表明,天冬的抗腫瘤活性、免疫增強(qiáng)作用、清除自由基和抗脂質(zhì)過氧化活性等主要的藥理作用均與天冬的多糖成分有著密切的關(guān)系[24],對天冬多糖的研究具有重要意義。本文研究了天冬多糖的提取、純化、結(jié)構(gòu)解析、免疫調(diào)節(jié)及抗氧化活性,為今后天冬多糖的開發(fā)利用奠定試驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料與試劑

    天冬藥材、無水乙醇、蒸餾水、氯仿、正丁醇、超純水、濃硫酸、苯酚、無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(GZDD-0114),中國食品藥品檢定研究院;不同分子質(zhì)量葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品 (5 800,11 800,47 300,100 000,380 000,788 000 u,批號90601),日本昭和電工公司;無水乙酸鈉(分析純級)、冰醋酸(分析純級)、三氟乙酸、50%氫氧化鈉溶液、醋酸鈉、甘露糖標(biāo)準(zhǔn)品、鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)品、半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品、半乳糖標(biāo)準(zhǔn)品、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品、阿拉伯糖標(biāo)準(zhǔn)品、葡萄糖胺標(biāo)準(zhǔn)品、巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)品,Sigma chemical 公司;γ 干擾素(IFN-γ)、白介素-2(IL-2)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒(ELISA 試劑盒),深圳市達(dá)科為生物技術(shù)股份有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    JA5003N 電子天平,上海菁海儀器有限公司;R-1001N 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,鄭州長城科工貿(mào)有限公司;電熱鼓風(fēng)干燥箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;BFX5-320 型低速自動平衡離心機(jī),白洋離心機(jī)廠;透析袋,和光純藥工業(yè)株式會社;78-1 磁力加熱攪拌器,常州國華電器有限公司;Telstar lyoQuest-85 凍干機(jī) (西班牙);IRAffinity-1 紅外分光光度計(jì),日本島津公司;ICS5000 離子色譜儀,ThermoFisher 公司;UGC-24M 氮吹儀,上海力辰科技有限公司;MAPADA-P9 雙光束紫外-可見分光光度計(jì)。上海美譜達(dá)儀器有限公司;515 高效液相色譜儀、2410 示差折光檢測器、Empower2 色譜工作站,Waters 公司。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 天冬粗多糖的提取 將天冬藥材粉碎過篩(40 目),稱取100 g 置于圓底燒瓶中,加入500 mL 蒸餾水,加熱回流3 次,每次1 h,放冷后抽濾。將3 次濾液合并濃縮至約100 mL。加無水乙醇,調(diào)節(jié)至最終乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)80%,冷藏靜置,密封醇沉1 夜。將醇沉物抽濾,收集固體烘干后得棕色粗多糖粉末。

    1.3.2 粗多糖的分離純化以及含量測定

    1.3.2.1 純化 稱取1 g 天冬粗多糖粉末,加100 mL 蒸餾水溶解。將溶液置于分液漏斗中,加入Sevage 試劑(V氯仿∶V正丁醇=4 ∶1)25 mL,強(qiáng)烈振搖20 min 后離心,收集上層液體,再次分液,重復(fù)上述脫蛋白操作,直至無蛋白層出現(xiàn)。將脫蛋白后的水溶液置于透析袋內(nèi)透析2~3 d。收集透析后的溶液濃縮后凍干,得白色天冬脫蛋白多糖凍干粉。

    1.3.2.2 苯酚-硫酸法測定糖含量測定

    1) 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取0.0250 g 無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL 容量瓶中,用超純水定容,振蕩搖勻,得0.25 mg/mL 無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液0.20,0.40,0.60,0.80,1.00,1.20 mL,分別置于10 mL 容量瓶中,加入超純水補(bǔ)至2.0 mL,分別加入6%的苯酚試劑1.0 mL,振蕩搖勻,用濃硫酸定容至刻度線,振蕩搖勻,靜置5 min 后40 ℃水浴30 min,取出。另取超純水2.00 mL 置于10 mL 容量瓶內(nèi),同上述操作制得空白對照溶液。用紫外-可見分光光度法在波長490 nm 處檢測其吸光度值。以吸光度值為縱坐標(biāo),葡萄糖的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    2) 供試品溶液的制備 精密稱取天冬粗多糖粉末與天冬脫蛋白凍干粉末各10 mg 于10 mL容量瓶中,加入超純水使其溶解并定容至刻度線,振蕩搖勻、備用。分別精密吸取以上溶液0.2 mL,置于10 mL 容量瓶中,同標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備方法制備供試品溶液,在波長490 nm 處測定其吸光度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中多糖含量。

    1.3.3 脫蛋白多糖的分級醇沉 稱取1.45 g 天冬脫蛋白凍干粉,置于燒杯中,加入150 mL 蒸餾水溶解,分別用30%,60%,80%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乙醇分級醇沉。每級醇沉物離心后所得沉淀用適量蒸餾水溶解,透析、凍干后進(jìn)行凝膠滲透色譜(GPC)測定。離心后剩余液體繼續(xù)進(jìn)行醇沉操作,最后得30%醇沉物73 mg,60%醇沉物365 mg 及80%醇沉物80 mg,用于結(jié)構(gòu)表征及活性測定。

    1.3.4 TD-80 紅外光譜檢測 取適量溴化鉀,烘干后置于研缽內(nèi)研磨至粉末狀,加入1~2 mg TD-80 凍干粉,混合后研磨均勻,壓片,用紅外光譜儀,在4 000~400 cm-1范圍測定TD-80 多糖的紅外光譜。

    1.3.5 天冬多糖的分子質(zhì)量的測定 采用凝膠滲透色譜(GPC)-示差檢測器法對天冬脫蛋白多糖及不同分級醇沉多糖進(jìn)行分子質(zhì)量測定。色譜條件:Ultrahydrogel 500 和Ultrahydrogel 250 (7.8 mm×300 mm)連用;排阻范圍(0.1~1 000 ku);流動相為醋酸鹽緩沖溶液(pH 4.5);流速:0.9 mL/min;柱溫:45 ℃。分別稱取分子質(zhì)量為5 800,11 800,47 300,100 000,380 000,788 000 u 的 標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖樣品各7 mg,用1 mL 流動相溶解,待用。吸取不同分子質(zhì)量的對照品溶液,分別進(jìn)樣20 μL,以保留時(shí)間(RT)為橫坐標(biāo)(x 軸),分子質(zhì)量的對數(shù)值為縱坐標(biāo)(y 軸),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,采用Empower 2 色譜工作站計(jì)算得到回歸方程。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程,計(jì)算樣品的數(shù)均分子質(zhì)量。

    1.3.6 TD-80 單糖組成分析 采用離子色譜-安培檢測法,色譜條件:色譜柱:DionexCarbopacTMPA20 (3 mm×150 mm);流 動相:A:H2O;B:250 mmol/L NaOAC、50 mmol/L NaOH 和500 mmol/L NaOAC;流速:0.3 mL/min;進(jìn)樣量:5 μL;柱溫:30℃;檢測器:安培檢測器。

    單糖標(biāo)準(zhǔn)品(巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、鹽酸氨基葡萄糖、N-乙酰-D 氨基葡萄糖、核糖)配成約10 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液。取各單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液精密配制1,5,10,20,50,80,100 mg/L 梯 度質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品。根據(jù)絕對定量方法,測定不同單糖質(zhì)量。

    取多糖TD-80 樣品4 mg 于安瓿瓶中,加入2 mol/L 三氟乙酸(TFA)1 mL,120 ℃水解3 h。準(zhǔn)確吸取200 μL 酸水解溶液轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP 管中,氮吹吹干,加入1 mL 水渦旋混勻,12 000 r/min 離心5 min。取上清進(jìn)行離子色譜分析。

    1.3.7 免疫調(diào)節(jié)活性試驗(yàn)

    1.3.7.1 TD-80 對脾淋巴細(xì)胞免疫增殖活性的測定 評價(jià)天冬的80%分級醇沉后得的均一多糖(TD-80)對脾淋巴細(xì)胞的增值活性,細(xì)胞存活率計(jì)算公式如下:

    小鼠斷頸處死,乙醇浸泡后剪開腹腔,取出脾臟,加分離液,研磨脾臟,單細(xì)胞透過尼龍網(wǎng)進(jìn)入分離液中,分離液轉(zhuǎn)至離心管,培養(yǎng)基離心30 min,分離出淋巴細(xì)胞層。淋巴細(xì)胞分離完成后,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。向96 孔板中加入100 μL 5×106個/mL 細(xì)胞懸液。陽性對照組加入100 μL 終質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL 氘逗素(ConA),試驗(yàn)組加入終質(zhì)量濃度分別為200,40,5 μg/mL 的多糖溶液,每孔終體積為200 μL,設(shè)置細(xì)胞對照。在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h 后,加入CCK-8 在波長450 nm 處測定OD 值。

    1.3.7.2 TD-80 對IFN-γ 和IL-2 細(xì)胞因子分泌的影響 如1.3.7.1 節(jié)所述,制備淋巴細(xì)胞懸液,加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔100 μL。試驗(yàn)組每孔加入100 μL 質(zhì)量濃度為200,40,5 μg/mL 多糖樣品,37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h,2 000 r/mim、4℃離心10 min,收集上清。使用雙抗體夾心法,參照IFN-γ 和IL-2 ELISA 檢測試劑盒說明書評估其細(xì)胞因子水平。將細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)稀釋至500,250,125,62.5,31.3,15.6 pg/mL 和7.8 pg/mL。

    1.3.7.3 TD-80 對TNF-α,IL-1β 和IL-6 細(xì)胞因子分泌的影響 RAW264.7 細(xì)胞是一種巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞系(從中國科學(xué)院的細(xì)胞庫中獲得),在含有10%熱滅活胎牛血清的Dulbecco 改良Eagle 培養(yǎng)基(Invitrogen)中保存。RAW264.7 細(xì)胞在96 孔板(1×106細(xì)胞/孔)中培養(yǎng),與不同質(zhì)量濃度(5,40 μg/mL 和200 μg/mL) 的TD-80 多糖在37 ℃、5%CO2條件下共培養(yǎng)48 h。以2.5 μg/mL 脂多糖(LPS)為陽性對照。除去上清液后,保存在-20 ℃。參照TNF-α,IL-1β 和IL-6 ELISA 試劑盒說明書的方法評估其細(xì)胞因子水平。

    1.3.8 體外抗氧化活性的測定

    1.3.8.1 超氧陰離子清除能力測定 AP-TEMED系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子,與鹽酸羥胺反應(yīng)生成NO2-,NO2-與對氨基苯磺酸和α-萘胺作用生成紅色的偶氮化合物,在波長530 nm 處有特征吸收峰。樣品對超氧陰離子的清除能力與在波長530 nm 處的吸光值呈負(fù)相關(guān)。采用超氧化物陰離子清除試劑盒使用說明書——微量法檢測超氧陰離子自由基的清除活性。簡而言之,將10 μL Tris-HCl 溶液(TEMED)和40 μL 過硫酸銨加到對照管和樣品管中,僅將25 μL H2O 添加到對照管中,在25 ℃下混合反應(yīng)1 min。將25 μL 多糖TD-80 溶液和陽性對照溶液抗壞血酸 (ASA)(0.01~0.1 mg/mL)添加到樣品管中,然后將50 μL 鹽酸羥胺溶液添加到兩個管中,在37 ℃下反應(yīng)30 min。最后,將50 μL 對氨基苯磺酸和α-萘胺在乙酸溶液中混合后加入到上述混合物中,在37 ℃下顯色反應(yīng)20 min,在波長530 nm 處測量吸光度A。計(jì)算超氧化物自由基清除活性。

    1.3.8.2 羥自由基清除能力 H2O2/Fe2+通過Fenton 反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基,將鄰二氮菲-Fe2+水溶液中Fe2+氧化為Fe3+,導(dǎo)致波長536 nm 處吸光度下降,樣品對536 nm 處吸光度下降速率的抑制程度,反映樣品清除羥自由基的能力。采用超氧化物陰離子清除試劑盒使用說明書——微量法檢測羥自由基的清除活性。簡而言之,在空白管、對照管及樣品管中分別加入250 μL 工作液 (V鄰二氮菲-無水乙醇∶VNa2HPO4·12H2O-NaH2PO4·2H2O∶VFeSO4·7H2O=100∶50 ∶100),空白管加入100 μL H2O;對照管加入50 μL H2O 和50 μL H2O2;樣品管中加入50 μL H2O2和50 μL不同質(zhì)量濃度的多糖及陽性對照ASA,混勻,37℃保溫60 min,8 000×g、25 ℃離心5 min。吸 取200 μL 上清液,于96 孔板中測定波長536 nm 處的吸光值,空白管、對照管和測定管的吸光值分別記為A空、A對和A測。

    1.3.8.3 DPPH 自由基清除率的測定 配制質(zhì)量濃度為1×10-5g/mL 的DPPH-乙醇溶液和0.2 mg/mL 天冬多糖溶液。分別取不同體積的多糖溶液200,400,600,800,1 000,1 500,2 000 μL,補(bǔ)足乙醇溶液至2 mL,用移液槍分別加入DPPH-乙醇溶液?;靹蚝笾脽o光環(huán)境中反應(yīng)30 min,于波長517 nm 處測定吸光度。以乙醇作為空白,按式(4)計(jì)算天冬多糖對DPPH 自由基的清除率。每份樣品平行操作3 次,取平均值。

    式中,A對照——DPPH 本身在測定波長處的吸光度;A樣品——樣品對DPPH 作用后的吸光度數(shù)值(除去樣品自身吸收)。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 多糖糖含量

    苯酚-硫酸法含量測定結(jié)果表明,葡萄糖質(zhì)量濃度在0.00~1.588 μg/mL 范圍呈線性關(guān)系,線性回歸方程為y = 0.0796x-0.3613,相關(guān)系數(shù)R2=0.9945。粗多糖中糖含量為63.13%,脫蛋白凍干粉中糖含量為73.98%。

    2.2 TD-80 紅外光譜檢測

    粗多糖80%醇沉物紅外光譜掃描結(jié)果見圖1。3 428.01 cm-1處的強(qiáng)吸收峰是糖分子中O-H 鍵的伸縮振動吸收,2 936.59 cm-1處的峰是C-H 鍵的伸縮振動吸收,1 630.16 cm-1處的峰是糖結(jié)合水的吸收峰,1 442.34cm-1的峰是糖分子中C-H 鍵的變角振動吸收,1 020.49 cm-1處的峰是吡喃環(huán)醚鍵C-O 鍵的變型振動吸收。另外,在1 745.73 cm-1附近有酯羰基對應(yīng)的強(qiáng)吸收峰,表明該糖含有糖醛酸,是酸性多糖。916.47 cm-1的峰是吡喃糖β 型C-H 變形振動的吸收峰,760.44 cm-1的峰是α-構(gòu)型吡喃環(huán)的對稱振動,說明天冬的80%醇沉多糖是含有α、β 兩種構(gòu)型的酸性吡喃多糖。

    圖1 TD-80 紅外光譜圖Fig.1 FT-IR spectrum of TD-80

    2.3 分子質(zhì)量的測定

    經(jīng)GPC 法測定脫蛋白天冬多糖和80%醇沉產(chǎn)物TD-80 的分子質(zhì)量。圖2a 為脫蛋白后天冬多糖的色譜圖,其顯示天冬脫蛋白多糖由兩個分子質(zhì)量的多糖組成,保留時(shí)間11.51 min 的峰的重均分子質(zhì)量為59.4 ku,保留時(shí)間16.29 min 的峰的分子質(zhì)量為3.9 ku。圖2b 顯示一個色譜峰,峰型對稱,說明TD-80 多糖相對分子質(zhì)量分布均一。根據(jù)葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性回歸方程為y =-0.3079x+5.9129,相關(guān)系數(shù)R2=0.9992。TD-80的重均分子質(zhì)量Mw 為6.8 ku,多分散指數(shù)為2.48。其余醇沉產(chǎn)物未得到單一組分多糖,文中未提供GPC 圖譜。

    圖2 GPC色譜圖Fig.2 GPC chromatogram

    2.4 單糖組成分析

    采用離子色譜儀,以13 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品為標(biāo)準(zhǔn),測定水解后TD-80 多糖的單糖組成。根據(jù)單糖標(biāo)準(zhǔn)品和多糖樣品色譜圖譜的出峰時(shí)間,鑒定樣品中相應(yīng)的單糖峰。結(jié)果表明:樣品TD-80 多糖中鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸物質(zhì)的量比為0.048 ∶0.102 ∶0.316∶0.157∶0.101∶0.017∶0.259,結(jié)果見圖3。

    圖3 離子色譜圖Fig.3 Ion chromatogram

    2.5 TD-80 多糖免疫調(diào)節(jié)作用

    2.5.1 TD-80 多糖對脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響 結(jié)果表明(圖4、表1),試驗(yàn)組OD450nm值與空白組比較均增大,表明TD-80 多糖組和Con-A 陽性對照組均不同程度地促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增值作用,其中TD-80 多糖組在5~200 g/mL 質(zhì)量濃度下,顯示質(zhì)量濃度依賴關(guān)系;當(dāng)TD-80 質(zhì)量濃度在40 μg/mL 和200 μg/mL 時(shí),差異顯著(P<0.05)。

    表1 TD-80 對正常小鼠的脾淋巴細(xì)胞增值反應(yīng)的影響Table 1 Effect of TD-80 on proliferation of splenic lymphocytes in normal mice

    圖4 TD-80 對正常小鼠的脾淋巴細(xì)胞增值反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of TD-80 on proliferation of splenic lymphocytes in normal mice

    2.5.2 TD-80 多糖對IFN-γ 和IL-2 細(xì)胞因子分泌的影響 3 個質(zhì)量濃度的TD-80 多糖對小鼠脾淋巴細(xì)胞中IFN-γ 的分泌具有極顯著的影響(P<0.01),并具有質(zhì)量濃度依賴性。當(dāng)TD-80 多糖質(zhì)量濃度大于40 μg/mL 時(shí),與細(xì)胞空白比較IFN-γ的分泌達(dá)到300 多倍,表明TD-80 多糖對IFN-γ的分泌影響極大。與細(xì)胞空白比較TD-80 多糖對IL-2 分泌的影響不顯著(結(jié)果見圖5)。

    圖5 TD-80 多糖對IFN-γ 和IL-2 細(xì)胞因子的分泌影響Fig.5 The effect of TD-80 polysaccharide on the secretion of IFN-γ and IL-2 cytokines

    2.5.3 TD-80 多糖對TNF-α,IL-6 和NO 細(xì)胞因子分泌的影響 測定TD-80 對小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7 細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子分泌的影響,研究TD-80 多糖的免疫調(diào)節(jié)活性。如圖6所示,將質(zhì)量濃度5~200 μg/mL 的TD-80 多糖與RAW264.7 細(xì)胞共培養(yǎng)48 h,發(fā)現(xiàn)TD-80 能促進(jìn)TNF-α (圖6a),IL-6(圖6b)和NO(圖6c)細(xì)胞因子的分泌。其中TD-80 的3 個質(zhì)量濃度組(5~200 μg/mL)與空白細(xì)胞組相比,均極顯著地增加腫瘤壞死因子α 的分泌(P<0.01)(圖6a),且具有質(zhì)量濃度依賴關(guān)系。TD-80 多糖同時(shí)對白介素-6 的分泌也有質(zhì)量濃度依賴性的影響,與空白細(xì)胞相比,高質(zhì)量濃度多糖組具有極顯著差異(P<0.01),陽性對照組LPS 和中濃度多糖組具有顯著性差異(P<0.05)(圖6b)。在NO 細(xì)胞因子的分泌影響中,TD-80 的2個質(zhì)量濃度組(40,200 μg/mL)和LPS 與空白細(xì)胞組相比,均顯著地增加NO 的分泌(P<0.05 或P<0.01)(圖6c),且具有質(zhì)量濃度依賴關(guān)系。

    圖6 TD-80 多糖對TNF-α、IL-6 和NO 細(xì)胞因子的分泌影響Fig.6 The effect of TD-80 polysaccharide on the secretion of TNF-α,IL-6 and NO cytokines

    2.6 體外抗氧化活性

    活性氧(ROS)主要由羥自由基和過氧化氫組成,過量的ROS 產(chǎn)生與細(xì)菌感染期間肝臟和腎臟的氧化損傷有關(guān),這可能有助于了解疾病的發(fā)病機(jī)理和死亡率[25]。如今,合成抗氧化劑在食品工業(yè)中得到廣泛使用,然而,這些合成物質(zhì)的毒性和致癌作用令人擔(dān)憂[26]。解決該問題途徑之一是使用天然抗氧化劑。

    在活性氧中,羥自由基是反應(yīng)性最高的一種,可以攻擊生物分子,例如DNA 和蛋白質(zhì)[27]。從天冬分離的多糖在4~10 mg/mL 質(zhì)量濃度范圍具有清除羥自由基的能力(圖7a),兩種樣品的活性均以質(zhì)量濃度依賴性方式增加。此外,TD-80 的清除活性隨著質(zhì)量濃度的增大而增大,特別是在高劑量(10 mg/mL)下,TD-80 表現(xiàn)出非常高的自由基清除活性(45.12%),與陽性對照比較P<0.05。在低劑量(4~7.5 mg/mL)時(shí),TD-80 的自由基清除活性低,這說明多糖TD-80 在高劑量下具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

    與抗壞血酸(ASA)相比,TD-80 清除超氧陰離子活性如圖7b 所示。樣品以質(zhì)量濃度依賴性方式表現(xiàn)出明顯的清除超氧陰離子的活性。TD-80多糖在質(zhì)量濃度0.01~0.1 mg/mL 范圍具有清除超氧陰離子的能力。與維生素C 比較,在質(zhì)量濃度0.1 mg/mL 下,TD-80 具有顯著的清除超氧陰離子活性(60.72%,P<0.05)。這些結(jié)果表明TD-80 具有清除超氧陰離子的抗氧化能力。

    DPPH 通常用作評估抗氧化劑活性的化合物,在波長517 nm 處表現(xiàn)出特征吸收,通常被認(rèn)為是具有穩(wěn)定自由基的化合物之一。本研究用比色法檢測純化的多糖TD-80 對DPPH 自由基的清除能力,結(jié)果如圖7c 所示。在質(zhì)量濃度0.02~0.2 mg/mL 范圍,陽性對照組ASA 的DPPH 清除率為100%;TD-80 多糖組具有質(zhì)量濃度依賴的DPPH 自由基清除能力,在最高質(zhì)量濃度下,其DPPH 自由基的清除率達(dá)到68.8%。以上羥自由基清除能力、超氧陰離子清除能力、DPPH 自由基清除能力等3 種抗氧化活性的測定僅在體外化學(xué)系統(tǒng)中建立。需進(jìn)行體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)或細(xì)胞試驗(yàn)以進(jìn)一步驗(yàn)證其抗氧化活性。

    圖7 TD-80 的體外抗氧化活性Fig.7 Antioxidant activity of TD-80 in vitro

    3 結(jié)論

    從天冬中提取多糖,分離純化后分析結(jié)構(gòu)特征,研究其免疫調(diào)節(jié)活性和體外抗氧化活性。結(jié)果表明:天冬粗多糖中糖含量為63.13%,脫蛋白凍干粉中糖含量為73.98%。根據(jù)紅外檢測結(jié)果,天冬的80%醇沉多糖(TD-80)是含有α、β 兩種構(gòu)型的酸性吡喃多糖。GPC 法測定結(jié)果表明:TD-80 的重均分子質(zhì)量Mw 為6.8 ku,多分散指數(shù)為2.48。天冬的80%醇沉多糖(TD-80)由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸等單糖組成。體外活性試驗(yàn)表明,TD-80 能促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖,對相關(guān)細(xì)胞因子 (TNF-α,IL-1β和IL-6)的分泌有一定的刺激作用,呈現(xiàn)一定的免疫調(diào)節(jié)活性和抗氧化活性。

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