牦牛乳硬質(zhì)干酪苦味肽RK7的抗氧化活性及其機(jī)制

楊保軍，梁 琪*，宋雪梅

（1 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 蘭州 730070 2 甘肅省功能乳品工程實(shí)驗(yàn)室 蘭州 730070）

干酪成熟過程中酪蛋白發(fā)生降解，肽是酪蛋白降解后暫存的中間產(chǎn)物。Huma 等[1]研究發(fā)現(xiàn)水牛乳和普通牛乳Cheddar 干酪水溶性多肽均對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞產(chǎn)生的自由基具有抑制作用。自由基是人體內(nèi)細(xì)胞代謝產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，體內(nèi)過量產(chǎn)生自由基會(huì)使細(xì)胞內(nèi)多種物質(zhì)（DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等）發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，致機(jī)體代謝紊亂。預(yù)防體內(nèi)自由基過量產(chǎn)生（即抗氧化）對(duì)維持人體健康具有重要意義。

國(guó)內(nèi)外研究表明，對(duì)抗氧化至關(guān)重要的信號(hào)通路由長(zhǎng)壽酶家族sirtuins（SIRT1-7）和單磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMPK）介導(dǎo)[3]。機(jī)體中的組蛋白雖可參與到調(diào)節(jié)蛋白分子活性、穩(wěn)定性以及相關(guān)激活因子和相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子之中實(shí)現(xiàn)抗氧化，但前提是讓SIRT1-7 作為乙?；复呋M蛋白發(fā)生乙?；磻?yīng)[2]。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）具有承載和轉(zhuǎn)移氫原子的作用，是SIRT1-7 介導(dǎo)的信號(hào)通路發(fā)生乙?；豢扇鄙俚妮o助因子，NAD+含量與抑制機(jī)體氧化反應(yīng)發(fā)生程度成正比，NAD+含量的調(diào)節(jié)可通過控制NAD+合成酶或NAD+降解酶活性來(lái)進(jìn)行[3]。體內(nèi)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞以及整個(gè)機(jī)體能量代謝、細(xì)胞自噬降解以及應(yīng)激耐受等過程同樣受AMPK 介導(dǎo)的信號(hào)通路的調(diào)控[4]。調(diào)控因子Keap1 和轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 是AMPK 信號(hào)通路下重要抗氧化調(diào)控途徑Keap1-Nrf2 中的兩個(gè)關(guān)鍵性蛋白分子，體內(nèi)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)可以被Nrf2 激活，自然條件下Nrf2 與Keap1 的特定區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)Nrf2 降解[3]。生物活性肽的抗氧化作用主要?dú)w因于Keap1-Nrf2 信號(hào)通路的激活[5]。Tonolo等[6]研究表明牛乳來(lái)源的生物活性肽KVLPVPEK能夠阻礙Nrf2 與Keap1 的相互作用，上調(diào)相關(guān)抗氧化酶的表達(dá)。通過提供小分子抗氧化物質(zhì)阻止Nrf2 與Keap1 蛋白結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合來(lái)維持高Nrf2水平，可增強(qiáng)機(jī)體抗氧化效果。

牦牛乳硬質(zhì)干酪營(yíng)養(yǎng)豐富，成熟期長(zhǎng)，且原料乳中有較高含量的酪蛋白 （約占總蛋白含量的80%，且以α-酪蛋白和β-酪蛋白為主）。宋雪梅等[7]研究表明15 ℃成熟4 個(gè)月的牦牛乳硬質(zhì)干酪中水溶性多肽對(duì)1，1-二苯基-2-三硝基苯 （1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率最高（30.20%）。豆佳毓等[8]研究表明脫脂牦牛乳硬質(zhì)干酪4 ℃成熟4 個(gè)月時(shí)水溶性多肽的DPPH 自由基清除率、超氧陰離子自由基（O2－·）清除率和羥自由基 （·OH） 清除率分別為52.39%，63.27%和49.54%。乳源活性肽主要源自αS1-酪蛋白，其次為β-酪蛋白和αS2-酪蛋白，少部分來(lái)自κ-酪蛋白，一般由2～20 個(gè)氨基酸發(fā)生縮合反應(yīng)形成肽鏈，且分子質(zhì)量小于6 000 u[9]。宋雪梅等[10]經(jīng)葡聚糖凝膠（Sephadex G-25） 色譜和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）從牦牛乳硬質(zhì)干酪中鑒定出14 種苦味肽，其中RPKHPIK（RK7）來(lái)源于αS1-酪蛋白，分子質(zhì)量為875.09 u，疏水性平均值（Q）為7 415.18 J/mol。Timon 等[11]指出不同凝乳酶干酪中分子質(zhì)量小于3 000 u 的多肽都具有抗氧化作用，且主要源自αS1-酪蛋白。BIOPEP 數(shù)據(jù)庫(kù)是目前最全面的生物活性肽數(shù)據(jù)庫(kù)[12]，截止2021年4月共記錄689種序列已知的抗氧化肽，將RK7 與該數(shù)據(jù)庫(kù)中抗氧化活性已知的肽序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)：其最高相似度為0，RK7 極有可能是一種新型天然抗氧化肽。分子對(duì)接已被用于尋找能與靶蛋白相互作用的多肽并說明其生物學(xué)機(jī)制。目前對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪中苦味肽的抗氧化機(jī)制尚無(wú)報(bào)道。本試驗(yàn)中主要研究體外合成牦牛乳硬質(zhì)干酪苦味肽RK7 的抗氧化活性，然后利用分子對(duì)接軟件研究其在SIRT1-7 和AMPK 信號(hào)通路介導(dǎo)下的抗氧化機(jī)制，為從分子水平分析和解釋苦味肽的抗氧化性提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)工具和材料

1.1.1 試驗(yàn)工具 Discovery Studio Client v16.1.0

（DS）軟件，主要用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能研究和藥物設(shè)計(jì)[13]。

1.1.2 試驗(yàn)材料 本試驗(yàn)以項(xiàng)目組前期從牦牛乳硬質(zhì)干酪中鑒定出的苦味肽RPKHPIK （RK7）為研究對(duì)象【注：R-精氨酸（Arg），P-脯氨酸（Pro），K-賴氨酸 （Lys），H-組氨酸 （His），I-異亮氨酸（Ile）】，RK7 由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，為后續(xù)的研究提供材料和基礎(chǔ)。

1.1.3 試劑與設(shè)備 無(wú)水乙醇，天津市光復(fù)科技有限公司；DPPH、2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸 （ABTS）、L-氧化型谷胱甘肽（GSSH），上海源葉生物科技有限公司；過硫酸鉀（K2S2O8），天津市化學(xué)試劑三廠；以上試劑均為分析純級(jí)。酶標(biāo)儀（VersaMax），上海光譜儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RK7 分子特性預(yù)測(cè) https：//pepcalc.com用于計(jì)算肽的等電點(diǎn)和凈電荷[14]；https：//web.expasy.org/protparam/用于計(jì)算肽的不穩(wěn)定性指數(shù)（不穩(wěn)定性指數(shù)低于40 預(yù)示該肽可能是穩(wěn)定的，不穩(wěn)定性指數(shù)高于40 則預(yù)示蛋白質(zhì)或肽可能不穩(wěn)定）[14]；https：//www.peptide2.com 用于計(jì)算肽的疏水性氨基酸比例[14]；http：//bioware.ucd.ie /～compass/biowareweb/用于預(yù)測(cè)肽的潛在生物學(xué)活性[15]；http：//www.innovagen.com/proteomics-tools 用 于 預(yù)測(cè)肽的溶解度[15]；http：//lmmd.ecust.edu.cn/admetsar1 /predict/?smiles=RPKHPIK& action=A 用于計(jì)算肽的ADMET 性質(zhì)（包括人體腸道吸收能力、血腦屏障穿透能力、急性口腔毒性等）[15]。

1.2.2 RK7 抗氧化活性測(cè)定

1.2.2.1 DPPH 自由基清除活性 參考Sharma等[16]的方法并略作改動(dòng)。DPPH 自由基清除率公式為：

式中，A0——樣品對(duì)照 （蒸餾水與乙醇混勻）的OD 值；A1——空白 （蒸餾水代替樣品） 的OD值；A2——待測(cè)樣液 （樣品與DPPH 反應(yīng)液混勻）的OD 值。

1.2.2.2 ABTS 自由基清除活性 參考張雪嬌等[17]的方法并略作改動(dòng)。ABTS 自由基清除率公式為：

式中，A0——樣品對(duì)照 （蒸餾水與乙醇混勻）的OD 值；A1——空白 （蒸餾水代替樣品） 的OD值；A'——待測(cè)樣液（樣品與ABTS+·工作液混勻）的OD 值。

1.2.3 RK7 抗氧化機(jī)制研究

1.2.3.1 結(jié)構(gòu)優(yōu)化 考慮到RK7 極有可能是一種新型抗氧化肽，為了提供足夠的理論依據(jù)，抗氧化機(jī)制研究中也以GSSH 作為陽(yáng)性對(duì)照。RK7 和GSSH 的分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示。在DS 軟件的Macromolecules 模塊中構(gòu)建肽的三維結(jié)構(gòu)，在Small molecules 模塊、CHARMm 力場(chǎng)下對(duì)其進(jìn)行能量最小化處理，以便后續(xù)的分子對(duì)接，其它參數(shù)均為默認(rèn)。

圖1 RK7 和GSSH 的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of RK7 and GSSH

1.2.3.2 準(zhǔn)備受體蛋白 參考楊小翠[3]的方法，從Protein Data Bank 數(shù)據(jù)庫(kù)（www.rcsb.org）中下載受體分子CD38 （NAD+降解酶，PDB ID：3DZK）和Keap1（胞質(zhì)接頭蛋白，PDB ID：2FLU）蛋白晶體的X 射線衍射三維結(jié)構(gòu)并作進(jìn)一步處理，具體處理方法參考文獻(xiàn)[18]1.2.3 節(jié)所述內(nèi)容。

1.2.3.3 分子對(duì)接 DS 軟件中的分子對(duì)接工具LibDock 適用于對(duì)功能肽快速精確的虛擬篩選[13]，因此本試驗(yàn)采用該方法，詳細(xì)步驟參考文獻(xiàn)[19]1.2.4 節(jié)所述內(nèi)容。

2 結(jié)果分析

2.1 RK7 體外合成與分析

采用固相合成技術(shù)合成牦牛乳硬質(zhì)干酪中的苦味肽RK7，經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)和HPLC 分析可知RK7的合成純度為99.579%，相對(duì)分子質(zhì)量理論值為：875.063 u，實(shí)際值為：875.25 u，分子質(zhì)量與理論值基本一致，達(dá)到了預(yù)期標(biāo)準(zhǔn)。預(yù)測(cè)計(jì)算RK7 的理化特性可知其等電點(diǎn)為11.57，凈電荷為3.1，不穩(wěn)定性指數(shù)為19.84（不穩(wěn)定性指數(shù)小于40，預(yù)示該肽可能是穩(wěn)定的），疏水性為42.86%，生物活性評(píng)分為0.404，顯示出良好的水溶性?？诜》肿由锘钚噪闹饕ㄟ^腸道吸收且生理屏障限制了大多數(shù)化合物，通過預(yù)測(cè)RK7 的ADMET 性質(zhì)發(fā)現(xiàn)其小腸吸收能力 （HIA） 為0.9072+（吸收率>30%），血腦屏障穿透能力（BBB）為0.9701-（透過性<30%），急性口腔毒性為0.6259（無(wú)毒）。因此可將其用于抗氧化活性測(cè)定試驗(yàn)。

圖2 合成肽RK7 基峰離子流色譜圖Fig.2 Base peak ion chromatogram of synthetic peptide RK7

2.2 RK7 抗氧化活性

圖3 合成肽RK7 高效液相色譜圖Fig.3 High performance liquid chromatogram for synthetic peptide RK7

表1 RK7 的HPLC 結(jié)果積分表Table 1 Score table for HPLC results about RK7

2.2.1 DPPH 自由基清除能力 苦味肽RK7 的DPPH 自由基清除率曲線為y=-40.49x2+99.39x-5.36 （R2=0.9957），GSSH 的DPPH 自由基清除率曲線為y =-54.06x2+ 117.95x-4.05 （R2=0.9946），RK7 和GSSH 的DPPH 自由基清除率IC50分別為0.85 mg/mL 和0.65 mg/mL。肽質(zhì)量濃度在0.2～1.0 mg/mL 范圍內(nèi)變化時(shí)，RK7 的DPPH自由基清除率范圍為12.26%～53.78%，GSSH 的DPPH 自由基清除率范圍為16.54%～60.58%?？辔峨腞K7 具有很好的DPPH 自由基清除能力，且DPPH 自由基清除能力隨著肽質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。

圖4 肽質(zhì)量濃度對(duì)DPPH 自由基清除率的影響Fig.4 The effect of peptide mass concentration on the scavenging rate of DPPH free radicals

2.2.2 ABTS 自由基清除能力 苦味肽RK7 的ABTS 自由基清除率曲線為y=-6.98x2+16.71x+78.02（R2=0.9826），GSSH 的ABTS 自由基清除率曲線為y =-11.76x2+ 29.96x + 78.81 （R2=0.9975）。肽質(zhì)量濃度在0.2～1.0 mg/mL 范圍內(nèi)變化時(shí)，RK7 的ABTS 自由基清除率范圍為80.86%～87.86%，GSSH 的ABTS 自由基清除率范圍為84.16%～97.12%，這說明苦味肽RK7 具有很強(qiáng)的ABTS 自由基清除能力，且ABTS 自由基清除能力隨著肽質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。

2.3 RK7 抗氧化機(jī)制

圖5 肽質(zhì)量濃度對(duì)ABTS 自由基清除率的影響Fig.5 The effect of peptide mass concentration on the scavenging rate of ABTS free radicals

2.3.1 尋找受體結(jié)合區(qū) 借助DS 軟件中的Define and Edit Binding Site 工具尋找受體中的空腔，以此來(lái)尋找受體中可能的結(jié)合部位。圖6a 為3DZK 的三維構(gòu)象，圖6b 為2FLU 的三維構(gòu)象，經(jīng)過處理后系統(tǒng)視圖中均自動(dòng)添加5 個(gè)結(jié)合位點(diǎn)（Site 1～5），即找到了5 個(gè)可能的結(jié)合區(qū)域。

圖6 受體結(jié)合區(qū)域圖Fig.6 Receptor binding region map

2.3.2 抗氧化肽分子對(duì)接的可視化分析

2.3.2.1 抗氧化肽抑制CD38 活性分析 RK7 與3DZK 對(duì)接后得到3 個(gè)對(duì)接構(gòu)象，其中Site 1 區(qū)域包含2 個(gè)對(duì)接構(gòu)象，Site 5 區(qū)域包含1 個(gè)對(duì)接構(gòu)象，最佳對(duì)接構(gòu)象位于Site 1 區(qū)域（X：-11.93，Y：-1.30，Z：0.38，R：10 ?），對(duì)接得分為166.69，結(jié)合能為20.88 kJ/mol，最佳對(duì)接構(gòu)象如圖7所示。

圖7 RK7 與3DZK 之間的相互作用圖Fig.7 Interaction map between RK7 and 3DZK

由圖可知，RK7 與3DZK 的氨基酸殘基Ile73（5.22 ?）、Arg140（4.14 ?）、Met142（6.93 ?）、Asp147（4.21 ?/3.92 ?）和Asp155（4.47 ?）之間形成了6個(gè)不同距離的氫鍵，其中RK7 和Asp147 氨基酸殘基之間含有2 個(gè)氫鍵；RK7 與氨基酸殘基Thr136（3.72 ?）、Gln137（3.49 ?）、Met142（6.95 ?）和Asp147（4.03 ?）形成范德華力或碳?xì)滏I，與氨基酸殘基Thr136（5.02 ?）形成Amide-Pi Stacked相互作用，與氨基酸殘基Val117 （5.09 ?）和Arg140（4.11 ?）形成Alkyl 相互作用，與氨基酸殘基His74（6.12 ?）、Arg140（4.98 ?）和Phe143（4.84 ?/5.00 ?）形成Pi-Alkyl 相互作用。

GSSH 與3DZK 對(duì)接后得到34 個(gè)對(duì)接構(gòu)象，其中Site 1 區(qū)域包含10 個(gè)對(duì)接構(gòu)象，Site 2 區(qū)域包含10 個(gè)對(duì)接構(gòu)象，Site 3 區(qū)域包含10 個(gè)對(duì)接構(gòu)象，Site 4 區(qū)域包含1 個(gè)對(duì)接構(gòu)象，Site 5 區(qū)域包含3 個(gè)對(duì)接構(gòu)象，最佳對(duì)接構(gòu)象位于Site 1 區(qū)域（X：-11.93，Y：-1.30，Z：0.38，R：10 ?），對(duì)接得分為158.35，結(jié)合能為2.93 kJ/mol，最佳對(duì)接構(gòu)象如圖8所示。

圖8 GSSH 與3DZK 之間的相互作用圖Fig.8 Interaction map between GSSH and 3DZK

由圖可知，GSSH 與3DZK 的氨基酸殘基Tyr70（6.14 ?）、Thr116（3.90 ?/4.06 ?）、Arg140（3.56 ?）和Asp147（4.62 ?）之間形成了5 個(gè)不同距離的氫鍵，其中GSSH 和Thr116 氨基酸殘基之間含有2 個(gè)氫鍵，與Arg140 之間形成的氫鍵最短，結(jié)合最緊密；GSSH 與氨基酸殘基His74（4.67 ?/4.77 ?）、Glu76 （5.28 ?）、Pro118 （4.26 ?） 和Asp155（3.39 ?）形成范德華力或碳?xì)滏I，與氨基酸殘基His74（5.73 ?/6.42 ?）形成Sulfur 相互作用。

2.3.2.2 抗氧化肽抑制Keap1 活性分析 RK7 與2FLU 對(duì)接后得到1 個(gè)對(duì)接構(gòu)象，該構(gòu)象位于Site 2 區(qū)域（X：8.33，Y：13.99，Z：20.41，R：9 ?），對(duì)接得分為108.15，結(jié)合能為20.88 kJ/mol，對(duì)接構(gòu)象如圖9所示。

圖9 RK7 與2FLU 之間的相互作用圖Fig.9 Interaction map between RK7 and 2FLU

由圖可知，RK7 與2FLU 的氨基酸殘基Val360 （3.80 ?）、Thr388 （4.51 ?/4.12 ?）、Ser390（3.88 ?）和Asp394（4.99 ?）形成5 個(gè)不同距離的氫鍵，其中RK7 和Thr388 氨基酸殘基之間含有2個(gè)氫鍵，與Val360 之間形成的氫鍵最短，結(jié)合最緊密；RK7 與氨基酸殘基Gln359 （3.43 ?）和Ser390（3.73 ?）形成范德華力或碳?xì)滏I，與氨基酸殘基Pro361（4.21 ?）形成Alkyl 相互作用。

GSSH 與2FLU 對(duì)接后得到16 個(gè)對(duì)接構(gòu)象，其中Site 2 區(qū)域包含6 個(gè)對(duì)接構(gòu)象，Site 5 區(qū)域包含10 個(gè)對(duì)接構(gòu)象，最佳對(duì)接構(gòu)象位于Site 2 區(qū)域（X：8.33，Y：13.99，Z：20.41，R：9 ?），對(duì)接得分為140.90，結(jié)合能為2.93 kJ/mol，最佳對(duì)接構(gòu)象如圖10所示。

圖10 GSSH 與2FLU 之間的相互作用圖Fig.10 Interaction map between GSSH and 2FLU

由圖可知，GSSH 與2FLU 的氨基酸殘基Gln359 （4.31 ?）、Arg362 （4.66 ?）、Asn381（3.28 ?）、Asp389 （5.69 ?）、Leu393 （4.98 ?/5.22 ?）、Asp394（4.30 ?/4.67 ?）和Cys406（3.57 ?）形成9 個(gè)不同距離的氫鍵，其中GSSH 與Leu393 和Asp394氨基酸殘基分別形成2 個(gè)氫鍵，與Asn381 之間形成的氫鍵最短，結(jié)合最緊密；GSSH 與氨基酸殘基Arg362（4.66 ?）、Thr388（3.53 ?）、Ser390（4.07 ?）和Cys406（4.87 ?）形成范德華力或碳?xì)滏I。

3 討論

肽的抗氧化性主要與其組成、結(jié)構(gòu)（氨基酸殘基結(jié)構(gòu)）和疏水性有關(guān)[20]。王波[21]利用Caco-2 細(xì)胞模型研究了肽組分的分子質(zhì)量大小、電荷性、疏水性對(duì)肽在小腸上皮細(xì)胞吸收轉(zhuǎn)運(yùn)以及生物利用度的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)肽組分分子質(zhì)量<1 000 u、帶有負(fù)電荷且是弱疏水性時(shí)，它的吸收率和抗氧化性保留率值高，而且生物利用度顯著。陳冠群[22]利用氧化還原滴定法（微量高錳酸鉀法、微量碘量法）和總抗氧化能力 （Total antioxidant capacity，TAOC）檢測(cè)試劑盒法測(cè)定了22 種氨基酸（包括胱氨酸和羥脯氨酸）的抗氧化活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)色氨酸（Trp）、甲硫氨酸（Met）、酪氨酸（Tyr）、組氨酸（His）、賴氨酸（Lys）、半胱氨酸（Cys）6 種氨基酸具有較強(qiáng)的抗氧化活性。此外，組氨酸（His）的咪唑基可以提供孤對(duì)電子給親電試劑（自由基），從而中和自由基，起到抗氧化作用[23]。精氨酸（Arg）能有效地提高機(jī)體總抗氧化能力，降低體內(nèi)自由基含量，抑制活性氧（ROS）的生成與積累，增強(qiáng)內(nèi)源性抗氧化酶【過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）等】活性，抑制氧化應(yīng)激的產(chǎn)生[24]。本試驗(yàn)RK7 的分子質(zhì)量為875.25 u，疏水性為42.86%，且表現(xiàn)出較好的生物學(xué)特性，RK7 序列中含有精氨酸 （Arg）、脯氨酸（Pro）、賴氨酸（Lys）、組氨酸（His）、異亮氨酸（Ile），個(gè)別氨基酸的抗氧化活性為RK7 具有抗氧化活性奠定了基礎(chǔ)。

本研究以GSSH 為陽(yáng)性對(duì)照，通過體外抗氧化活性測(cè)定試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RK7 具有較好的DPPH 和ABTS 自由基清除能力，其中RK7 的ABTS 自由基清除能力與Tonolo 等[6]研究的4 種合成肽ARHPHPHLSFM、AVPYPQR、NPYVPR 和KVLPVPEK 的ABTS 自由基清除能力基本一致。DPPH 和ABTS 自由基清除能力的不同趨勢(shì)可能歸因于兩種測(cè)定方法的不同作用機(jī)制和DPPH、ABTS 自由基特性差異，ABTS 法可用于親水性和親脂性抗氧化體系的評(píng)價(jià)，DPPH 法僅適用于疏水性多肽[14，25]。有研究表，明ABTS 自由基清除能力與抗氧化活性之間有直接聯(lián)系，半胱氨酸（Cys）、賴氨酸（Lys）、酪氨酸（Tyr）、甲硫氨酸（Met）、精氨酸（Arg）、苯丙氨酸（Phe）、組氨酸（His）、纈氨酸（Val）、色氨酸（Trp）具有ABTS 自由基清除能力[26]。

某些特定氨基酸有可能成為抗氧化肽的活性位點(diǎn)，包括親核性的含硫氨基酸半胱氨酸（Cys）和甲硫氨酸（Met），芳香族氨基酸色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe），以及含咪唑基的氨基酸組氨酸（His）等[27]。分子對(duì)接可虛擬模擬分子間的相互作用，本試驗(yàn)通過分子對(duì)接研究發(fā)現(xiàn)，RK7能與3DZK 的氨基酸殘基Met142 形成氫鍵、碳?xì)滏I或范德華力，與His74 和Phe143 形成Pi-Alkyl相互作用；GSSH 能與3DZK 的氨基酸殘基Tyr70形成氫鍵，與His74 形成范德華力、碳?xì)滏I或Sulfur 相互作用；GSSH 能與2FLU 的氨基酸殘基Cys406 形成氫鍵、碳?xì)滏I或范德華力。氫鍵相互作用對(duì)穩(wěn)定對(duì)接絡(luò)合物和酶催化反應(yīng)起著最重要的作用[28]。3DZK 與RK7 和GSSH 分別形成6 個(gè)和5個(gè)氫鍵，其中3DZK 的氨基酸殘基Arg140 和Asp147 是RK7 和GSSH 與3DZK 形成氫鍵的共同結(jié)合位點(diǎn)，RK7 與GSSH 表現(xiàn)出相同的作用機(jī)制，共同結(jié)合于3DZK 的Site 1 區(qū)域；2FLU 與RK7 和GSSH 分別形成5 個(gè)和9 個(gè)氫鍵，其中2FLU 的氨基酸殘基Asp394 是RK7 和GSSH 與2FLU 形成氫鍵的共同結(jié)合位點(diǎn)，Ser390 是RK7和GSSH 與2FLU 形成范德華力或碳?xì)滏I的共同結(jié)合位點(diǎn)，RK7 與GSSH 表現(xiàn)出相同的作用機(jī)制，共同結(jié)合于2FLU 的Site 2 區(qū)域。綜上可以確定RK7 主要通過調(diào)節(jié)SIRT1-7 和AMPK 信號(hào)通路發(fā)揮抗氧化作用。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)以牦牛乳硬質(zhì)干酪苦味肽RK7 為研究對(duì)象，經(jīng)BIOPEP 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)RK7 與數(shù)據(jù)庫(kù)中抗氧化活性已知肽序列的最高相似度為0，所以推測(cè)RK7 為新型抗氧化肽；通過生物信息學(xué)網(wǎng)址提供的軟件計(jì)算和預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)RK7 表現(xiàn)出較好的生物學(xué)特性，經(jīng)體外人工合成后測(cè)定其抗氧化活性，結(jié)果顯示RK7 具有較強(qiáng)的DPPH 和ABTS 自由基清除能力；而后基于分子對(duì)接技術(shù)研究RK7 在SIRT1-7 和AMPK 信號(hào)通路介導(dǎo)下的抗氧化機(jī)制，結(jié)果表明RK7 均能和3DZK、2FLU形成穩(wěn)定的配體-受體復(fù)合物構(gòu)象，RK7 與GSSH表現(xiàn)出相似的作用機(jī)制，均結(jié)合于3DZK 和2FLU的活性空腔內(nèi)。本試驗(yàn)僅局限于體外模擬，為更全面體現(xiàn)RK7 的抗氧化活性，下一步可將純化肽進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)模擬實(shí)驗(yàn)，為RK7 的深入應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。