沙門氏菌噬菌體SM-p2內(nèi)溶酶及穿孔素的生物信息學(xué)分析和克隆表達(dá)

戚 斌，解天慧，石 慧

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院 重慶 400715）

沙門氏菌是一種常見(jiàn)的食源性致病菌，人們?cè)谑秤檬芪廴镜娜忸?、牛奶和雞蛋時(shí)可能感染沙門氏菌，導(dǎo)致嘔吐、腹瀉、發(fā)燒、頭痛，甚至死亡[1]。2019年，歐洲確診了近88 000 例人類沙門氏菌病病例。在美國(guó)，沙門氏菌每年導(dǎo)致大約135 萬(wàn)人感染、26 500 人住院和420 人死亡。在中國(guó)，80%～90%的食源性細(xì)菌中毒事件是由沙門氏菌引起的[2-3]。為了避免沙門氏菌對(duì)食品安全造成嚴(yán)重的影響，人們采取積極的措施來(lái)預(yù)防和控制。例如，使用有機(jī)酸、水蒸氣等傳統(tǒng)的方法來(lái)殺滅食品表面的沙門氏菌，然而，這樣會(huì)改變食品的感官特性，而且還有可能在食品上造成有毒、有害物質(zhì)的殘留[4]。利用抗生素來(lái)殺滅沙門氏菌容易造成耐藥菌的出現(xiàn)，對(duì)沙門氏菌的控制造成極大的挑戰(zhàn)[5]。尋找新型的抗菌物質(zhì)已刻不容緩。

近些年來(lái)，由于噬菌體具有無(wú)毒，特異性高，裂解性強(qiáng)和抗耐藥性等優(yōu)良特點(diǎn)，已作為一種新型的生物抑菌劑被大量研究[6-7]。目前噬菌體已開始應(yīng)用于清除食品中致病菌，然而，在噬菌體制劑的研發(fā)中存在一些缺陷或不足，如作為活體病毒，噬菌體常常不被人們接受以及一些噬菌體對(duì)于耐藥基因的傳播等[8]。內(nèi)溶酶和穿孔素不僅保留了噬菌體的抑菌作用，而且細(xì)菌還很難對(duì)內(nèi)溶酶和穿孔素產(chǎn)生抗性，可很好地解決噬菌體制劑存在的不足和缺陷。

內(nèi)溶酶和穿孔素是一種存在于dsDNA 噬菌體中，對(duì)細(xì)菌具有裂解活性的蛋白[9]。內(nèi)溶酶和穿孔素可直接裂解細(xì)菌細(xì)胞壁或細(xì)胞膜[10]。內(nèi)溶酶能夠降解細(xì)菌的肽聚糖，使細(xì)菌裂解死亡；穿孔素能在細(xì)菌質(zhì)膜上形成小孔，協(xié)助內(nèi)溶酶降解肽聚糖。無(wú)毒、高效抑菌、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，使內(nèi)溶酶和穿孔素開始應(yīng)用于食品安全和醫(yī)藥等各個(gè)方面[11-12]。

本研究利用十聚體寡核苷酸隨機(jī)引物對(duì)前期分離的一株烈性沙門氏菌噬菌體SM-p2 的DNA進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增并鑒定，利用鑒定結(jié)果設(shè)計(jì)內(nèi)溶酶Lys 2 與穿孔素Hol 2 的引物并確定它們的基因。通過(guò)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)該噬菌體內(nèi)溶酶結(jié)構(gòu)和特征，最后通過(guò)基因克隆表達(dá)得到內(nèi)溶酶Lys 2和穿孔素Hol 2。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

SM-p2 為烈性噬菌體，保存于本實(shí)驗(yàn)室；pEASY-Blunt E1 大腸桿菌表達(dá)試劑盒、感受態(tài)大腸桿菌Trans1-T1、BL21 （DE3）、膠回收試劑盒、Ni-IDA 填料，北京全式金生物有限公司；T 載體PCR 產(chǎn)物克隆試劑盒，上海生工生物工程股份有限公司。RNase A、DNaseI、乙二胺四乙酸（EDTA）、蛋白酶K，索萊寶生物技術(shù)有限公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。本試驗(yàn)所用引物見(jiàn)表1。

表1 本試驗(yàn)所用引物序列Table 1 Primers sequence in this research

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平，Sartorius 公司；2720 Thermal CyclerPCR 儀，AppliedBiosystems 公司；DYY-8C 電泳儀，北京六一生物科技有限公司；JY88-IIN 超聲細(xì)胞粉碎儀，寧波新芝生物科技有限公司；011005酶標(biāo)儀，Biotek 公司；Bio-rad ChemiDoc XRS+019900 化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)，Biorad 公司；DK-8D 水浴鍋，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；UV-1600 紫外-可見(jiàn)分光光度儀，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；5810R 冷凍高速離心機(jī)，Eppendorf公司；MX-F 微型渦旋混合儀，上海瀘西分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 噬菌體SM-p2 DNA 的提取 噬菌體懸浮液首先用RNase A（5 μg/mL）和DNaseI（2 U/mL）在37 ℃下處理30 min，然后在80 ℃下孵育15 min 使DNase I 失活。純化的噬菌體被蛋白酶K（50 μg/mL）于56 ℃下處理1 h，輔以SDS（0.5%）和EDTA（20 mmol/L）。加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1），混合并在4 ℃下以12 000×g 離心20 min。轉(zhuǎn)移上清液并與等體積的異丙醇混合并保持在-20 ℃過(guò)夜。離心后，用冰冷的75%乙醇洗滌沉淀3 次。最后，將顆粒風(fēng)干，溶解在50 μL TE緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl；1 mmol/L EDTA，pH 8）中并儲(chǔ)存在-20 ℃。

1.3.2 噬菌體SM-p2DNA 的隨機(jī)擴(kuò)增 以噬菌體SM-p2 的DNA 為模板，用引物287、277、275、272、270、241、228 和208 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增體系：Taq 聚合酶（5 U/μL）0.25 μL、10xPCR 緩沖 液2.5 μL、dNTPs （2.5mmol/L）2.5 μL、ddH2O 17.5 μL、模板DNA 0.5 μL、MgCl21.3 μL、上下游引物各1 μL。PCR 擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，34 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸2 min，共30 個(gè)循環(huán)。選擇第1 次擴(kuò)增結(jié)果中又少又亮的條帶進(jìn)行再擴(kuò)增，將第2 次擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物回收后進(jìn)行TA 克隆并測(cè)序。測(cè)得的序列在NCBI 上進(jìn)行相似性比對(duì)（Blastn）。

1.3.3 噬菌體SM-p2 內(nèi)溶酶 （Lys 2） 和穿孔素（Hol 2） 基因的確定 將上述隨機(jī)二次擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的核酸序列在NCBI 上進(jìn)行相似性比對(duì)，選取Blast 比對(duì)結(jié)果中同源率最高的噬菌體的內(nèi)溶酶和穿孔素基因設(shè)計(jì)引物。獲得4 條引物，即Hol 2 的上下游引物（Lys 2 的上下游引物），以SM-p2的DNA 為模板，結(jié)合Hol 2 的上游引物和Hol 2下游引物（Lys 2 上游引物引物和Lys 2 的下游引物）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增體系：Taq 聚合酶（5 U/μL）0.3 μL、10xPCR 緩沖液5 μL、dNTPs（2.5 mmol/L） 1 μL、ddH2O 35.2 μL、模 板DNA 0.5 μL、MgCl24 μL、上下游引物各2 μL。PCR 擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30s，50 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，共30 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。

1.3.4 Lys 2 與Hol 2 的生物學(xué)信息分析 分別利用 SOPMA、ExPASy ProtParamtool、TMHMM Server v.2.0 和Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)SM-p2 內(nèi)溶酶和穿孔素的二級(jí)結(jié)構(gòu)、理化特征、跨膜結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用PyMOL 內(nèi)溶酶和穿孔素的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化。

1.3.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化 將內(nèi)溶酶Lys 2或穿孔素Hol 2 基因片段與載體質(zhì)粒pEasy-Blunt E1 以物質(zhì)的量比7∶1 的比例加入離心管中，在室溫下反應(yīng)8 min 后，將試管置于冰上冷卻。加連接產(chǎn)物于剛解凍好的50 μL Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，在含有卡那霉素的抗性平板上進(jìn)行篩選，以T7 promoter primer 和目的基因的下游引物進(jìn)行菌落PCR 挑選陽(yáng)性菌，將的陽(yáng)性菌提取質(zhì)粒后送至測(cè)序公司測(cè)序。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）感受態(tài)大腸桿菌。

1.3.6 Lys 2 與Hol 2 的誘導(dǎo)表達(dá)與純化 將含有pEASY-Lys 2、pEASY-Hol 2 重組質(zhì)粒的大腸感受態(tài)細(xì)胞接種到含有卡那霉素抗性（0.1 μg/mL）的LB 肉湯培養(yǎng)基，200 r/min、37 ℃培養(yǎng)至OD600nm在0.5 左右。分別加入終濃度為0.1，0.5，1，2，5 mmol/L 的異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)。在200 r/min、37 ℃的條件下誘導(dǎo)表達(dá)5 h。取誘導(dǎo)后的菌液6 000 r/min 離心10 min，收集細(xì)菌沉淀；將沉淀重懸于100 mL 無(wú)菌的PBS 緩沖液中，冰浴下超聲破碎，待溶液變得澄清后，10 000 r/min 離心1 h，收集上清；使用0.45 μm 的濾膜過(guò)濾得上清液。利用鎳親和柱純化過(guò)濾后的上清，將過(guò)濾后的上清液加入柱子，上清液自然流出并收集穿透液。再用25 mL Tris-NaCl 緩沖液清洗柱子并收集洗滌液后，使用濃度分別為20 mmol/L 和50 mmol/L 的咪唑洗脫雜蛋白，收集洗脫液。再分別用200 mmol/L 和500 mmol/L 咪唑?qū)δ康牡鞍走M(jìn)行洗脫。取36 μL 純化好的目標(biāo)蛋白洗脫液與4 μL 4×SDS-PAGE 上樣緩沖液混和，用水浴鍋在100 ℃下水浴3～5 min 充分混勻，得蛋白凝膠電泳上樣液，進(jìn)行蛋白凝膠電泳。NanoDrop 紫外分光光度計(jì)用于檢測(cè)蛋白濃度。

1.3.7 Hol 2 表達(dá)對(duì)BL21（DE3）的生長(zhǎng)的毒害作用 分別挑取含有pEASY-Hol 2、pEASY-Lys 2和pEASY-Blunt E1 重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒的到10 mL 含卡那霉素的LB 肉湯培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)至OD600nm在0.4～0.6 后，最終在200 r/min，37 ℃條件下加入終濃度為1 mmol/L 的IPTG 誘導(dǎo)培養(yǎng)2 h。定期檢測(cè)菌液濁度，時(shí)間間隔為20 min，以描述大腸桿菌BL21（DE3）的生長(zhǎng)趨勢(shì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體SM-p2DNA 的隨機(jī)擴(kuò)增及Lys 2 與Hol 2 基因的確定

如圖1b 所示，噬菌體SM-p2 DNA 的隨機(jī)擴(kuò)增產(chǎn)物具有多樣性，引物208 在泳道1 中的PCR產(chǎn)物條帶少且亮，選擇泳道1 中的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行再擴(kuò)增。最終回收到一段700～800 bp 的DNA 片段 （圖1c）。將回收的這段DNA 測(cè)序，再進(jìn)行Blastn 比對(duì)。Blast 比對(duì)結(jié)果顯示，沙門氏菌噬菌體Sepoy 的核苷酸還原酶與隨機(jī)擴(kuò)增的SM-p2 DNA片段同源率最高，為72.12%。根據(jù)沙門氏菌噬菌體Sepoy 內(nèi)溶酶和穿孔素的DNA 序列設(shè)計(jì)引物。將設(shè)計(jì)好的引物，以SM-p2 的DNA 為模板進(jìn)行PCR。所圖1d 所示，得到SM-p2 內(nèi)溶酶Lys 2 的基因片段，大小在800 bp 左右；得到SM-p2 穿孔素Hol 2 的基因片段，大小在700 bp 左右。

圖1 Lys 2 與Hol 2 基因的PCR 擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of gene of Lys 2 and Hol 2

2.2 Lys 2 和Hol 2 的生物學(xué)信息分析

2.2.1 噬菌體SM-p2 內(nèi)溶酶和穿孔素的二級(jí)結(jié)構(gòu) 如圖2所示，Lys 2 和Hol 2 的主要二級(jí)結(jié)構(gòu)都為α-螺旋，分別占氨基酸總數(shù)的56.06%和41.64%；Lys 2 和Hol 2 中第2 豐富的結(jié)構(gòu)是無(wú)規(guī)則卷曲，分別占氨基酸總數(shù)的29.17%和39.35%。在2 種蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中均未發(fā)現(xiàn)β-折疊。延長(zhǎng)鏈和β-轉(zhuǎn)角在Lys 2 和Hol 2 占氨基酸總數(shù)含量較少。由于Lys 2 和Hol 2 的二級(jí)結(jié)構(gòu)中很少有層狀結(jié)構(gòu)，且主要二級(jí)結(jié)構(gòu)為α-螺旋結(jié)構(gòu)，因此可以推斷Lys 2 和Hol 2 具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)[14]。

圖2 Lys 2 和Hol 2 二級(jí)結(jié)構(gòu)的可視化Fig.2 Visualization of secondary structure of Lys 2 and Hol 2

2.2.2 Lys 2 與Hol 2 的特性預(yù)測(cè) 一般來(lái)說(shuō)，不穩(wěn)定系數(shù)小于40 表示蛋白質(zhì)是穩(wěn)定的[15]。如表2所示，Lys 2 和Hol 2 的分子質(zhì)量分別是24.51 ku和28.66 ku，且不穩(wěn)定系數(shù)都低于40。

表2 Lys 2 和Hol 2 的理化性質(zhì)Table 2 The physicochemical properties of Lys 2 and Hol 2

2.2.3 Lys 2 與Hol 2 的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 對(duì)噬菌體SM-p2 內(nèi)溶酶和穿孔素的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)（圖3） 結(jié)果顯示，穿孔素Hol 2 在N 端在21～38位氨基酸形成一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，39～150 位氨基酸處于胞外，1～27 位氨基酸處于胞內(nèi)；內(nèi)溶酶Lys 2 在150～200 之間由于螺旋程度較低最終并未形成跨膜結(jié)構(gòu)。

圖3 內(nèi)溶酶Lys 2 的跨膜結(jié)構(gòu)（a）和穿孔素Hol 2 的跨膜結(jié)構(gòu)（b）Fig.3 The transmembrane structure of endolysin Lys 2 （a） and holin Hol 2 （b）

2.2.4 Lys 2 與Hol 2 的結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè) 如圖4a 所示，噬菌體SM-p2 的內(nèi)溶酶Lys 2 由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD）和一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域（EDA），CBD 的主要位點(diǎn)是肽聚糖，EDA 起裂解細(xì)菌的作用，其本質(zhì)屬于N-乙酰胞壁酸酶，能裂解β-1，4-糖苷鍵。如圖4b 所示噬菌體SM-p2 的穿孔素Hol 2，含有一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，其主要作用是進(jìn)行信息調(diào)節(jié)和破壞細(xì)菌細(xì)胞。

圖4 內(nèi)溶酶Lys 2（a）和穿孔素Hol 2（b）的結(jié)構(gòu)域Fig.4 Endolysin Lys 2 （a） and holin Hol 2 （b）structure domain

2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pEASY-Lys 2 和pESAYHol 2 來(lái)表達(dá)Lys 2 與Hol 2 功能蛋白。結(jié)果如圖5所示，菌落PCR 產(chǎn)物在泳道1 和泳道2 有明顯的條帶，大小分別為700 bp 和800 bp 左右，這與Hol 2 和Lys 2 基因大小一致，表明目的基因成功插入到了質(zhì)粒中，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖5 菌落PCR 產(chǎn)物Fig.5 PCR products of colony

2.4 Lys 2 與Hol 2 的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

向含pEASY-Lys 2、pEASY-Hol 2 的菌液和含空載體pEASY 的菌液中加入IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白以及純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分析，結(jié)果顯示，0.1，0.5，1，2，5 mmol/L 的IPTG 均能誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，其中Lys 2 在1 mmol/L 和2 mmol/L 的濃度下表達(dá)量最高，在26 ku 到33 ku左右出現(xiàn)明顯條帶 （圖6a）；在0.1～5 mmol/L 的IPTG 濃度范圍內(nèi)，加入的IPTG 濃度對(duì)Hol 2 的誘導(dǎo)表達(dá)無(wú)明顯影響，都能在20 ku 到25 ku 附近出現(xiàn)明顯條帶。作為陰性對(duì)照的質(zhì)粒空載蛋白在相應(yīng)位置并未出現(xiàn)明顯的條帶，表明Lys 2 與Hol 2 在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中的成功表達(dá) （圖6b）。

圖6 不同濃度IPTG 誘導(dǎo)內(nèi)溶酶Lys 2（a）和穿孔素Hol 2（b）表達(dá)Fig.6 Different concentrations of IPTG induce expression of Lys 2 （a） and Hol 2 （b）

如圖7，SDS-PAGE 電泳圖所示，Lys 2 能夠在鎳親和柱中被200 mmol/L 咪唑大量洗脫并純化 （圖7a，泳道8），Hol 2 能夠在鎳親和柱中被500 mmol/L 咪唑大量洗脫并純化（圖7b，泳道6），且只在與目標(biāo)蛋白分子質(zhì)量大小一致的位置出現(xiàn)唯一清晰的條帶。經(jīng)檢測(cè)，Lys 2 和Hol 2 的質(zhì)量濃度分別為5.419 mg/mL 和2.191 mg/mL。

圖7 內(nèi)溶酶Lys 2（a）和穿孔素Hol 2（b）的純化Fig.7 Purification of Lys 2 （a） and Hol 2 （b）

2.5 Hol 2 表達(dá)對(duì)BL21（DE3）的生長(zhǎng)的毒害作用

穿孔素具有直接裂解細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)膜的功能，可能對(duì)表達(dá)細(xì)菌產(chǎn)生毒害。如圖8所示，隨著時(shí)間的增加，BL21（DE3）+pEASY-Blunt E1（對(duì)照組）的菌液OD600nm值顯著高于BL21（DE3）+ pEASYHol 2 的菌液OD600nm值，說(shuō)明穿孔素Hol 2 的表達(dá)抑制了細(xì)菌的生長(zhǎng)。Hol 2 的表達(dá)雖能夠抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，但不能降低菌液的濃度，并在表達(dá)80 min 后菌液濃度趨于穩(wěn)定，說(shuō)明Hol 2 在加入IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)的后的第80 分鐘表達(dá)量趨于穩(wěn)定，故Hol 2 的最佳表達(dá)時(shí)間為80 min。此外，BL21 （DE3） + pEASY-Lys 2 在不同時(shí)間菌液OD600nm值與對(duì)照組無(wú)顯著性差異，說(shuō)明內(nèi)溶酶Lys 2 的表達(dá)不會(huì)抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。

圖8 內(nèi)溶酶和穿孔素表達(dá)對(duì)大腸桿菌BL21（DE3）生長(zhǎng)的抑制作用Fig.8 Inhibition of expression of endolysin and holin on growth of BL21 （DE3）

3 結(jié)論

噬菌體編碼的、有抑菌作用的內(nèi)溶酶和穿孔素，可作為一種新型抑菌劑控制食品中的病原菌。本研究對(duì)篩選的SM-p2 噬菌體進(jìn)行了初步的鑒定，結(jié)果表明，噬菌體SM-p2 的DNA 片段與沙門氏菌噬菌體Sepoy 的同源率最高為72.12%。生物信息公共數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，沙門氏菌噬菌體Sepoy 是一種含雙鏈DNA 的肌尾科噬菌體。因此，SM-p2可能也是一種雙鏈DNA 噬菌體。內(nèi)溶酶和穿孔素一般存在于雙鏈DNA 噬菌體的尾刺上可以破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，使噬菌體的DNA 注入宿主細(xì)菌，對(duì)細(xì)菌具有很強(qiáng)的裂解活性，如T4 噬菌體[16]。

雙鏈DNA 噬菌體的內(nèi)溶酶是一種高效的革蘭氏陽(yáng)性裂解酶，它具有無(wú)毒、高特異性、不易產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性等特點(diǎn)[17]。內(nèi)溶酶具有模塊化結(jié)構(gòu)域，一般由細(xì)胞壁識(shí)別結(jié)構(gòu)域（CBD）和催化結(jié)構(gòu)域（EDA） 兩部分組成，CBD 能夠識(shí)別細(xì)菌，EDA能夠裂解細(xì)菌死亡[18]。內(nèi)溶酶的結(jié)構(gòu)域決定了能夠裂解的宿主范圍，一般既有CBD 又有EDA 的內(nèi)溶酶宿主范圍小，僅有一個(gè)球狀催化結(jié)構(gòu)域的內(nèi)溶酶能裂解多種細(xì)菌，甚至是革蘭氏陰性細(xì)菌[19]。也有研究表明，有的內(nèi)溶酶不止一個(gè)CBD或EDA[20-21]?？缒そY(jié)構(gòu)對(duì)于穿孔素傳遞信息和控制細(xì)菌裂解時(shí)間具有重要的意義[22]。Lys 2 的生物信息學(xué)顯示，Lys 2 具有典型的內(nèi)溶酶結(jié)構(gòu)，即由一個(gè)CBD 和一個(gè)EDA 組成，既可以識(shí)別具有特定結(jié)構(gòu)的細(xì)菌又能對(duì)結(jié)合到細(xì)菌造成裂解。Hol 2有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，用于傳遞信息和裂解細(xì)胞膜。

本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了Lys 2和Hol 2，IPTG 誘導(dǎo)Lys 2 和Hol 2 表達(dá)的最佳濃度為1 mmol/L，在此濃度下誘導(dǎo)表達(dá)和純化最終獲得5.419 mg/mL 的內(nèi)溶酶溶液。穿孔素Hol2在未誘導(dǎo)之前少量表達(dá)，雖抑制了BL21（DE3）的生長(zhǎng)，但并不能降低菌液濃度，在用IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)80 min 后菌液濃度不在變化，因此穿孔素Hol 2 的最佳表達(dá)時(shí)間是80 min，純化后的穿孔素Hol 2 質(zhì)量濃度為2.191 mg/mL。