菊淀粉型巴戟天寡糖對(duì)慢性應(yīng)激模型小鼠抑郁、焦慮樣行為的改善及對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量的調(diào)節(jié)作用

王 軼，郭婷婷，尹勇玉，張黎明，張紀(jì)巖，李云峰，

（軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院1.毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2.軍事認(rèn)知與腦科學(xué)研究所，北京 100850）

抑郁癥是以情緒低落、興趣減退、絕望無助并伴隨認(rèn)知功能受損、睡眠或食欲紊亂等為特征的綜合征。據(jù)世界衛(wèi)生組織2019年調(diào)查報(bào)告顯示，抑郁癥是患病率最高的精神疾病，是世界范圍內(nèi)致殘的主要原因［1-2］。目前臨床一線抗抑郁藥物主要為選擇性5-羥色胺重?cái)z取抑制和5-羥色胺和去甲腎上腺素雙重重?cái)z取抑制劑等，但這些藥物僅對(duì)約1/3患者有效，起效通常存在2～3周延遲，且常伴有認(rèn)知損害等不良反應(yīng)［3］。

研究發(fā)現(xiàn)，一些中藥提取物具有抗抑郁作用，如刺五加苷、金絲桃素和靈芝多糖等［4］。巴戟天為茜草科植物巴戟天（Morinda officinalis How.）的干燥根，具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕功效。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)巴戟天具有抗抑郁作用［5］，從中提取出水溶性菊淀粉型低聚寡糖——菊淀粉型巴戟天寡糖（inulin-type oligosaccharides of M.officinalis，IOMO），并證實(shí)其為巴戟天抗抑郁作用的主要活性部位［6］。進(jìn)一步研究表明，IOMO兼具增強(qiáng)免疫［7］和調(diào)節(jié)睡眠［8］等作用。IOMO結(jié)構(gòu)上屬于益生元［9］，即一類可在體內(nèi)產(chǎn)生有益作用，但不能被機(jī)體直接消化吸收的物質(zhì)，其抗抑郁具體機(jī)制至今不明。研究發(fā)現(xiàn)，IOMO具有改善神經(jīng)營養(yǎng)和保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用［10］，口服生物利用度低，需要經(jīng)腸道菌群快速降解，且其水解規(guī)律較復(fù)雜［11］。IOMO的抗抑郁作用可能是其與腸道菌群相互作用的結(jié)果，即依賴于菌群-腸-腦軸［9，12］。神經(jīng)、免疫和體液三大途徑是腸-腦間進(jìn)行信息溝通的主要通路［13］。巴戟天在中醫(yī)上的強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕功效，以及IOMO增強(qiáng)免疫的作用都提示IOMO可能通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫發(fā)揮抗抑郁作用。

近年來，抑郁癥與免疫系統(tǒng)功能紊亂之間的關(guān)系備受關(guān)注，大多數(shù)研究主要針對(duì)免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子在抑郁癥發(fā)病和治療過程中的作用［14］。抑郁癥患者血腦屏障通透性增加［15］，外周免疫細(xì)胞可進(jìn)入中樞，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生重要影響。其中，抑郁癥患者外周調(diào)節(jié)性T（regulatory T，Tr）細(xì)胞可能通過下調(diào)慢性炎癥反應(yīng)在抑郁癥中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［16］。研究表明，小鼠全身性耗竭Tr細(xì)胞后可表現(xiàn)出抑郁樣行為［17］，尾靜脈注射給予少量Tr細(xì)胞刺激劑可改善抑郁樣行為［18］，因此，Tr細(xì)胞可能成為新的抑郁癥治療靶點(diǎn)［19］。腸道和脾是2個(gè)重要的免疫器官，菌群-腸-腦軸和腦-脾軸與中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周免疫系統(tǒng)之間的聯(lián)系有關(guān)，抗抑郁藥物可通過靶向腸道和脾的免疫細(xì)胞（如Tr細(xì)胞）調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)功能，進(jìn)而改善神經(jīng)炎癥，以發(fā)揮抗抑郁作用［4］。

本研究擬采用小鼠慢性不可預(yù)知應(yīng)激（chronic unpredictable stress，CUS）模型，以選擇性5-羥色氨重?cái)z取抑制劑氟西?。╢luoxetine，F(xiàn)LX）作為陽性對(duì)照藥。探究IOMO在發(fā)揮抗抑郁作用的同時(shí)，對(duì)CUS模型小鼠小腸上皮和脾組織中Tr細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，并探索Tr細(xì)胞數(shù)目與抑郁樣行為的相關(guān)性，旨在為探索抗抑郁藥物的新靶點(diǎn)和新機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和儀器

IOMO原料藥（批號(hào)：20210501），北京同仁堂股份有限公司提供，主要制備過程：巴戟天經(jīng)水提、活性炭吸附、水洗，乙醇洗脫、濃縮、噴霧干燥得到IOMO成分穩(wěn)定可靠，經(jīng)化學(xué)及波譜學(xué)鑒定［20］，IOMO原料藥中3～9聚寡糖含量53%～70%，其中5聚糖含量≥6%。FLX原料藥（批號(hào)：H1929183，純度>98%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司。胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS），天津康源生物公司；DTT、RPMI-1640培養(yǎng)基、HEPPS和HBSS緩沖液，美國Gibco公司；Permeabilization透化液、Fixation/Perm Diluent固定液和計(jì)數(shù)微球，美國eBio-science公司；Percoll分離液，美國GE公司；Percp-抗CD45、FITC-抗CD4，APC-抗CD25和PE-抗Foxp3，美國Bio-legend公司。電子分析天平，德國Sartorius公司；小鼠開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱及小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)觀察箱，深圳市瑞沃德生命科技有限公司；BD FACSAiraⅡ型流式細(xì)胞儀，美國BD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)8周齡雄性C57BL/6J小鼠，體重20～24 g，購于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0002。每籠5只飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～24℃，濕度40%～60%，光照時(shí)間8∶00～20∶00，動(dòng)物自由攝食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開始實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合倫理學(xué)以及動(dòng)物福利要求，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理批準(zhǔn)號(hào)：IACUC-DWZX-2022-523。

1.3 小鼠CUS模型建立

小鼠測(cè)定基礎(chǔ)蔗糖偏嗜度（詳見1.4.1）后，按蔗糖偏嗜度均衡分為4組：正常對(duì)照組、CUS模型組、CUS+FLX 10 mg·kg-1組和 CUS+IOMO 50 mg·kg-1組，每組12只。除正常對(duì)照組外，其余組連續(xù)28 d每天2或3種隨機(jī)給予以下刺激：夾尾1 min、禁食12 h、禁水12 h、45℃傾斜飼養(yǎng)12 h、通宵照明12 h、潮濕飼養(yǎng)12 h、頻閃（100 min-1）加白噪聲（110 dB）2 h、強(qiáng)迫游泳（水溫15℃）5 min、束縛2 h，應(yīng)激程序符合不可預(yù)測(cè)性的特點(diǎn)，并于應(yīng)激當(dāng)天（第0天）開始ig給藥，每天1次，連續(xù)給藥28 d。實(shí)驗(yàn)流程見圖1。

Fig.1 Schedule of treatment and behavioral tests for chronic unpredictable stress（CUS）model in mice.Except for the normal control group，the depression model was prepared by giving CUS stimuli to the remaining groups for 28 consecutive days.Mice were ig given fluoxetine（FLX，10 mg·kg-1），inulin-type oligosaccharides of M.officinalis（IOMO，50 mg·kg-1）or water（control and CUS model groups）from the first day of the CUS procedure once per day for 28 d.SPT：sucrose preference test；OFT：open field test；FST：forced swimming test；NSF：novel inhibition feeding test.

1.4 行為學(xué)評(píng)價(jià)

1.4.1 蔗糖偏嗜實(shí)驗(yàn)（sucrose preference test，SPT）

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后進(jìn)行訓(xùn)練：?jiǎn)位\飼養(yǎng)，同時(shí)給予2個(gè)裝有1%蔗糖水的飲水瓶飼養(yǎng)24 h，再同時(shí)給予2個(gè)裝有純凈水的飲水瓶飼養(yǎng)24 h。訓(xùn)練后正常飼養(yǎng)24 h，再次禁水24 h，然后進(jìn)行蔗糖偏嗜度測(cè)定：同時(shí)給予小鼠1%蔗糖水和純凈水各1瓶，檢測(cè)12 h內(nèi)蔗糖水和純凈水的飲用量（g），計(jì)算蔗糖偏嗜度。蔗糖偏嗜度（%）=蔗糖水飲用量/（蔗糖水飲用量+純凈水飲用量）×100%。初次測(cè)量的基礎(chǔ)蔗糖偏嗜度作為小鼠均衡分組的依據(jù)。于應(yīng)激第28天再次測(cè)定蔗糖偏嗜度，反映小鼠抑郁樣行為。

1.4.2 開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（open field test，OFT）

于應(yīng)激第29天進(jìn)行OFT。小鼠置實(shí)驗(yàn)箱（60 cm×60 cm×16 cm，底部等分為16小格）的角落，自由活動(dòng)5 min，記錄小鼠跨格數(shù)（四肢全部跨進(jìn)同一格子）和運(yùn)動(dòng)總距離，以反映小鼠的自發(fā)活動(dòng)。同時(shí)記錄5 min內(nèi)小鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)（中間4格）的累計(jì)時(shí)間和次數(shù)，以反映小鼠的焦慮樣行為。

1.4.3 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)（forced swimming test，F(xiàn)ST）

于應(yīng)激第30天進(jìn)行FST。將小鼠置高20 cm、直徑12 cm、水深10 cm的圓形玻璃容器中，水溫25℃，觀察6 min，記錄后4 min的累計(jì)不動(dòng)時(shí)間。判定不動(dòng)的標(biāo)準(zhǔn)是動(dòng)物在水中停止掙扎，呈漂浮狀態(tài)，僅有細(xì)小的肢體運(yùn)動(dòng)以保持頭部浮在水面。

1.4.4 新奇抑制攝食實(shí)驗(yàn)（novel inhibition feeding test，NSF）

于應(yīng)激第31天進(jìn)行NSF。于安靜、強(qiáng)光且陌生的環(huán)境下，將小鼠置陌生的實(shí)驗(yàn)箱一角，箱內(nèi)底部鋪2 cm厚的鋸末，中央擺放6個(gè)同樣大小的食丸。放入小鼠的同時(shí)開始計(jì)時(shí)，記錄5 min內(nèi)開始攝食的潛伏期。攝食的判定標(biāo)準(zhǔn)是動(dòng)物開始發(fā)出啃咬食物的聲音，而不是僅僅嗅聞或擺弄食物。攝食潛伏期可作為評(píng)價(jià)慢性應(yīng)激模型小鼠抑郁樣行為的指標(biāo)［21］。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠小腸上皮和脾淋巴細(xì)胞中Tr細(xì)胞的百分比和數(shù)目

1.5.1 小腸上皮和脾淋巴細(xì)胞懸液的制備

于應(yīng)激第32天處死小鼠后取小腸和脾。將小腸在保持濕潤條件下去除脂肪和淋巴結(jié)，在含5%FBS和HEPES 25 mmol·L-1的RPMI洗滌溶液中剖開腸道去除內(nèi)容物，剪成約1 cm的小段浸入含10%FBS，DTT 1 mmol·L-1和HEPES 25 mmol·L-1的RPMI消化緩沖液中，在37℃振蕩20 min。冰上將消化液用70 μm篩網(wǎng)過濾，消化碎片轉(zhuǎn)移到含10%FBS，EDTA 20 mmol·L-1和HEPES 25 mmol·L-1的RPMI的消化緩沖液中，在37℃振蕩30 min后再次過濾。將2次過篩后的上清匯合混勻，加入用PMI-1640培養(yǎng)基稀釋至44%的Percoll分離液，于24℃、400×g離心20 min得到小腸上皮淋巴細(xì)胞懸液。將脾放入100 μm濾網(wǎng)中，于預(yù)冷的FACS緩沖洗液（每50 mL 1xPBS緩沖溶液含有1 mL FBS）中擠壓，制備脾淋巴細(xì)胞懸液。

1.5.2 Tr細(xì)胞百分比檢測(cè)

采用細(xì)胞膜表面標(biāo)志物CD4和CD25及核內(nèi)標(biāo)志物Foxp3共染標(biāo)記Tr細(xì)胞。每只小鼠取1x1061.5.1制備的細(xì)胞，先加入Percp-抗CD45，F(xiàn)ITC-抗CD4和APC-抗CD25抗體各1 μL，進(jìn)行細(xì)胞膜表面染色30 min，再加入Fixation/Perm Diluent固定液固定過夜，用Permeabilization透化液洗滌和透膜后加PE-抗Foxp3抗體1 μL，進(jìn)行細(xì)胞核內(nèi)染色60 min；用Permeabilization透化液洗滌、固定后4℃保存，而后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。各組均設(shè)抗體單標(biāo)管及陰性對(duì)照管，細(xì)胞檢測(cè)數(shù)為1×105，用FlowJo軟件分析Tr細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中的百分比及CD4+T細(xì)胞在CD45+細(xì)胞中的百分比。

1.5.3 Tr細(xì)胞數(shù)目檢測(cè)

每只小鼠取1.5.1制備的單細(xì)胞懸液50 μL，加入200 μL計(jì)數(shù)微球混合液（含有20 μL計(jì)數(shù)微球原液、0.1 μL FITC-抗 CD45 抗體和 180 μL FACS 緩沖洗液）混勻，30 min后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD45+細(xì)胞比例，并計(jì)算CD45+細(xì)胞總數(shù)。CD45+細(xì)胞總數(shù)=（CD45+細(xì)胞比例/微球比例）×（每管微球數(shù)/樣品體積）；Tr細(xì)胞數(shù)目可通過CD45+細(xì)胞總數(shù)及1.5.2分析得到的CD4+T細(xì)胞在CD45+細(xì)胞中的百分比和Tr細(xì)胞在CD4+細(xì)胞中的百分比3項(xiàng)數(shù)值相乘得出。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 IOMO對(duì)CUS模型小鼠蔗糖偏嗜度的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖2）顯示，應(yīng)激前各組小鼠蔗糖偏嗜度無明顯差異。應(yīng)激第28天，與正常對(duì)照組相比，CUS模型組小鼠蔗糖偏嗜度顯著降低（P<0.01），表現(xiàn)出抑郁樣行為（快感缺失）；與CUS模型組相比，CUS+FLX 10 mg·kg-1組和CUS+IOMO 50 mg·kg-1組小鼠蔗糖偏嗜度均顯著升高（P<0.01）。提示IOMO可改善CUS導(dǎo)致的小鼠抑郁樣行為。

Fig.2 Effect of IOMO on sucrose preference in SPT in CUS mice.See Fig.1 for the mouse treatment.On the 28thday of the CUS procedure,the preference for sucrose was detected.±s，n=12.＊＊P<0.01，compared with normal control group；##P<0.01，compared with CUS model group.

2.2 IOMO對(duì)CUS模型小鼠開場(chǎng)行為的影響

OFT結(jié)果表明（圖3），各組小鼠跨格次數(shù)和運(yùn)動(dòng)總距離均無顯著性差異（圖3A），提示IOMO對(duì)CUS模型小鼠自發(fā)活動(dòng)無影響。同時(shí)，與正常對(duì)照組相比，CUS模型組小鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)的次數(shù)（P<0.01）以及在中央?yún)^(qū)停留時(shí)間（P<0.01）顯著減少。與CUS模型組相比，CUS+FLX組和CUS+IOMO小鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)次數(shù)和累計(jì)時(shí)間均顯著增加（P<0.05）。提示IOMO對(duì)CUS引起的小鼠焦慮樣行為具有改善作用。

Fig.3 Effect of IOMO on locomotor activity（A and B）and anxiety-like behaviors（C and D）in OFT in CUS model mice.See Fig.1 for the mouse treatment.On the 29st day，the OFT was performed.±s，n=12. ＊＊P<0.01，compared with normal control group；#P<0.05，compared with CUS model group.

2.3 IOMO對(duì)CUS模型小鼠強(qiáng)迫游泳和新奇抑制攝食行為的影響

FST和NSF實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4）顯示，與正常對(duì)照組相比，CUS模型組小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間和新奇環(huán)境攝食潛伏期均顯著延長(zhǎng)（P<0.01）。與CUS模型組相比，CUS+FLX組和CUS+IOMO組小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間（P<0.05）和新奇環(huán)境攝食潛伏期（P<0.01）均顯著縮短。提示在FST和NSF實(shí)驗(yàn)中，IOMO對(duì)CUS小鼠抑郁樣行為具有改善作用。

Fig.4 Effect of IOMO on depression-like behavior in FST（A）and NSF（B）in CUS model mice.See Fig.1 for the mouse treatment.On the 30ndand 32thday，the immobility time in FST and the latency to feed in NSF were recorded.±s，n=12.＊＊P<0.01，compared with normal control group；#P<0.05，##P<0.01，compared with CUS model group.

2.4 IOMO對(duì)CUS模型小鼠小腸上皮Tr細(xì)胞數(shù)目的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，各組小鼠小腸上皮Tr細(xì)胞占總CD4+T細(xì)胞比例無顯著性差異（圖5A和5B）。與正常對(duì)照組相比，CUS模型組小鼠小腸上皮Tr細(xì)胞數(shù)目顯著減少（P<0.05）；與CUS模型組相比，CUS+FLX組小鼠小腸上皮Tr細(xì)胞數(shù)目顯著增多（P<0.05）。同樣，CUS+IOMO組小腸上皮Tr細(xì)胞數(shù)目也顯著增多（P<0.05）（圖5C）。

Fig.5 Effect of IOMO on proportion(B)and number(C)of regulatory T（Tr）cells in intestinal epithelial lympho?cytes of CUS model mice by flowcytometry.See Fig.1 for the mouse treatment.B was the quantitative analysis results of A.The number of Tr cells was calculated by multiplying the total number of CD45+cells,the percentage of CD4+T cells in CD45+cells and the percentage of Tr cells in CD4+T cells.±s，n=10.＊P<0.05，compared with normal control group；#P<0.05，compared with CUS model group.

2.5 IOMO對(duì)CUS模型小鼠脾組織中Tr細(xì)胞數(shù)目的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，各組小鼠脾組織中Tr細(xì)胞占總CD4+T細(xì)胞百分比無顯著性差異（圖6A和6B）。與正常對(duì)照組相比，CUS模型組小鼠脾組織中Tr細(xì)胞數(shù)目顯著減少（P<0.05）。與CUS模型組相比，CUS+FLX組和CUS+IOMO組小鼠脾組織中Tr細(xì)胞數(shù)目顯著增多（P<0.05）（圖6C）。

Fig.6 Effect of IOMO on Tr cells in spleens of CUS model mice by flowcytometry.See Fig.1 for the mouse treatment.B and C were the quantitative analysis results of A.±s，n=10.＊P<0.05，compared with normal control group；#P<0.05，compared with CUS model group.

2.6 Tr細(xì)胞數(shù)目與蔗糖偏嗜度的相關(guān)性

按照文獻(xiàn)［22-23］方法評(píng)估Tr細(xì)胞數(shù)目與抑郁樣行為（蔗糖偏嗜度）之間的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，小腸上皮和脾組織中Tr細(xì)胞數(shù)目與蔗糖偏嗜度均呈正相關(guān)，Pearson相關(guān)系數(shù)r分別為0.5044和0.7267（P<0.05）。提示小腸上皮和脾組織中Tr細(xì)胞數(shù)目變化與小鼠抑郁樣行為變化顯著相關(guān)。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，IOMO可在改善CUS模型小鼠焦慮和抑郁樣行為的同時(shí)顯著增加小腸上皮和脾組織中Tr細(xì)胞數(shù)量，且Tr細(xì)胞數(shù)量與抑郁樣行為變化程度之間具有顯著相關(guān)性。

T細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)的重要組分之一，在機(jī)體適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。免疫調(diào)控使得T細(xì)胞分化為不同的亞群，以實(shí)現(xiàn)多樣的免疫應(yīng)答模式。根據(jù)T細(xì)胞膜表面標(biāo)志物的不同，可分為CD4+T和CD8+T細(xì)胞，前者又可分化為Th1，Th2，Th17和Tr細(xì)胞等。T細(xì)胞的發(fā)育和分化失衡與抑郁癥病因?qū)W密切相關(guān)，如抑郁癥患者血液循環(huán)內(nèi)T細(xì)胞凋亡增加［24］、CD4+/CD8+比值降低［25］以及Th1/Th2比值顯著升高［26］等。Tr細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞的重要亞群之一，近年來的研究越來越關(guān)注Tr細(xì)胞分化失衡與抑郁癥的關(guān)系。研究表明，Tr細(xì)胞分化失衡引起了包括中樞小膠質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)的全身巨噬細(xì)胞的激活，引發(fā)炎癥細(xì)胞因子的過度分泌，誘發(fā)神經(jīng)炎癥，這可能是其誘發(fā)抑郁的機(jī)制之一［27］。

文獻(xiàn)報(bào)道，CUS模型小鼠體內(nèi)Tr細(xì)胞水平顯著下降，在全身性耗竭Tr細(xì)胞后，模型小鼠表現(xiàn)出抑郁樣行為［18］，這與本研究結(jié)果一致。臨床相關(guān)研究也表明，抑郁癥患者外周血Tr細(xì)胞水平顯著下降［17］。近期研究顯示，部分新型冠狀病毒肺炎患者治愈后表現(xiàn)出焦慮、抑郁癥狀，其外周血內(nèi)Tr細(xì)胞水平亦顯著下降［28］。本課題組前期研究表明，在大鼠獲得性無助抑郁模型上，IOMO 50 mg·kg-1具有抗抑郁效應(yīng)［5］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IOMO在該劑量下顯著增加CUS模型小鼠小腸上皮和脾組織中Tr細(xì)胞數(shù)量，提示增加小腸上皮和脾組織中Tr細(xì)胞可能是其抗抑郁作用的機(jī)制之一。

小腸上皮淋巴細(xì)胞是散在分布在腸道上皮細(xì)胞之間的免疫細(xì)胞，能直接接觸腸道菌群及其代謝產(chǎn)物。由于IOMO須經(jīng)腸道菌群代謝，因此與之直接接觸的小腸上皮淋巴細(xì)胞更早受到IOMO及其代謝產(chǎn)物的影響。本研究結(jié)果表明，IOMO可改善CUS模型小鼠小腸上皮Tr細(xì)胞數(shù)目的減少，提示IOMO及其腸道菌群代謝產(chǎn)物可能改善了CUS引起的Tr細(xì)胞減少。作者所在團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，IOMO可增加小鼠腸道內(nèi)容物短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFA）產(chǎn)量（待發(fā)表）。同時(shí)相關(guān)研究表明，SCFA可顯著促進(jìn)初始CD4+T細(xì)胞向Tr細(xì)胞的分化［29］，提示IOMO增加Tr細(xì)胞數(shù)目可能與其代謝產(chǎn)物SCFA促進(jìn)Tr細(xì)胞產(chǎn)生有關(guān)。另有研究顯示，抑郁癥患者及抑郁模型動(dòng)物血液循環(huán)的Tr細(xì)胞水平顯著降低，慢性社交挫敗小鼠腸道淋巴結(jié)內(nèi)Tr細(xì)胞顯著下降［30］，益生元和益生菌共同作用可在改善小鼠抑郁樣行為的同時(shí)增加小鼠回腸固有層中Tr細(xì)胞的水平［31］，其機(jī)制與腸道某些固有淋巴細(xì)胞亞群有關(guān)［32］。

本研究發(fā)現(xiàn)，IOMO可改善CUS模型小鼠脾組織中Tr細(xì)胞數(shù)目的減少，提示IOMO代謝產(chǎn)物進(jìn)入血液循環(huán)后不但可作用于直接接觸的小腸上皮淋巴細(xì)胞，還可作用于全身性器官。文獻(xiàn)報(bào)道，社交挫敗抑郁模型小鼠脾Tr細(xì)胞水平顯著下降，抑郁易感小鼠Tr細(xì)胞分化受到抑制［33］，與本研究結(jié)果一致，提示Tr細(xì)胞分化失衡可能是抑郁癥發(fā)病的重要機(jī)制。

本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，小腸上皮和脾組織中Tr細(xì)胞數(shù)目與蔗糖偏嗜度呈顯著正相關(guān)，表明小腸上皮和脾組織中Tr細(xì)胞數(shù)目與抑郁樣行為顯著相關(guān)，提示增加小腸上皮和脾組織中Tr細(xì)胞數(shù)量可能是IOMO抗抑郁作用機(jī)制之一。

前期研究已證實(shí)，ig給予IOMO 25～50 mg·kg-1具有明確的抗抑郁效應(yīng)［34-35］，因此本研究采用50 mg·kg-1劑量，陽性藥FLX也同樣采用文獻(xiàn)報(bào)道的小鼠模型評(píng)價(jià)抗抑郁效應(yīng)的有效劑量10 mg·kg-1［36］。需要注意的是，本研究采用了伴隨給藥方式探討IOMO治療作用，其主要原因一是CUS模型耗時(shí)較長(zhǎng)，伴隨給藥可適當(dāng)縮短研究周期，二是抗抑郁藥物通常存在約2周的起效延遲期，使得伴隨給藥成為研究抗抑郁藥物治療效果的常用給藥方式。

綜上，在小鼠CUS抑郁模型中，IOMO對(duì)焦慮樣和抑郁樣行為具有改善作用，并可調(diào)節(jié)小腸上皮淋巴細(xì)胞和脾組織中Tr細(xì)胞的數(shù)量，且小腸上皮和脾組織中Tr細(xì)胞數(shù)目變化和行為變化之間具有顯著相關(guān)性。本研究為天然來源的抗抑郁藥物對(duì)免疫系統(tǒng)的影響提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，其具體調(diào)節(jié)機(jī)制有待深入研究。