QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蜂蜜中19種喹諾酮類抗生素

倪楊 楊軍軍 石磊 張瑩瑩 熊融

（北京市農(nóng)林科學(xué)院林業(yè)果樹研究所，北京市落葉果樹工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品及苗木質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（北京），北京 100093）

蜂蜜是一種營養(yǎng)豐富的天然滋養(yǎng)食品，富含多種氨基酸、維生素和礦物質(zhì)元素，具有抗菌、抗氧化、提高免疫力等功效，能夠預(yù)防和治療多種疾病，是深受人們喜愛的“藥食同源”蜂產(chǎn)品[1]。隨著蜂蜜營養(yǎng)價(jià)值認(rèn)可度的不斷提高，對(duì)其消費(fèi)需求和質(zhì)量要求也在不斷提升，然而蜂蜜摻假、藥物殘留超標(biāo)等不良事件的發(fā)生，嚴(yán)重影響了蜂蜜產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，獸藥殘留量已成為衡量蜂蜜產(chǎn)品質(zhì)量的重要指標(biāo)之一[2]。

喹諾酮類藥物為人工合成的含4-喹諾酮基本結(jié)構(gòu)的廣譜抗生素，可作用于細(xì)菌的脫氧核糖核酸的回旋酶，使細(xì)胞無法分裂，從而起到抗菌效果[3]。該類藥物目前已發(fā)展到第五代，為人畜共用，可預(yù)防不同種類動(dòng)物的疾病，在蜂業(yè)生產(chǎn)中通常用來防治和治療各類細(xì)菌性疾病，尤其可以有效防治美洲幼蟲腐臭病引起的蜜蜂數(shù)量減少和蜂蜜產(chǎn)量降低[4]。因此，我國部分地區(qū)的蜂農(nóng)在養(yǎng)殖過程中直接飼喂或在蜂巢中噴灑獸藥，不合理用藥或藥物濫用致使其在蜂蜜中殘留。喹諾酮類藥物在動(dòng)物體內(nèi)代謝緩慢，容易產(chǎn)生蓄積，人類若長期食用含有喹諾酮類藥物的食品，會(huì)誘導(dǎo)致病菌產(chǎn)生耐藥性；若過量食用此類藥物，還會(huì)出現(xiàn)惡心、腹瀉、頭痛、眩暈，以及白細(xì)胞減少、肝損傷等不良反應(yīng)，有致畸、致突變的潛在風(fēng)險(xiǎn)[5,6]。

因此，國內(nèi)外對(duì)食品中的喹諾酮含量均進(jìn)行嚴(yán)格限定。我國在GB 31650-2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》中規(guī)定，恩諾沙星、達(dá)氟沙星、雙氟沙星和沙拉沙星在家禽產(chǎn)蛋期禁用，并規(guī)定了其他動(dòng)物源食品中的最大殘留限量；2015年《中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第2292號(hào)》文件，明令禁止洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4種獸藥在動(dòng)物食品中使用。歐盟規(guī)定了麻保沙星、環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、氟甲喹和噁喹酸的最大殘留限量，此類抗生素藥物也未被授權(quán)用于治療蜜蜂疾病[7]。由于沒有蜂蜜中抗生素類藥物最大殘留限量值的規(guī)定，我國養(yǎng)蜂業(yè)禁止使用喹諾酮類藥物，因此有必要建立蜂蜜中多種喹諾酮類藥物的痕量檢測方法[8]。

目前，蜂蜜中喹諾酮類藥物的檢測方法有薄層色譜法[9]、三維熒光光譜法[10]、高效液相色譜法[1112]等，其中薄層色譜法適用于定性分析，三維熒光光譜法僅可同時(shí)檢測幾種目標(biāo)化合物，高效液相色譜法定性易受假陽性干擾，但當(dāng)高效液相色譜法與質(zhì)譜聯(lián)用，憑借強(qiáng)大的分離能力和較好的靈敏度、準(zhǔn)確性，已經(jīng)發(fā)展成為獸藥檢測領(lǐng)域最為可靠的定性定量分析方法[13-18]。但目前液質(zhì)檢測法前處理多數(shù)使用HLB固相萃取柱[19]或陰離子交換柱[20]進(jìn)行凈化，不但其選擇性和除雜富集效果有待提高，因其操作復(fù)雜、過柱時(shí)間長且成本較高，不適合大批量快速檢測。本研究綜合利用QuEChERS前處理方法和UPLC-MS/MS的優(yōu)勢，在借鑒以往文獻(xiàn)中有關(guān)喹諾酮類藥物提取、凈化的基礎(chǔ)上，建立了蜂蜜中19種喹諾酮類藥物殘留量的快速檢測方法，以期為監(jiān)測、評(píng)估蜂蜜中多組分喹諾酮類藥物的污染風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和確證檢測提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂蜜樣品購于超市和集市，于-20 ℃保存；19種喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL）：恩諾沙星（Enrofloxacin，ENR）、環(huán) 丙 沙 星（Ciprofloxacin，CIP）、諾氟沙星（Norfloxacin，NOR）、氧氟沙星（Ofloxacin，OFL）、雙氟沙星（Difloxacin，DIF）、噁喹酸（Oxolinic acid，OXO）、氟甲喹（Flumequine，F(xiàn)LU）、沙拉沙星（Sarafloxacin，SAR）、司 帕 沙 星（Sparfloxacin，SPA）、丹氟沙星（Danofloxacin，DAN）、氟羅沙星（Fleroxcain，F(xiàn)LE）、馬波沙星（Marbofloxacin，MAR）、伊諾沙星（Enoxacin，ENO）、奧比沙星（Orbifloxacin，ORB）、吡哌酸（Pipemidic acid，PIP）、培氟沙星（Pefloxacin，PEF）、洛美沙星（Lomefloxacin，LOM）、西諾沙星（Cinoxacin，CIN）、奈啶酸（Nalidixic acid，NAL） 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所；乙腈、甲醇（色譜純） 美國Fisher公司；甲酸、乙酸銨、氯化鈉、無水硫酸鎂、無水硫酸鈉（分析純） 上海麥克林生化科技有限公司；PSA、C18、FLPR 日本島津公司；HLB 上海連橋生物科技有限公司；微孔過濾膜（13 mm×0.22 μm，尼龍） 北京迪科馬科技有限公司；ACQUITY BEH C18（2.1×100 mm，1.7 μm） 美國Waters公司；氬氣（純度＞99.9%） 北京氦普北分氣體工業(yè)有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水（電阻率大于18.2 MΩ·cm）由Milli-Q超純水機(jī)制備。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY UPLC I-Class液相色譜儀 美國Waters公司；Xevo TQ-S質(zhì)譜儀（配有ESI及Masslynx4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)） 美國Waters公司；Milli-Q超純水機(jī)美國Millipore公司；GL-20G-II高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；FE20型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KQ-600DB超聲波清洗器 昆山市超聲波儀器有限公司；QL-8BB旋渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；PL2002電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別移取一定體積的19種標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，加入適量甲醇稀釋并定容至刻度線，得到混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中FLU、NAL質(zhì)量濃度為50 μg/L，其余17種喹諾酮類藥物質(zhì)量濃度均為20 μg/L。

基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：選取經(jīng)檢測不含19種喹諾酮類藥物的空白蜂蜜樣品，按照1.3.1節(jié)進(jìn)行樣品前處理，制備空白基質(zhì)溶液，用其配制不同質(zhì)量濃度的系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。其中，F(xiàn)LU、NAL的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線濃度分別為0.5、1、5、10、25、50 μg/L，其余17種抗生素的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線濃度均為0.2、1、2、5、10、20 μg/L。

1.3.2 樣品前處理

將蜂蜜樣品攪拌均勻，稱取5.00 g置于50 mL旋蓋離心管中，加入5 mL超純水渦旋振蕩溶解，再加入10 mL乙腈溶液超聲提取5 min，然后加入3 g氯化鈉，渦旋振蕩1 min后靜置分層。吸取3 mL有機(jī)相置于內(nèi)含0.2 g C18的15 mL離心管中，渦旋振蕩0.5 min后，靜止3 min，過0.22 μm有機(jī)濾膜于樣品瓶中，待測分析。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：ACQUITY BEH C18（2.1×100 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；流速：0.2 mL/min；流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.1 %甲酸-水溶液；梯度洗脫程序：0～0.5 min、90 % B，0.5～1.0 min、90 %～40 % B，1.0～3.0 min、40 %～10 % B，3.0～4.0 min、10 % B，4.0～4.5 min、90 % B；進(jìn)樣量：2 μL。

1.3.4 質(zhì)譜條件

電離源：ESI；掃描方式：正、負(fù)離子同時(shí)掃描；檢測模式：MRM；毛細(xì)管電壓：2.5 kV；離子源溫度：150 ℃；錐孔電壓：40 V；脫溶劑氣溫度：350 ℃；脫溶劑氣流量：650 L/h；碰撞氣：氬氣。

1.4 數(shù)據(jù)分析

通過Waters Masslynx儀器配置工作站系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，利用Excel軟件、R語言進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液直接進(jìn)樣進(jìn)行正負(fù)離子掃描，目標(biāo)化合物均在正離子[M+H]+模式下響應(yīng)值最高，增加碰撞能量和錐孔電壓，獲得離子碎片信息。選擇相對(duì)較強(qiáng)的2個(gè)離子作為定量、定性離子對(duì)，最后優(yōu)化裂解電壓、碰撞能量使目標(biāo)物響應(yīng)值達(dá)到最大，最終確定掃描模式為正離子模式，19種喹諾酮類藥物MRM質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1 19種喹諾酮類藥物檢測質(zhì)譜參數(shù)

2.2 色譜條件的優(yōu)化

反相液相色譜中，最常用的流動(dòng)相體系為甲醇-水和乙腈-水兩種，并通過加入少量甲酸、乙酸、乙酸銨、甲酸銨等降低流動(dòng)相pH值來改善峰形、提高質(zhì)譜離子化效率[8、16]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甲醇與水相混合后柱壓升高，且保留時(shí)間延遲，因此選擇乙腈為有機(jī)相，并分別與超純水、5 mmol/L乙酸銨水溶液、0.05%甲酸水溶液組合流動(dòng)相，比較19種喹諾酮類藥物的色譜峰分離效果及峰形情況。結(jié)果表明，乙腈分別與超純水、5 mmol/L乙酸銨水組合時(shí)，目標(biāo)化合物的峰形較差，且豐度和靈敏度較低。為提高化合物響應(yīng)強(qiáng)度，在水相中加入低濃度甲酸后，峰形對(duì)稱性明顯得到改善，并且響應(yīng)值增強(qiáng)。進(jìn)一步考察不同濃度甲酸（0.01%、0.05%、0.1%）對(duì)被測組分的影響，以乙腈-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相時(shí)，目標(biāo)物的色譜峰形和響應(yīng)強(qiáng)度最佳，保留時(shí)間穩(wěn)定（詳見圖1）。

圖1 19種喹諾酮類藥物的MRM色譜圖

2.3 樣品前處理的優(yōu)化

由于蜂蜜不易溶于有機(jī)溶劑，因此通常用純水溶解蜂蜜樣品，在勻質(zhì)的蜂蜜水溶液中加入提取溶劑，甲醇、乙腈是目前最常用的提取劑[8,16,19]，甲醇比乙腈具有更好的溶解性，易將樣品中的糖、酸、色素、蛋白質(zhì)等物質(zhì)提取出來，致使提取液中雜質(zhì)較多，不利于后續(xù)的鹽析和凈化，而乙腈對(duì)蛋白的沉淀作用較強(qiáng)且共提物少，因此選擇乙腈作為提取劑。

QuEChERS前處理過程中加入鹽析劑（1 g NaCl和4 g 無水MgSO4）[21]可以促進(jìn)目標(biāo)化合物由水相分配至有機(jī)相，利于水相與有機(jī)相分層，實(shí)驗(yàn)對(duì)比NaCl、無水MgSO4、無水Na2SO4對(duì)喹諾酮類藥物回收率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加3 g NaCl，渦旋振蕩1 min后靜置，即可使兩相溶液分層完全、清透，且對(duì)目標(biāo)化合物的回收率最好。

為了獲得更好的回收率，減少蜂蜜樣品提取溶液中糖、酸、色素的影響，需要對(duì)提取液進(jìn)行凈化除雜。PSA可以吸附多種極性有機(jī)酸、極性色素以及部分糖類和脂肪酸；C18可以吸附非極性的干擾物質(zhì)，如脂肪；FL-PR屬于硅酸鎂型吸附劑，吸附性強(qiáng)，可以從非極性溶液中萃取極性化合；HLB屬于親水親脂平衡聚合物填料，萃取非極性至中等極性的酸性、中性、堿性化合物。實(shí)驗(yàn)以空白蜂蜜樣品的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，分別比較了0.2 g的PSA、C18、FL-PR、HLB對(duì)19種喹諾酮類藥物凈化回收的效果（n=3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，選用0.2 g C18為凈化劑，目標(biāo)化合物回收率范圍在82.1%～95.4%之間，回收率最高，考慮實(shí)驗(yàn)成本及可操作性，本方法選用0.2 g C18對(duì)提取液進(jìn)行凈化處理。

2.4 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.4.1 基質(zhì)效應(yīng)

為評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)，采用基質(zhì)標(biāo)與溶劑標(biāo)曲線斜率的比值考察了19種喹諾酮類藥物在蜂蜜中的信號(hào)增強(qiáng)/抑制程度（signal suppression/enhancement, SSE），SSE值大于1.2表示基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，小于0.8表示基質(zhì)抑制效應(yīng)，在0.8～1.2之間則視為基質(zhì)效應(yīng)影響不大[22]。由表3得知，在蜂蜜基質(zhì)中，CIP、SAR和ENO的SSE值在0.80～0.85范圍內(nèi)，屬于弱抑制效應(yīng)；OFL、DAN和LOM的SSE值在1.15～1.20范圍內(nèi)，屬于弱增強(qiáng)效應(yīng)，采用基質(zhì)匹配標(biāo)樣來對(duì)蜂蜜中的喹諾酮類藥物進(jìn)行定性和定量分析。

表2 凈化劑對(duì)19種喹諾酮類藥物回收率的影響（n=3）

表3 19種喹諾酮類藥物在蜂蜜中的基質(zhì)效應(yīng)

2.4.2 線性關(guān)系、LODs與LOQs

取空白蜂蜜樣品，按照1.3.2進(jìn)行樣品前處理，分別配制一系列濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，上機(jī)測定后，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制19種喹諾酮類藥物的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，并以定性通道的3倍信噪比（S/N=3）、定量通道的10倍信噪比（S/N=10）確定各化合物的LODs和LOQs[23]。結(jié)果表明，19種目標(biāo)化合物在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，峰面積與質(zhì)量濃度呈現(xiàn)良好線性關(guān)系（R2＞0.995），LODs和LOQs分別為0.25～0.50 μg/kg和0.80～1.50 μg/kg，本方法具有良好的定性和定量分析能力。

表4 19種喹諾酮類藥物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、LODs和LOQs（n=6）

2.4.3 回收率與精密度

選取空白蜂蜜樣品，分別按照低、中、高3個(gè)濃度水平加入適量19種喹諾酮類藥物的標(biāo)準(zhǔn)工作液，每個(gè)濃度做6個(gè)平行樣，以本文上述方法處理樣品并測定濃度，計(jì)算加標(biāo)回收率和RSDs。結(jié)果表明，各化合物在低濃度添加量（1 μg/kg）下的平均回收率為78.9%～92.2%，RSDs為2.0%～4.6%；在中濃度添加量（5 μg/kg）下的平均回收率為80.6%～94.2%，RSDs為1.8%～4.1%；在高濃度添加量（10 μg/kg）下的平均回收率為85.2%～96.5%，RSDs為2.0%～4.9%，滿足GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》和GB 31657.2-2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 蜂產(chǎn)品中喹諾酮類藥物多殘留的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》的相關(guān)要求。

2.5 實(shí)際樣品測定

為驗(yàn)證本方法的適用性，選取超市蜂蜜樣品10份、蜂農(nóng)自產(chǎn)自銷蜂蜜樣品5份進(jìn)行分析。其中，超市售賣的蜂蜜均未檢出19種喹諾酮類藥物，而蜂農(nóng)銷售的蜂蜜中，有3份樣品檢出NOR，其含量分別為0.68 μg/kg、3.15 μg/kg、5.82 μg/kg。根據(jù)《中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第2292號(hào)》文件規(guī)定，在食品動(dòng)物中停止使用NOR、LOM、PEF、OFL 4種獸藥，即在蜂蜜中不得檢出，本次抽檢結(jié)果應(yīng)給予持續(xù)關(guān)注。

3 結(jié)論

本研究建立了QuEChERS前處理技術(shù)結(jié)合UPLC-MS/MS同時(shí)測定蜂蜜中19種喹諾酮類藥物的快速檢測方法。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了前處理方法及色譜質(zhì)譜條件，使目標(biāo)化合物擁有較好的分離效果和較高的檢測靈敏度。樣品以ACQUITY BEH C18色譜柱分離，在ESI正離子掃描模式下，采用MRM模式測定，19種喹諾酮類藥物在3 min內(nèi)完成色譜分離分析，在相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，各目標(biāo)物在蜂蜜中均呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，LODs和LOQs分別為0.25～0.50μg/kg、0.80～1.50 μg/kg。以蜂蜜基質(zhì)在低、中、高3個(gè)添加濃度水平下的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，平均回收率為78.9%～96.5%，RSDs為1.8%～4.9%，符合檢測方法確認(rèn)的相關(guān)要求。該方法操作簡單、精密度好、靈敏度高、分析速度快，能夠滿足蜂蜜中喹諾酮?dú)埩舴治龅男枨蟆?/p>

表5 19種喹諾酮類藥物的平均回收率和RSDs（n=6）