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    抹茶對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝臟脂質(zhì)積累和炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用及機(jī)制

    2022-09-07 09:08:44周繼紅余月兒丁樂佳徐平毛立民王岳飛
    關(guān)鍵詞:小鼠

    周繼紅,余月兒,丁樂佳,徐平,毛立民,2,王岳飛*

    (1.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院茶葉研究所,杭州 310058;2.浙江省茶葉集團(tuán)股份有限公司,杭州 310058)

    肥胖是全球公共性健康問題之一,過多攝入高熱量食物已成為肥胖及相關(guān)非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的關(guān)鍵誘因[1]。NAFLD 以肝細(xì)胞內(nèi)過量的脂肪積累為主要臨床特征,其發(fā)病軌跡可從單純的脂肪變性蔓延至非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化乃至肝癌,成為人類健康的重要威脅[2]。關(guān)于肥胖及相關(guān)NAFLD 等并發(fā)癥的明確作用機(jī)制和有效診療手段是亟待解決的重要科學(xué)問題。

    綠茶作為一種廣泛流行的健康飲品,已被證明具有顯著的降脂減肥、降血糖、緩解胰島素抵抗、改善肝脂肪變性等作用[3-4],綠茶及其提取物也成為防治肥胖相關(guān)代謝綜合征和NAFLD的有效干預(yù)手段,相關(guān)作用機(jī)制的研究已成為近年來的熱點(diǎn)。與傳統(tǒng)飲茶方式只能攝入水溶性成分相比,抹茶“吃茶”的食用方法大大提高了茶葉活性成分的攝入率,是一種兼顧滋味和營養(yǎng)的健康食品[5-6]。為明確抹茶在降脂減肥和保肝護(hù)肝方面的作用,本研究基于高脂飲食誘導(dǎo)的C57BL/6J肥胖小鼠模型,就抹茶改善肥胖及相關(guān)NAFLD的作用機(jī)制展開研究,為健康飲茶及抹茶保健功能開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和科學(xué)支撐。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    抹茶樣品(‘迎霜’‘鳩坑’‘中茶108’和‘茂綠’品種)由浙江駱駝九宇有機(jī)食品有限公司提供;雄性C57BL/6J 小鼠(4 周齡,清潔級(jí))購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司;普通小鼠飼料(D12450J)、高脂小鼠飼料(D12492)購于美國Research Diets 公司;蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色試劑盒、油紅O染色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司;谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)檢測試劑盒購自上海臻科生物科技有限公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;總RNA 提取(Trizol)試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)試劑盒購自日本TaKaRa公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    TP-214 電子分析天平(美國丹佛儀器公司);HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省常州澳華儀器有限公司);TGL-16M 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(湖南湘儀動(dòng)力測試儀器有限公司);5804R 離心機(jī)(德國Eppendorf 公司);UV-6100A 紫外可見分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司);515 高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)儀(美國Waters 公司);ZRQSV24CN 超純水儀(美國Thermo Fisher Scientific 公司);血糖儀(美國強(qiáng)生集團(tuán));SHZ-IIIA循環(huán)水式多用真空泵(上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司);GZX-9246 MBE 數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);SpectraMax M5多功能酶標(biāo)儀(美國加州分子儀器公司);TS100倒置顯微鏡(日本Nikon 公司);實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR, qRT-PCR)儀(美 國Applied Biosystems公司)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 抹茶主要化學(xué)成分測定

    抹茶主要化學(xué)成分測定根據(jù)文獻(xiàn)[7]的方法進(jìn)行,其中含水量測定參考GB 5009.3—2016(《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》),茶水浸出物含量測定參考GB/T 8305—2013(《茶 水浸出物測定》),茶多酚含量測定參考GB/T 8313—2018(《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》),游離氨基酸含量測定參考GB/T 8314—2013(《茶 游離氨基酸總量的測定》),可溶性糖含量測定采用蒽酮硫酸比色法,可溶性蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍(lán)比色法,兒茶素與咖啡堿含量測定參考GB/T 8313—2018(《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》)中HPLC法。

    1.3.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

    小鼠于浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng),飼養(yǎng)環(huán)境為:溫度22~26 ℃,相對(duì)濕度40%~70%,12 h/12 h晝夜交替。將25只雄性C57BL/6J小鼠在實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后隨機(jī)均分為5組,每組5只,分別飼喂普通飼料(NCD組)、高脂飼料(HFD組)、含0.1%抹茶(‘茂綠’)的高脂飼料(HML組)、含0.5%抹茶的高脂飼料(HMM組)、含1.0%抹茶的高脂飼料(HMH組)。實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由攝食飲水,每周記錄攝食量和體質(zhì)量,實(shí)驗(yàn)周期為8周。8周后禁食12 h,采集小鼠血液,使用血糖儀檢測小鼠血糖值。隨后麻醉并處死小鼠,剖取肝臟樣本并保存,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以上相關(guān)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)施遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 福利倫理審查指南》(GB/T 35892—2018)。

    1.3.3 肝臟組織HE 染色

    將肝臟組織置于10%甲醛水溶液中固定24 h,石蠟包埋后用石蠟切片機(jī)連續(xù)切片(厚度為5 μm),按照HE染色試劑盒說明書進(jìn)行染色。用中性樹膠封片后將切片置于顯微鏡下拍攝圖像。

    1.3.4 肝臟組織油紅O 染色

    將肝臟組織用冰凍切片包埋劑包埋后,于-20 ℃條件下制備冰凍切片(厚度為10 μm),按照油紅O 染色試劑盒說明書進(jìn)行染色。用甘油封片后將切片置于顯微鏡下拍攝圖像。

    1.3.5 肝臟功能與氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測

    用組織研磨器將小鼠肝臟組織研磨成勻漿,按照試劑盒說明書檢測ALT、AST、SOD活性以及MDA含量。

    1.3.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測基因表達(dá)水平

    按照Trizol 試劑盒方法提取各組細(xì)胞的RNA,使用NanoDrop 超微量分光光度計(jì)(美國Thermo Fisher Scientific 公司)測定RNA 濃度。將樣品稀釋,并根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TOYOBO公司)說明書將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。適當(dāng)稀釋cDNA,配制SYBR 反應(yīng)體系:SYBR Green 7.5 μL,引物混合物0.6 μL,ddH2O 5.1 μL,ROX 0.3 μL,cDNA 1.5 μL。以GAPDH為內(nèi)參,進(jìn)行腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)炎癥因子和Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)、MyD88炎癥相關(guān)通路關(guān)鍵基因的相對(duì)表達(dá)量分析(各基因引物序列如表1所示)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,45 個(gè)循環(huán);95 ℃變性15 s,60 ℃退火1 min,95 ℃延伸15 s。每個(gè)樣品重復(fù)3次,采用2-ΔΔCT法對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行定量分析。

    表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences of qRT-PCR

    1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

    數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示,通過GraphPad Prism 8.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。2組間的比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析和Tukey事后檢驗(yàn),以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同品種抹茶主要化學(xué)成分含量測定結(jié)果

    抹茶中主要化學(xué)成分含量與抹茶品質(zhì)和健康功效關(guān)系密切。4個(gè)茶樹品種加工的抹茶成分檢測結(jié)果如表2所示,從中可知,不同茶樹品種加工的抹茶在成分上存在一定的差異。根據(jù)GB/T 34778—2017(《抹茶》)[8]中抹茶的含水率≤6%判定,4個(gè)品種抹茶均符合要求。水浸出物含量最高的是‘鳩坑’品種,為39.38%;游離氨基酸含量最高的是‘茂綠’品種,為5.14%;可溶性糖含量最高的是‘鳩坑’品種,為5.85%;茶多酚含量最高的是‘茂綠’品種,為12.75%;咖啡堿含量最高的是‘迎霜’品種,為2.47%。

    表2 不同品種抹茶主要生化成分含量Table 2 Contents of main biochemical components in matcha made from different tea cultivars %

    通過HPLC 法進(jìn)一步檢測兒茶素單體的含量,結(jié)果如表3所示。茶葉中兒茶素主要包括非酯型兒茶素和酯型兒茶素。非酯型兒茶素包括沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、兒茶素、表兒茶素等;酯型兒茶素包括沒食子兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯[(-)-epigallocatechin gallate,EGCG]、表兒茶素沒食子酸酯、沒食子酸酯等。4種抹茶樣品的兒茶素中EGCG 含量最高,為6.21%~7.48%,其中EGCG含量最高的品種是‘茂綠’,最低的是‘迎霜’。

    表3 不同品種抹茶兒茶素單體含量Table 3 Catechin monomer contents in matcha made from different tea cultivars %

    研究表明,茶多酚和兒茶素(尤其是EGCG)在降脂減肥、改善脂質(zhì)積累、抑制脂性炎癥損傷等方面有突出的功效[9-10]。因此,選擇4個(gè)品種抹茶中茶多酚和EGCG 含量最高的‘茂綠’用于后續(xù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和功效探索。

    2.2 抹茶對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)小鼠肥胖的作用

    不同飼料喂養(yǎng)8周后,各組小鼠的體質(zhì)量變化、攝食量、空腹血糖水平如表4 所示。各組小鼠的平均初始體質(zhì)量沒有明顯差異,而飼喂8 周后的平均體質(zhì)量終值與體質(zhì)量增量在各組間差異顯著。其中,以HFD 組的平均體質(zhì)量終值與體質(zhì)量增量最大,增量達(dá)14.43 g;NCD 組最小,增量僅5.14 g;添加不同含量抹茶的干預(yù)組在體質(zhì)量增量上較HFD組明顯減少,說明膳食補(bǔ)充抹茶能夠有效緩解高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠體質(zhì)量增加,而且沒有造成小鼠平均攝食量的差異。血液生化檢測結(jié)果也說明,HFD組較NCD 組出現(xiàn)了明顯的血糖水平升高,而膳食補(bǔ)充抹茶后能夠濃度依賴性地改善高脂飲食誘發(fā)的血糖升高。

    2.3 抹茶對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)小鼠肝臟脂質(zhì)積累的作用

    剖取小鼠肝臟進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,結(jié)果如圖1 所示。在HE染色中,肝臟細(xì)胞核被染成藍(lán)色,細(xì)胞質(zhì)被染成紅色,脂肪不著色,在顯微鏡圖中呈現(xiàn)白色空泡。圖1顯示,在HFD組小鼠肝臟中觀察到更多的白色空泡,整體的脂肪浸潤最為突出。而膳食補(bǔ)充抹茶后,肝臟的脂肪浸潤程度得到明顯改善。進(jìn)一步對(duì)小鼠肝臟進(jìn)行油紅O染色,其中肝臟細(xì)胞核被染成藍(lán)色,脂肪被染成紅色。結(jié)果表明,與NCD組小鼠相比,HFD 小鼠肝臟中脂滴數(shù)量明顯增加,同時(shí)呈現(xiàn)炎性浸潤。而飲食添加抹茶能夠顯著改善脂滴積累,且效果隨抹茶含量的增加而增強(qiáng),說明抹茶在改善肥胖相關(guān)肝臟脂質(zhì)積累和炎性病變方面具有良好的潛力。因此,選擇抹茶干預(yù)組中效果最為顯著的1.0%抹茶膳食添加組小鼠(HMH組)用于后續(xù)研究。

    圖1 抹茶對(duì)不同組小鼠肝臟脂質(zhì)積累的影響Fig.1 Effects of matcha on liver lipid accumulation in different groups of mice

    2.4 抹茶對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)小鼠肝臟功能與氧化應(yīng)激水平的影響

    AST和ALT是反映肝臟功能和損害程度的重要指標(biāo)。如圖2 所示,高脂飲食情況下小鼠肝臟中的AST、ALT活性均顯著高于NCD組小鼠。膳食補(bǔ)充1.0%抹茶后,小鼠AST和ALT活性較HFD組都明顯下降。在氧化應(yīng)激水平方面,HFD組小鼠肝臟中的抗氧化酶SOD活性較NCD組小鼠顯著降低,脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 含量顯著升高。與HFD 組相比,抹茶干預(yù)能夠有效提升SOD 的活性(P<0.05),MDA含量也有所降低,但差異不顯著(P>0.05)。

    圖2 抹茶對(duì)不同組小鼠肝臟功能與氧化應(yīng)激水平的影響Fig.2 Effects of matcha on liver function and oxidative stress level in different groups of mice

    2.5 抹茶對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)小鼠肝臟炎癥反應(yīng)的作用與機(jī)制

    采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法對(duì)不同組小鼠肝臟組織中炎癥因子和TLR4/MyD88通路關(guān)鍵基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。如圖3 所示,與NCD 組相比,高脂飲食顯著增加了肝臟組織中TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA 表達(dá)水平。抹茶干預(yù)能夠有效抑制相關(guān)炎癥因子的表達(dá),其中TNF-α和IL-1β的表達(dá)水平較HFD 組顯著降低(P<0.05),而對(duì)IL-6的抑制效果不顯著(P>0.05)。在作用通路方面,抹茶干預(yù)能夠有效降低高脂飲食誘導(dǎo)的TLR4高表達(dá),并表現(xiàn)出對(duì)其下游基因MyD88的明顯抑制,說明膳食補(bǔ)充抹茶能夠通過抑制TLR4/MyD88 通路的激活,改善高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝臟炎癥反應(yīng)。

    圖3 抹茶對(duì)不同組小鼠肝臟炎癥因子和TLR4/MyD88 通路基因表達(dá)的影響Fig.3 Effects of matcha on relative expression levels of inflammatory cytokine and TLR4/MyD88 signaling pathway gene in different groups of mice

    3 討論

    肥胖一般由能量攝入與消耗之間的不平衡導(dǎo)致,其是2 型糖尿病、高血壓、高脂血癥、NAFLD 等多種代謝綜合征的關(guān)鍵誘因[11]。NAFLD 全球患病率約為25%,威脅著全球公共健康[12]。NAFLD初期臨床表現(xiàn)為肝臟脂肪大量積累并誘發(fā)脂肪性肝臟炎癥,中后期發(fā)展出肝臟組織纖維化、硬化等情況,最終甚至可能造成肝臟癌變[13]。尋找安全、有效的NAFLD干預(yù)手段成為亟待解決的科學(xué)問題。

    抹茶是一種在特定栽培方式和加工方法下生產(chǎn)出的可食用粉狀綠茶,其“吃茶”的食用方法意味著全部有效成分都能被人體攝入。研究顯示,抹茶中的氨基酸、多酚和EGCG 等成分具有較好的抗氧化、抗炎等活性[14]。本研究選擇‘迎霜’‘鳩坑’‘中茶108’和‘茂綠’4 個(gè)茶樹品種加工的抹茶樣品,對(duì)其生化成分進(jìn)行檢測。結(jié)果表明,不同品種的抹茶在生化成分含量方面有所區(qū)別,其中‘茂綠’品種的茶多酚和兒茶素含量(尤其是最具活性的EGCG 的含量)在4個(gè)品種中最高,為其具有較高的相關(guān)生物活性功能奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)?;诟咧嬍痴T導(dǎo)的肥胖小鼠模型研究結(jié)果表明,抹茶可以有效改善高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖和相關(guān)肝功能異常。經(jīng)過8周的高脂飲食后,HFD 組小鼠出現(xiàn)了一系列的癥狀,包括體質(zhì)量顯著增加、血糖異常升高、肝臟脂質(zhì)沉積明顯等。而膳食補(bǔ)充抹茶顯著抑制了小鼠的體質(zhì)量增加,并表現(xiàn)出降低高血糖、改善肝臟脂質(zhì)積累的作用。以上結(jié)果表明,抹茶作為一種安全、流行的新式健康飲品,在預(yù)防食源性肥胖和緩解相關(guān)的肝臟脂質(zhì)過度積累方面具有良好的潛力。

    研究表明,肥胖的發(fā)生及相關(guān)代謝綜合征的發(fā)展與慢性低度的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[15]。當(dāng)機(jī)體處于過量攝入營養(yǎng)的狀態(tài)下,脂肪組織、肝臟組織等代謝組織會(huì)響應(yīng)這一狀態(tài),誘發(fā)炎癥因子的釋放,進(jìn)而表現(xiàn)為慢性低度的炎癥反應(yīng)[16]。由此造成的胰島素抵抗和代謝功能障礙被認(rèn)為是諸多代謝疾病產(chǎn)生的重要誘因[17]。近年來,關(guān)于食源性肥胖導(dǎo)致的代謝組織炎癥反應(yīng)和相關(guān)機(jī)制已成為很多科學(xué)家關(guān)注的熱點(diǎn)。通過降低炎癥反應(yīng)的干預(yù)手段來防治肥胖及相關(guān)代謝性疾病也成了新的治療策略[18]。

    TLR4 相關(guān)通路已被報(bào)道與肥胖相關(guān)的肝臟炎癥密切相關(guān)[19]。TLR4 是細(xì)胞表面模式識(shí)別受體TLRs 家族的重要成員,廣泛存在于多種免疫細(xì)胞的表面,在機(jī)體免疫應(yīng)答方面發(fā)揮著重要作用[20]。TLR4介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)包括MyD88依賴性和MyD88非依賴性2種途徑,其中MyD88依賴性途徑已被證明為多種植物活性成分治療NAFLD的有效靶點(diǎn)[21]。當(dāng)過量攝入營養(yǎng)和能量時(shí),循環(huán)系統(tǒng)和組織中的游離脂肪酸水平升高,促進(jìn)了TLR4的激活,并啟動(dòng)募集下游信號(hào)配體MyD88的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。MyD88與白介素1受體相關(guān)激酶結(jié)合后激活泛素連接酶腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor receptorassociated factor 6,TRAF6)?;罨腡RAF6 通過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),最終導(dǎo)致核因子-κB(nuclear factorκB,NF-κB)的激活和細(xì)胞核轉(zhuǎn)移,誘發(fā)炎性細(xì)胞因子的釋放和細(xì)胞損傷[22]。本研究結(jié)果表明,抹茶能夠顯著抑制高脂飲食誘導(dǎo)的肝臟TLR4和下游信號(hào)配體MyD88的激活,有效降低TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥因子的表達(dá)水平,說明TLR4 的MyD88 依賴性途徑是抹茶改善高脂誘導(dǎo)的肝臟炎癥反應(yīng)的有效作用靶點(diǎn)。

    綜上所述,抹茶作為一種富含茶多酚等活性成分的健康飲品,可以減輕高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖及相關(guān)肝臟脂肪變性和脂肪性肝炎的病理過程,其機(jī)制可能與調(diào)控TLR4及其下游MyD88基因信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān),揭示了抹茶作為降脂減肥和改善非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD)有效手段的潛力,為茶葉資源綜合利用和保健功能開發(fā)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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