敲降同源異型盒C8對7因子誘導的體細胞重編程的抑制作用

黃依，方仕才，王波，明金，李陳，裴端卿*

（1.廣州醫(yī)科大學-中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院聯(lián)合生命科學學院，廣州 511436；2.中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院，廣州 510530；3.生物島實驗室（廣州再生醫(yī)學與健康廣東省實驗室），廣州 510530）

2006 年，日本科學家山中伸彌研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠胚胎成纖維細胞（mouse embryonic fibroblasts,MEFs）中過表達4個轉(zhuǎn)錄因子OCT4、SOX2、KLF4、C-MYC（OSKM），可將該成纖維細胞誘導為多能干細胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）[1]。隨著研究深入和技術(shù)迭代，出現(xiàn)了非OSKM因子誘導[2]、小分子化合物誘導[3]、小分子化合物結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子誘導[4]等方法。這些誘導方法不僅為細胞命運轉(zhuǎn)變提供了更多研究模型，也有助于通過比較系統(tǒng)之間的差異來全面認識細胞命運轉(zhuǎn)變的本質(zhì)規(guī)律。2019 年，本實驗室報道了7 因子（Jdp2-Jhdm1b-Mkk6-Glis1-Nanog-Esrrb-Sall4）重編程體系，并發(fā)現(xiàn)同源異型盒（homeobox,Hox）基因家族在7 因子重編程中表達上調(diào)[5]。但該家族基因在7 因子重編程中的具體作用仍然未知。

在小鼠胚胎發(fā)育過程中，Hox基因家族對足趾形成及其附件形態(tài)發(fā)生具有重要調(diào)控作用[6-8]。Hox-9、Hox-10和Hox-11直系或旁系同源物的表達可定義軸向受限的脊髓小腦束神經(jīng)元的位置[9]。Hoxc8突變可導致小鼠胚胎后足骨骼發(fā)育畸形[10]。在癌癥發(fā)展過程中，Hox基因家族同樣扮演重要角色，既可充當轉(zhuǎn)錄激活因子，也可充當轉(zhuǎn)錄抑制因子[11]。在多種腫瘤細胞中，Hoxc8異常高表達，且可促進腫瘤細胞侵襲和遷移，產(chǎn)生較差的預后[12-14]。同時，Hoxc8在此過程中極大地促進了腫瘤細胞的增殖[15-16]。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中，敲降Hoxc8可顯著抑制U251 與LN229 細胞系的增殖，同時降低上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）過程中相關(guān)基因的蛋白水平和腫瘤細胞的遷移能力[17]?？傊?，Hox基因家族在胚胎發(fā)育與腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色，其中Hoxc8對細胞的增殖促進尤為顯著，但它在多能性網(wǎng)絡重建等細胞命運轉(zhuǎn)變過程中的作用尚未見報道。本研究通過短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA,shRNA）抑制Hoxc8的表達可顯著抑制7 因子誘導的體細胞重編程，表明Hoxc8在體細胞重編程中具有重要的作用，并且初步探索了與其相關(guān)的機制，旨在為深入揭示Hoxc8調(diào)控細胞命運轉(zhuǎn)變的機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞株及培養(yǎng)基

Plat-E、OG2-MEF、293T 細胞株均來源于筆者所在實驗室，其中OG2-MEF 由攜帶Oct4-GFP等位基因的CBA/CaJ×C57BL/6J 雄鼠與129S4/SvJaeJ雌鼠雜交后從懷孕13.5 d 小鼠的胚胎中分離得到。10%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）培養(yǎng)基：由DMEM（Dulbecco’s modified Eagle medium）高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基（美國HyClone 公司，貨號SH30022.01）、10%胎牛血清（阿根廷Natocor公司，貨號SFBE）、1/100非必需氨基酸（美國Gibco 公司，貨號11140076）、1/100 Glutmax（美國Gibco 公司，貨號35050079）組成。iPSCs 合成培養(yǎng)基1（iPSCs chemically defined medium 1,iCD1）：筆者所在實驗室專利，詳細配方參見文獻[4]。

1.2 實驗材料及試劑

pMX-Jdp2、pMX-Glis1、pMX-Esrrb、pMX-Sall4、pMX-Jhdm1b、pMX-Nanog、pMX-Mkk6、pMX-Hoxc8、pMX-Smad6、pGL3-basic、pTK-Renilla，以 及 含DsRed、shLuciferase的質(zhì)粒（由筆者所在實驗室提供）；CaCl2溶液和2×HBS 試劑（實驗室內(nèi)配制）；質(zhì)粒小提試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，貨號DP103-03]；質(zhì)粒大提試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，貨號P1156-03]；SYBR Green熒光染料（ChamQ SYBR qPCR Master Mix，南京諾唯贊生物科技股份有限公司，貨號Q311-02）；雙螢光素酶報告基因系統(tǒng)（Dual-Luciferase ReporterAssay System，美國Promega公司，貨號E1910）。

1.3 pSuper-shRNA 的構(gòu)建

通過Sigma-Aldrich網(wǎng)站（https://www.sigmaaldrich.cn）挑選已驗證過的shRNA 序列，針對Hoxc8和Smad6同時設計2 條shRNA，送至廣州艾基生物技術(shù)有限公司合成，對合成的shRNA 引物退火后，使用BglⅡ和HindⅢ對反轉(zhuǎn)錄病毒載體pSuper進行雙酶切，然后將退火后的引物與酶切后的pSuper載體進行酶連，并轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α中，挑單菌落進行測序，經(jīng)檢測正確后提取質(zhì)粒，命名為pSupershRNA。實驗中使用的引物序列如下：shHoxc8-610，CGAAGGACAAGGCCACTTAAA；shHoxc8-698，CGACAAACTTACAGCCGGTAT；shSmad6-526，CCGATTCTACATTGTCTTACA；shSmad6-527，GCTGGAGATCCTACTCAACAA。

1.4 細胞培養(yǎng)和shRNA 敲降效率檢測

Plat-E、OG2-MEF 細胞株均使用10% FBS 培養(yǎng)基，在5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用Plat-E細胞包裝pSuper-shRNA 反轉(zhuǎn)錄病毒，分別在轉(zhuǎn)染后36、48 h 收樣，感染OG2-MEFs。在感染48 h 后加入嘌呤霉素（puromycin,Puro）進行抗性篩選，以未感染的OG2-MEFs 全部死亡為標準，收樣，提取RNA，并檢測Hoxc8和Smad6的表達水平。

1.5 細胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前一天將8×106個Plat-E 細胞接種至含10%FBS培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿（直徑100 mm）中，保證第2 天轉(zhuǎn)染時其密度約為80%。對7 因子正式開始轉(zhuǎn)染前先更換7.5 mL 新鮮的10% FBS 培養(yǎng)基，并在15 mL離心管中配制轉(zhuǎn)染試劑[7 因子質(zhì)粒使用量25 μg，依次加入2 mol/L CaCl2156.25μL（工作濃度為125 mmol/L）、2×HBS 1 250μL，最后加蒸餾水補足至2 500μL]，將配制的轉(zhuǎn)染試劑吹打混勻后逐滴加至培養(yǎng)皿中，微微搖晃混勻，在5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后12～16 h 再次更換新鮮的10%FBS培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.6 反轉(zhuǎn)錄病毒感染OG2-MEF和誘導多能干細胞

提 前12～16 h 將OG2-MEFs 以1.5×104個/孔接種到24 孔板中，使其完全貼壁。分別在36、48 h收集含Jdp2、Glis1、Esrrb、Sall4、Jhdm1b、Nanog、Mkk6基因的反轉(zhuǎn)錄病毒，并按1∶0.5∶1∶1∶1∶1∶1 混合，每孔加入0.25 mL 10%FBS 培養(yǎng)基及1.625 mL病毒混合液，再加入終質(zhì)量濃度為4～8μg/mL的聚凝胺（polybrene），感染OG2-MEF 細胞。繼續(xù)感染24 h 后，將病毒液吸盡，向每孔添加0.5 mL 新鮮配制的iCD1誘導培養(yǎng)基。以后每天定時更換iCD1誘導培養(yǎng)基，誘導7 d 后使用BioStation CT 4 倍物鏡（日本尼康株式會社）對24孔板進行圖像掃描，然后導出圖像至計算機，使用Image J 軟件（設定閾值65～255）對獲得的圖像中綠色熒光蛋白（green fluorescent protein, GFP）陽性克?。∣ct4-GFP+）進行計數(shù)，并與顯微鏡下人工計數(shù)進行匹配。

1.7 實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR）

棄去上述24 孔板中的培養(yǎng)基，在每孔中加入0.5 mL TRIzol 試 劑（美 國Invitrogen 公 司，貨 號15596026），反復吹打至細胞完全裂解，然后將樣品收集至1.5 mL離心管中，加入100μL三氯甲烷，漩渦混勻10 s 后于室溫條件下放置5 min，然后以4 ℃、1.4×104r/min離心15 min。吸取上層水相至提前分裝好并預冷的含400μL異丙醇的1.5 mL離心管中，混勻，在冰上放置10 min 后，以4 ℃、1.4×104r/min離心10 min，棄上清液，再用75%無水乙醇清洗沉淀，離心，棄上清液，在空氣中晾干，加入適量的無RNA酶水溶解。測濃度后，取1μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用SYBR Green熒光染料摻入法進行qRT-PCR擴增，檢測在轉(zhuǎn)錄組水平上Hoxc8和Smad6的表達。

1.8 雙螢光素酶報告基因系統(tǒng)的構(gòu)建

選取SMAD家族成員6（SMAD family member 6,Smad6）轉(zhuǎn)錄起始位點前的2 kb 構(gòu)建pGL3 質(zhì)粒，引物序列為5'-GGTACCGAGCTCTTACGCGTCATC ACATAGTTACATGCCTCTCC-3'（上游），5'-AGTA CCGGAATGCCAAGCTTAGACACTTTGGCGGCT CC-3'（下游）。首先在24孔板中每孔加入1.0×106個293T 細胞、100 ng pGL3-Smad6啟動子、1 ng pTKRenilla 和200 ng pMX-Hoxc8，在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接著在轉(zhuǎn)染8～10 h 后更換新鮮的10% FBS 培養(yǎng)基，72 h 后加入100 μL 1×被動裂解緩沖液（passive lysis buffer,PLB），于室溫條件下在搖床上振蕩15 min，然后收集至1.5 mL 離心管中，以1.2×104r/min離心30 s。最后轉(zhuǎn)到96孔板中，每孔加入20μL 裂解上清液和100μL 螢光素酶檢測試劑Ⅱ（Luciferase Assay Reagent Ⅱ），上機檢測其螢光素酶活性，讀數(shù)值為L，再加入100 μL Stop&Glo試劑，讀數(shù)值為R。螢光素酶活性改變趨勢用L/R表示。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

各組實驗獨立重復3次，結(jié)果以平均值±標準差表示，并采用GraphPad Prism 6.0軟件對結(jié)果進行統(tǒng)計學差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 敲降Hoxc8 抑制7 因子誘導的體細胞重編程

對敲降Hoxc8的shRNA效率進行檢測，結(jié)果顯示，與對照shLuciferase相比，2條shRNA即shHoxc8-610、shHoxc8-698 均具有顯著的敲降效率（圖1A）。整孔掃描結(jié)果顯示，在7 因子誘導的體細胞重編程中敲降Hoxc8降低了Oct4-GFP 陽性克?。∣ct4-GFP+）數(shù)目（圖1B～C）。

圖1 敲降Hoxc8的結(jié)果Fig.1 Results of knocking down Hoxc8

2.2 過表達Hoxc8 對7 因子誘導的體細胞重編程無影響

從圖2A～B 中可見，與對照DsRed相比，過表達Hoxc8對7 因子誘導的體細胞重編程無影響（P＞0.05）。

圖2 過表達Hoxc8的結(jié)果Fig.2 Results of overexpressing Hoxc8

2.3 敲降Hoxc8 對經(jīng)典的體細胞重編程分子事件無影響

為了進一步探究Hoxc8參與調(diào)控7因子誘導的體細胞重編程的分子機制，收集重編程過程中敲降Hoxc8第0、1、3、5、7天的細胞樣品，利用qRT-PCR對已報道的體細胞重編程中關(guān)鍵分子事件進行檢測。結(jié)果表明：首先，敲降Hoxc8不影響多能性標記基因Oct4、Dppa5a、Sox2、Rex1、Dnmt3l的上調(diào)（圖3A）；其次，間質(zhì)細胞標記基因Snail、Twist2、Cdh2和上皮細胞標記基因Cdh1、Cldn3、Epcam的表達在敲降Hoxc8后并無顯著性差異（圖3B）；再次，敲降Hoxc8也不影響體細胞標記基因Jun-B、Runx1的下調(diào)（圖3C）；最后，敲降Hoxc8對細胞增殖標記基因Trp53、Cdkn1a的表達也無影響（圖3D）。綜上所述，在7因子誘導的體細胞重編程中敲降Hoxc8對必然發(fā)生的重編程分子事件無影響。

圖3 基因表達結(jié)果的qRT-PCR檢測Fig.3 Gene expression results detected by qRT-PCR

2.4 敲降Smad6 可挽救由敲降Hoxc8 引起的重編程效率下降

因Smad6和Hoxc8在轉(zhuǎn)錄水平具有相互調(diào)控關(guān)系，故進一步探討是否可通過調(diào)節(jié)Smad6恢復由敲降Hoxc8引起的抑制情況。結(jié)果表明：構(gòu)建的2 條Smad6基因的shRNA（shSmad6-526和shSmad6-527）表達量明顯降低，具有顯著的敲降效率（圖4A）。單獨敲降Smad6對7因子誘導的體細胞重編程無顯著影響（圖4B）。但同時敲降Smad6與Hoxc8可使敲降Hoxc8導致的重編程效率下降情況得到恢復（圖4C）。該結(jié)果暗示Samd6有可能是受Hoxc8調(diào)控的下游靶基因。對此，我們設計了針對Smad6啟動子（轉(zhuǎn)錄起始位點前2 kb）的雙螢光素酶報告系統(tǒng)。結(jié)果表明，與對照pGL3-basic相比，當在293T細胞中將過表達的Hoxc8、pGL3-Smad6啟動子和pTK-Renilla 共轉(zhuǎn)染時，螢光素酶活性提高了1 030倍（圖4D）。

圖4 同時敲降Smad6和Hoxc8的結(jié)果Fig.4 Results of simultaneous knockdown of Smad6 and Hoxc8

3 討論和結(jié)論

在體細胞重編程過程中轉(zhuǎn)錄因子之間相互協(xié)調(diào)，并結(jié)合相關(guān)表觀修飾復合物參與靶向基因沉默與激活，從而誘導細胞命運發(fā)生轉(zhuǎn)變。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)Hox基因家族成員Hoxc8在7因子誘導的體細胞重編程中具有重要作用。通過shRNA 敲降Hoxc8阻礙了體細胞重編程，而敲降Smad6則可挽救由敲降Hoxc8引起的重編程效率下降，表明Hoxc8與Smad6之間可能存在相互調(diào)控關(guān)系。首先，Hoxc8屬于同源異型盒家族，具有DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，可以結(jié)合到特定的DNA 區(qū)域來調(diào)控基因表達（例如Smad6），從而影響體細胞重編程[10]。LEI 等[18]通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（chromatin immunoprecipitation assay,ChIP）發(fā)現(xiàn)，Hoxc8可通過調(diào)控其下游靶基因細胞凋亡鋅指蛋白調(diào)節(jié)因子（zinc finger protein regulator of apoptosis,Zac1）的表達，改變早期胚胎發(fā)育的進程。Hoxc8在胚胎發(fā)育過程中還參與了骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）信號的調(diào)控。Hoxc8充當BMP 信號傳導的轉(zhuǎn)錄抑制因子，該信號通路對于重編程不是必要的[19]；而Smad6同樣是BMP信號的負反饋調(diào)節(jié)因子，可抑制BMP 信號的過度激活。因此，這有可能是同時敲降Smad6與Hoxc8可以使單獨敲降Hoxc8導致的重編程效率降低情況得到恢復的原因。其次，Hoxc8在從正常細胞演變?yōu)槟[瘤細胞過程中扮演了重要的角色，其在多種腫瘤細胞中極大地促進了細胞增殖[11,20-21]。小鼠體細胞重編程依賴于細胞的增殖，其中超快分裂細胞亞群占總重編程細胞的99%以上[22]。另有研究表明，通過分選高速增殖的細胞，也可以提高重編程的效率[23]。Hoxc8可直接增強KDM1A 轉(zhuǎn)錄，而KDM1A 活性較低時可導致細胞周期停滯在G0/G1期，影響細胞生長[24-25]。在本研究中，敲降Hoxc8之后并不影響重編程中增殖基因的表達，造成該差異的原因可能是不同實驗室所使用的細胞類型不一致。最后，已有的研究表明，間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化（mesenchymalepithelial transition,MET）是成纖維細胞重編程早期的重要過程，而在正常的MET 之前引入短暫的EMT可以有效提高重編程效率[26]。Hox家族在腫瘤發(fā)生發(fā)展中可促進EMT的進程。分析顯示，癌組織中的間質(zhì)細胞標記基因Snail和β-catenin的表達水平顯著上升。而與癌旁組織相比，癌組織中的上皮細胞標記基因E-cadherinmRNA 和蛋白表達水平較低[27]。由此推測，在7 因子誘導的體細胞重編程中敲降Hoxc8可能不利于EMT進程，從而阻礙了細胞命運轉(zhuǎn)變。綜上所述，Hoxc8在介導7 因子誘導的體細胞重編程中發(fā)揮了重要的作用，但是其具體的調(diào)控機制仍然需要更深入的研究。