不同百合種質資源對灰霉病的抗性

張銘芳， 李 卉， 韓東洋， 杜運鵬， 薛 靜， 高俊蓮， 張秀海

(1.北京市農林科學院草業(yè)花卉與景觀生態(tài)研究所，農業(yè)農村部華北都市農業(yè)重點實驗室，北京 100097； 2.北京林業(yè)大學園林學院，北京 100083)

百合(Liliumspp.)屬于百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)，為多年生球根花卉，具有重要的觀賞、食用、藥用價值[1]。然而，在百合的栽培過程中均容易發(fā)生病害[2]。其中，灰霉病是百合的主要病害之一，百合感染灰霉病后主要危害葉片，也會危害花蕾、芽。初期在葉片形成橢圓形斑塊，后期布滿淺褐色灰霉狀物，使葉片腐爛，花朵腐爛凋萎?；颐共斐砂俸夏戤a量損失20%～30%，嚴重流行時可造成失收[3]。然而，目前針對百合不同種質資源的灰霉病抗性評價系統(tǒng)在灰霉病抗性育種方面的利用還較少。

灰霉病主要是由半知菌葡萄孢屬菌侵染所引起的一類植物病害的總稱，其中灰葡萄孢(Botrytiscinerea)危害最大，寄主范圍最廣。對于不同百合品種灰霉病抗性的鑒定，一般采用離體葉片菌絲塊接種法和田間孢子噴霧法2種方法，統(tǒng)計相對病情指數，采用相對抗病性方法將百合對于灰霉病的抗性分為免疫、高抗、中抗、中感、高感5個等級[4-5]?；颐咕軌蛞鸺闹鞒绦蛐约毎劳鯷6]，具有復雜的代謝系統(tǒng)，可產生毒素[7]、細胞壁降解酶、脫落酸[8]、多糖[9]、漆酶[10]等多種代謝產物?；钚匝?ROS)是植物體內正常代謝的信號小分子，具有很強的氧化能力，參與植物和細胞內的分子、生化、生理反應，在植物的防衛(wèi)反應和細胞程序性死亡過程中具有重要作用。植物葉片中的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)與植物抗病性有緊密的聯(lián)系，被認為是植物抗病反應中的關鍵性酶。

因此，本研究擬對不同百合種質資源的灰霉病抗性進行系統(tǒng)評價，并結合形態(tài)學觀察、ROS及酶活性測定，探討其生理生化方面的抗病機制，以期為培育高抗病百合新優(yōu)種質奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究的試驗材料為11份百合種質資源(表1)。品種的種球從荷蘭進口，野生種采集于中國百合不同分布區(qū)，種植于北京市農林科學院溫室，給予適宜的日常養(yǎng)護管理。

表1 11份百合種質資源

1.2 百合葉片表面結構及病原菌生長進程電鏡觀察

選取健康的百合葉片，在掃描電鏡下觀察葉片正面、背面的細胞形態(tài)、氣孔密度以及氣孔大小。購買灰葡萄孢(Botrytiscinerea)菌株(ACCC37263)，PDA(Potato dextrose agar)培養(yǎng)基28 ℃活化培養(yǎng)，并在掃描電鏡下觀察病原菌不同生長時期的生長情況、菌絲結構、孢子形態(tài)以及孢子數量。

1.3 不同百合種質資源的灰霉病抗病性鑒定

本研究采用葉片離體接種的方法來鑒定不同百合種質資源對于灰霉病的抗病性。選取百合植株中部、上部健康葉片，將活化后菌板用5 mm的打孔器打成菌塊，分別接種在葉片背面，放置在相對濕度為90%以上的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，對照組為不接種。統(tǒng)計不同百合種質資源的發(fā)病情況，并對百合灰霉病進行分級[11]，具體標準見表2及表3。

表2 百合灰霉病葉部病斑分級標準

表3 百合抗灰霉病抗性水平分級標準

1.4 過氧化氫(H2O2)、超氧陰離子(O2·-)含量的測定

選擇高抗(HR)、高感(HS)材料，在百合葉片表面噴灑濃度為1 ml 5×104個孢子的灰霉菌孢子液，對照組噴灑蒸餾水。掃描電鏡下觀察分生孢子在葉片上2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h、72 h時的生長、侵染情況，并按照時間節(jié)點取材，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱貯藏，用于后續(xù)試驗。

采用碘化鉀分光光度法測定過氧化氫含量。先制作過氧化氫的標準曲線。然后在4 ℃條件下，稱取0.2 g百合葉片，放入3.0 ml 0.1%三氯乙醇溶液(TCA)中，12 000 r/min離心15 min，取0.5 ml上清液，與0.5 ml 10 mmol/L磷酸緩沖液(PBS，pH=7.0)和1.0 ml的1 mol/L碘化鉀(KI)溶液混合，暗反應1 h后，在分光光度計390 nm波長下檢測，根據回歸方程計算過氧化氫的含量[12]。

采用羥氨氧化法測定超氧陰離子含量。先制作超氧陰離子標準曲線。然后在4 ℃條件下，稱取0.2 g百合葉片，與3.0 ml 50 mmol/L PBS(pH=7.8)混合，12 000 r/min離心15 min，取1.0 ml的上清液，與0.9 ml PBS和0.1 ml 10 mmol/L鹽酸羥胺混合，25 ℃條件下反應1 h，之后試管內按順序分別加入1.0 ml 17 mmol/L對氨基苯磺酸以及1.0 ml 1 mmol/Lα-萘胺，在25 ℃條件下繼續(xù)反應20 min，最后在波長為530 nm分光光度計下檢測，根據回歸方程計算其含量[13]。

1.5 超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性的測定

在4 ℃條件下稱取0.5 g百合葉片，加入10 ml pH為7.8的緩沖液(1 mmol/L乙二胺四乙酸，2 mmol/L鹽酸羥胺和1%可溶聚乙烯吡咯烷酮的50 mmol/L PBS)混合，12 000 r/min離心15 min，上清液就是抗氧化酶的提取物。采用氯化硝基四氮唑藍(NBT)光還原法測定超氧化物歧化酶活性[14]，通過240 nm處由于過氧化氫分解而導致的吸光度降低來測定過氧化氫酶的活性[15]。

1.6 數據統(tǒng)計

所有試驗設3個重復，數據通過Microsoft Excel 2010和SPSS軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 葉片結構

不同百合種質資源的葉片氣孔(×250顯微鏡下觀察)及表面附屬物觀察結果(表4)顯示，氣孔密度最大的為卷丹百合，氣孔密度最小的則是2065-1。氣孔最大的為2065-1，氣孔最小的是岷江百合-1。

表4 不同百合種質葉片氣孔密度、大小及表面附屬物對比

部分百合葉片有蠟質層(圖1)，但是蠟質顆粒的大小、數量、分布均不同。葉片存在蠟質層的有：湖北百合、宜昌百合、卷丹百合、岷江百合-1、Craming Diamonds、Champion Diamonds。其中湖北百合葉片的蠟質顆粒最多，葉正面以及葉背面均有分布。宜昌百合葉背面的蠟質顆粒分布少，主要集中在氣孔周圍，而岷江百合-1、Craming Diamonds、Champion Diamonds的蠟質顆粒只分布在葉正面，葉背面并未發(fā)現(xiàn)蠟質顆粒(圖2)。

a：湖北百合葉面；b：卷丹百合葉面。圖1 不同百合種質葉片表面結構對比Fig.1 Comparison of leaf surface structure of different lily germplasms

a：宜昌百合葉背面；b：岷江百合-1葉背面。圖2 不同百合種質葉背面氣孔周圍蠟質顆粒分布對比Fig.2 Comparison of wax particles distribution around stoma between different lily germplasms

2.2 百合種質資源的抗病性

離體接種后，劃分不同百合種質資源的抗病性等級(圖3)，統(tǒng)計結果如表5顯示。野生種卷丹百合屬于高感(HS)種質；野生種岷江百合-1、岷江百合-2、雜交種2065-1屬于中抗(R)種質；野生種宜昌百合、湖北百合、雜交種2065-22以及品種Champion Diamonds、雷林石、Craming Diamonds、紅唇屬于高抗(HR)種質(圖4)。其中，湖北百合抗性最強，卷丹百合抗性最弱，接種后第9 d時，葉片病情指數達到100%。

0～9為病級數，具體見表2。圖3 百合灰霉病葉部病斑分級標準Fig.3 Grade standard for leaf patches of lily infected with Botrytis cinerea

A：Craming Diamonds；B：紅唇；C：湖北百合；D：岷江百合-2；E：Champion Diamonds；F：宜昌百合；G：岷江百合-1；H：2065-22；I：2065-1；J：卷丹百合；K：雷林石。圖4 百合不同種質接種灰霉菌后的葉斑情況Fig.4 Leaf patches of lily after inoculation with Botrytis cinerea

表5 不同百合種質的抗病性

2.3 灰霉菌孢子侵染百合葉片進程觀察

在掃描電鏡下觀察可見，孢子溶液噴灑后2 h，分生孢子已經開始萌發(fā)，最大能長至500 μm，整體呈棒狀。12 h時，部分分生孢子已經從側面分生出第二條菌絲，但也有部分孢子停止生長。24 h后，高抗百合葉片上留存的分生孢子數量較少，而高感百合葉片上留存的分生孢子數量較多。72 h時，高抗、高感百合葉片上均產生新的分生孢子。隨著接種時間的延長，湖北百合葉片上的孢子數量逐漸變少，且菌絲的生長速度明顯慢于卷丹百合葉片上的菌絲(圖5)。

a：高抗種質湖北百合葉面；b：高感種質卷丹百合葉面。圖5 高抗、高感百合葉片上分生孢子萌發(fā)及菌絲生長情況對比Fig.5 Comparison of conidia germination and mycelial growth in the leaves of lily with high resistance and high susceptibility to Botrytis cinerea

2.4 高抗、高感百合葉片中過氧化氫(H2O2)、超氧陰離子(O2·-)含量的變化

測定湖北百合、卷丹百合接種灰霉菌后葉片中過氧化氫含量，結果(圖6)顯示，與不接種灰霉菌對照組相比，接種灰霉菌試驗組的反應更為迅速，接種2 h時，試驗組的過氧化氫含量就已經下降，而對照組則是在4 h時才開始下降。對比卷丹百合和湖北百合葉片內過氧化氫含量的變化趨勢，發(fā)現(xiàn)湖北百合的波動較卷丹百合更為劇烈，而卷丹百合中會積累更多的過氧化氫。

a：高抗種質湖北百合；b：高感種質卷丹百合。試驗組：接種灰霉菌；對照組：不接種灰霉菌。圖6 接種灰霉菌后高抗、高感百合葉片中過氧化氫含量對比Fig.6 Comparison of hydrogen peroxide content between high resistant and high sensitive lily germplasms after inoculation with Botrytis cinerea

測定湖北百合、卷丹百合接種灰霉菌后葉片中超氧陰離子含量，結果(圖7)顯示，接種灰霉菌后，卷丹百合葉片中超氧陰離子的含量總體趨向減少，且波動劇烈，而湖北百合葉片中超氧陰離子的含量則總體趨向增多。從整體上看，與不接種灰霉菌對照組相比，接種灰霉菌試驗組百合體內超氧陰離子含量變化與百合灰霉病的抗病性可能存在一定的相關性。與對照組相比，試驗組的高抗種質湖北百合葉片中超氧陰離子含量在接種灰霉菌24 h內，出現(xiàn)了2次峰值(接種后2 h、12 h)，而高感種質卷丹百合葉片中超氧陰離子含量只出現(xiàn)1次峰值(接種后8 h)。接種24 h后，隨著時間的推移，超氧陰離子含量變化逐漸平緩。本研究結果與前人報道的研究結果[20]類似，即抗病性強的植物體內活性氧含量會出現(xiàn)2次突增期。

a：高抗種質湖北百合；b：高感種質卷丹百合。試驗組：接種灰霉菌；對照組：不接種灰霉菌。圖7 接種灰霉菌后高抗、高感百合葉片中超氧陰離子含量對比Fig.7 Comparison of O2·- content between high resistant and high sensitive lily germplasms after inoculation with Botrytis cinerea

2.5 高感、高抗百合葉片中抗氧化酶活性的變化

測定湖北百合、卷丹百合接種灰霉菌后葉片中超氧化物歧化酶(SOD)活性，結果(圖8)表明，從葉片中超氧化物歧化酶活性的變化趨勢上看，卷丹百合接種灰霉菌試驗組與不接種灰霉菌對照組大致相同，湖北百合的對照組與試驗組則有明顯的差別，對照組整體變化趨勢平緩，而試驗組則出現(xiàn)了明顯變化，在接種后2 h時超氧化物歧化酶活性明顯降低，在24 h后超氧化物歧化酶活性持續(xù)變強，而卷丹百合中并未出現(xiàn)這種現(xiàn)象。測定湖北百合及卷丹百合接種灰霉菌后葉片中過氧化氫酶(CAT)活性，結果(圖9)表明，湖北百合不接種灰霉菌對照組無明顯變化，接種灰霉菌試驗組略有波動，但與對照組未產生顯著差異；卷丹百合葉片中CAT活性變化趨勢與湖北百合類似。

a：高抗種質湖北百合；b：高感種質卷丹百合。試驗組：接種灰霉菌；對照組：不接種灰霉菌。圖8 接種灰霉菌后高抗、高感百合種質葉片中超氧化物歧化酶(SOD)活性對比Fig.8 Comparison of superoxide dismutase (SOD) activity in leaves of high resistant and high sensitive lily germplasms after inoculation with Botrytis cinerea

a：高抗種質湖北百合；b：高感種質卷丹百合。試驗組：接種灰霉菌；對照組：不接種灰霉菌。圖9 接種灰霉菌后高抗、高感百合種質葉片中過氧化氫酶(CAT)活性對比Fig.9 Comparison of catalase (CAT) activity in leaves of high resistant and high sensitive lily germplasms after inoculation with Botrytis cinerea

3 討 論

抗灰霉病一直是百合抗病育種的主要目標之一，但灰霉病菌傳播媒介多，寄主范圍廣，因此鑒定、應用新的抗病種質資源，培育高抗灰霉病品種是最有效的方法。中國是百合野生資源的重要分布中心，但目前依然缺乏對其抗灰霉病特性的系統(tǒng)評價。

11份不同百合種質資源的葉片形態(tài)觀察及抗病性評價結果表明，百合的抗病性可能與葉片表面蠟質結構具有一定的相關性?？盗⒐Φ萚16]在研究番茄時也發(fā)現(xiàn)蠟質的抗性作用主要是從物理性上阻止病原菌的穿透。此外，氣孔是病原菌侵入植物體內的重要途徑之一，氣孔密度、氣孔大小與植物的抗病性有一定的相關性。本研究結果表明，百合灰霉病的抗病性與氣孔大小、密度沒有顯著的相關性。

植物受到傷害，最先引發(fā)體內活性氧的增加，在植物體內的保護酶系統(tǒng)中，超氧化物歧化酶能夠消除超氧陰離子，而過氧化氫酶則能分解過氧化氫，通過協(xié)同作用清除活性氧[17-21]。高抗種質湖北百合在接種病原菌后，其葉片中超氧陰離子含量出現(xiàn)2次峰值(接種后2 h、12 h)，而高感種質卷丹百合只出現(xiàn)1次峰值(接種后8 h)，此結果與稻瘟菌侵染水稻幼苗前后活性氧變化情況的試驗結果[22]相似。本研究發(fā)現(xiàn)，高抗種質的SOD活性在接種24 h后持續(xù)增高，與抗病性具有相關性。前人在觀察葡萄品種資源葉片與灰霉病的關系中發(fā)現(xiàn)，葡萄品種的抗病性與過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化酶的活性呈正相關[23]。