基于HPLC-FLD靶向分析古茶樹游離氨基酸積累特征

方仕茂， 張 拓， 楊 婷， 田小強(qiáng)， 田洪軍， 劉忠英， 潘 科

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，貴州 貴陽 550006； 2.沿河土家族自治縣生態(tài)茶發(fā)展和技術(shù)指導(dǎo)中心，貴州 沿河 565300)

貴州省沿河縣是中國古茶樹之鄉(xiāng)，存有豐富的喬木型和灌木型古茶樹資源[1]。根據(jù)《貴州省古茶樹保護(hù)條例》中的定義，沿河縣樹齡達(dá)100年以上的原生地天然生長和栽培型古茶樹達(dá)萬余株[2]。古茶樹是研究茶樹馴化起源以及特色茶樹種質(zhì)篩選的重要資源[3-5]。古茶樹鮮葉試制紅茶均呈現(xiàn)出醇和、鮮甜的滋味特征[6]，研究結(jié)果表明，古茶樹紅茶甜醇滋味特征與鮮葉中可溶性糖含量高度相關(guān)[7]。目前對(duì)貢獻(xiàn)鮮甜味的游離氨基酸在不同類型古茶樹鮮葉中的積累特點(diǎn)以及加工對(duì)其含量的影響尚不清楚。

茶葉中富含游離氨基酸類物質(zhì)，目前在茶葉中鑒定出20種蛋白質(zhì)游離氨基酸和6種非蛋白質(zhì)游離氨基酸(如茶氨酸、γ-氨基丁酸等)，其中茶氨酸含量占茶葉中游離氨基酸總含量的60%，其次是谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸和絲氨酸[8]。研究結(jié)果表明，茶氨酸、絲氨酸、甘氨酸和脯氨酸等游離氨基酸是貢獻(xiàn)茶湯鮮爽滋味感官特征的主要化合物[9]；另一方面，茶葉中游離氨基酸類物質(zhì)參與茶葉香氣的形成[10-11]。古茶樹由于生長年限較長，其次生代謝與長期受到人工選擇的茶樹品種不同[12-13]。盡管當(dāng)前大量研究從基因水平解析了茶樹高積累兒茶素類、茶氨酸等特征代謝物的分子機(jī)制[14-16]，但對(duì)同一區(qū)域喬木型古茶樹、灌木型古茶樹以及選育品種茶樹游離氨基酸代謝差異的研究尚未有報(bào)道。

為充分利用古茶樹資源，解析古茶樹產(chǎn)品甜醇滋味形成的物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究利用高效液相色譜結(jié)合熒光檢測器(High-performance liquid chromatography fluorescence detection, HPLC-FLD)分析不同樹型古茶樹鮮葉中18種游離氨基酸含量，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析喬木型、灌木型古茶樹與品質(zhì)對(duì)照種茶樹福鼎大白鮮葉中游離氨基酸的積累差異。另一方面，本研究分析紅茶加工工藝對(duì)不同樹型古茶樹中游離氨基酸積累的影響。本研究對(duì)古茶樹資源利用及古茶樹紅茶滋味品質(zhì)形成具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣本收集與處理

16份茶鮮葉及16份干茶樣于2020年3月采集自貴州省沿河縣，具體采樣信息參見文獻(xiàn)[7]。樣品包括喬木型鮮葉樣品7份、灌木型鮮葉樣品7份和品質(zhì)對(duì)照種福鼎大白樣品2份，每份包含3次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)取樣50 g。鮮葉樣品稱質(zhì)量后立即用錫箔紙包裹，置入液氮罐中浸沒5 min，隨后取出轉(zhuǎn)移至干冰盒內(nèi)暫存，最后保存于-80 ℃冰箱，待需要檢測分析時(shí)采用真空冷凍干燥設(shè)備將樣品進(jìn)行凍干。古茶樹紅茶加工工藝依據(jù)《貴州紅茶 工夫紅茶加工技術(shù)規(guī)程(DB 52/T 639)》進(jìn)行加工制取。冷凍干燥樣品和干茶樣品均通過恒溫研磨機(jī)研磨，過40目篩后用于游離氨基酸的檢測。

1.2 儀器與試劑

真空冷凍干燥機(jī)(ALPHR 1-4 LD plus，北京博勵(lì)行儀器有限公司產(chǎn)品)，電子分析天平[ME204E/02，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產(chǎn)品]，超純水儀( KL-UP-III-20，成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品)，高效液相色譜儀配備熒光檢測器(LC2030C Plus，日本Shimadzu公司產(chǎn)品)，乙腈和甲醇(美國Tedia公司產(chǎn)品)。

1.3 游離氨基酸的分離檢測

1.3.1 樣品制備和衍生 稱取冷凍干燥的鮮葉樣和干茶樣1.500 g于錐形瓶中，加入220 ml沸水并在沸水中浸提45 min。浸提結(jié)束，將浸提液過濾并轉(zhuǎn)移到250 ml容量瓶中，冷卻至室溫并用純水定容，搖勻。用2.5 ml無針注射器抽取定容液，過聚醚砜(PES)膜(孔直徑：0.22 μm)至1.5 ml離心管中，混勻。分別移取10 μl經(jīng)PES膜過濾的溶液、70 μl AccQ·Fluor Buffer1和20 μl AccQ Fluor 2A(AccQ-Fluor Reagent Kit，美國Waters公司產(chǎn)品)于玻璃襯管中，隨后將玻璃襯管置于渦旋器上渦旋混合15 s，渦旋混合液放置在55 ℃烘箱內(nèi)加熱10 min后取出，冷卻至室溫，用于進(jìn)樣分析。

1.3.2 HPLC-FLD定量分析游離氨基酸 基于HPLC-FLD對(duì)茶樣中18種游離氨基酸化合物進(jìn)行定量分析。色譜柱為AccQ·TagTM分析柱(60 ?，4 μm，3.9 mm×150.0 mm，1/pkg，美國Waters公司產(chǎn)品)。流動(dòng)相A為稀釋濃縮液(1∶10，體積比；AccQ.Tag洗脫液∶水)，流動(dòng)相B為純乙腈，流動(dòng)相C為超純水，梯度洗脫程序?yàn)椋?～17 min，100%～91% A，5% B，4% C；24 min，80% A，17% B，3% C；32 min，68% A，20% B，12% C；34 min，68% A，20% B，12% C；35 min，60% B，40% C; 38 min，100% A；45 min，100% A。發(fā)射波長250 nm，檢測波長395 nm。色譜柱流速為1 ml/min，柱箱溫度25 ℃，進(jìn)樣量10 μl。

1.3.3 游離氨基酸分析 將17種游離氨基酸(天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸)混合液標(biāo)準(zhǔn)品(美國Waters公司產(chǎn)品)和茶氨酸配制成不同梯度濃度樣品，采用方法1.3.1中的方法進(jìn)行衍生，制備標(biāo)準(zhǔn)品的分析樣。通過繪制摩爾質(zhì)量濃度(x軸)與同一保留時(shí)間的峰值面積(y軸)關(guān)系曲線，構(gòu)建18個(gè)游離氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得曲線方程以及相關(guān)系數(shù)，用于計(jì)算樣品中各氨基酸的含量?？傆坞x氨基酸含量為上述18種游離氨基酸含量之和。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析采用Excel、IBM SPSS Statistics，作圖采用Origin 2017 64Bit。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同樹型古茶樹鮮葉游離氨基酸積累差異

采用HPLC-FLD方法檢測氨基酸具有高特異性、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)。由圖1可知，采用Waters-AccQ方法可以實(shí)現(xiàn)茶葉中18種游離氨基酸的良好分離，茶氨酸在不同樹型古茶樹鮮葉中含量均為最高(10號(hào)峰)，含量較低的氨基酸為半胱氨酸(11號(hào)峰)。定量分析結(jié)果(表1)顯示，在喬木型、灌木型和福鼎大白品質(zhì)對(duì)照中，鮮葉中茶氨酸的含量分別為(7.56±2.93) mg/g、(10.75±3.00) mg/g和(13.14±1.28) mg/g，分別占游離氨基酸總量的45.54%、57.64%和62.01%，組間含量均值差異顯著(P<0.05)。其次，在18種游離氨基酸中絲氨酸、半胱氨酸、精氨酸和賴氨酸含量在3個(gè)類型茶鮮葉間無顯著差異。

1～18分別表示天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、茶氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸。圖1 游離氨基酸HPLC-FLD檢測色譜Fig.1 Chromatogram of free amino acid detected by HPLC-FLD

茶鮮葉中游離氨基酸含量是決定干茶茶湯鮮爽味品質(zhì)的關(guān)鍵。根據(jù)氨基酸單體化合物的感官呈味特性，可分為甜味氨基酸、苦味氨基酸和鮮味氨基酸[9]。表1顯示，喬木型古茶樹、灌木型古茶樹及福鼎大白鮮葉中3種滋味屬性的氨基酸含量存在差異。古茶樹茶鮮葉中以鮮味氨基酸為主，苦味氨基酸和甜味氨基酸次之。在3種樹型古茶樹鮮葉中，喬木型古茶樹鮮葉甜味氨基酸和鮮味氨基酸含量最低，苦味氨基酸含量最高，灌木型古茶樹鮮葉中甜味氨基酸含量最高，苦味氨基酸含量最低，而福鼎大白鮮葉則含有豐富的鮮味氨基酸。茶鮮葉中鮮味、苦味和甜味氨基酸含量的占比差異，可為鮮葉的適制性提供參考，同時(shí)為工藝參數(shù)(如干燥溫度、發(fā)酵時(shí)間)的選擇提供理論依據(jù)。

表1 不同樹型古茶樹鮮葉游離氨基酸含量

2.2 不同樹型古茶樹干茶游離氨基酸含量差異

表2顯示，干茶中游離氨基酸總量最高的是福鼎大白，其次為灌木型古茶樹干茶，最低的為喬木型古茶樹干茶。古茶樹干茶中含量較多的氨基酸分別是茶氨酸、谷氨酸、絲氨酸、組氨酸。根據(jù)滋味的呈味屬性，喬木型干茶中甜味、鮮味、苦味氨基酸含量分別占總游離氨基酸含量的16.32%、58.03%、25.66%；灌木型干茶中甜味、鮮味、苦味氨基酸含量分別占總游離氨基酸含量的16.61%、62.90%、20.07%；福鼎大白干茶中甜味、鮮味、苦味氨基酸含量分別占總游離氨基酸含量、氨基酸含量的16.22%、64.79%、18.99%。干茶中甜味、鮮味、苦味3類氨基酸含量占比差異可能是影響茶湯品質(zhì)的潛在原因，感官審評(píng)結(jié)果表明，古茶樹茶湯滋味鮮甜醇厚特征突出，福鼎大白干茶則保留了更多的甜味氨基酸、鮮味氨基酸和較少的苦味氨基酸，體現(xiàn)出甜醇滋味特征。灌木型干茶中甜味氨基酸和鮮味氨基酸含量介于喬木型和福鼎大白干茶之間。

表2 不同樹型古茶樹干茶游離氨基酸含量

2.3 加工對(duì)古茶樹紅茶游離氨基酸含量的影響

茶葉加工影響風(fēng)味物質(zhì)的代謝進(jìn)而形成其獨(dú)特風(fēng)味品質(zhì)。圖2顯示了鮮葉-干茶中總游離氨基酸和茶氨酸含量的方差分析結(jié)果。在相同加工工藝條件下，總游離氨基酸含量在鮮葉樣中存在一定組間差異，然而總游離氨基酸含量在干茶樣品組間差異則不明顯(P>0.05)。鮮葉中的絲氨酸、半胱氨酸、精氨酸和賴氨酸含量均值無顯著差異(P>0.05)，干茶中絲氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、賴氨酸和谷氨酸含量均值無顯著差異(P>0.05)(表2)，表明通過紅茶加工處理促進(jìn)了喬木型和灌木型古茶樹鮮葉中各氨基酸含量向無差異趨勢變化，從而使風(fēng)味品質(zhì)呈現(xiàn)相似性。其次，根據(jù)氨基酸滋味屬性分類結(jié)果，加工處理后甜味氨基酸和苦味氨基酸含量在3種類型古茶樹干茶中無顯著差異。表明加工可改變游離氨基酸含量，從而使得干茶滋味表現(xiàn)出一定穩(wěn)定性。

圖2 鮮葉和干茶中茶氨酸和總游離氨基酸含量Fig.2 Theanine and total free amino acid contents in fresh and dry tea leaves

干茶加工過程中茶鮮葉中游離氨基酸含量逐漸減少，但對(duì)不同滋味屬性的氨基酸影響存在差異。由圖2可知，喬木型和灌木型古茶樹鮮葉經(jīng)加工處理均使鮮味氨基酸(茶氨酸)含量減少，其中對(duì)灌木型古茶樹中的茶氨酸含量具有顯著影響。加工對(duì)甜味氨基酸和苦味氨基酸含量的影響則無規(guī)律。對(duì)比鮮葉與干茶不同滋味屬性氨基酸含量差異可知，對(duì)于甜味氨基酸來說，加工未顯著改變半胱氨酸、甘氨酸含量，但使得絲氨酸、脯氨酸含量極顯著增加；對(duì)苦味氨基酸來說，干茶樣品中異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸和賴氨酸含量極顯著增加，但對(duì)精氨酸含量的影響則不顯著。

為明確喬木型、灌木型和福鼎大白在加工前后，即鮮葉和干茶中游離氨基酸含量的變化差異，以22個(gè)氨基酸的含量作為變量和鮮葉樣品氨基酸含量、干茶樣品氨基酸含量構(gòu)建主成分分析(Principal component analysis, PCA)模型。圖3A為3種類型鮮葉的主成分得分圖，主成分1(PC1)和主成分2(PC2)的解釋方差分別是39.852%和23.954%。16份樣品(圖中包括每一樣品的3次技術(shù)重復(fù)數(shù)據(jù))在該二維坐標(biāo)中得到了較好的聚類，且存在明顯的分離界限。圖3B為前2個(gè)主成分的載荷得分結(jié)果，解釋了圖3A中喬木型、灌木型和福鼎大白鮮葉樣品的聚類原因，即由于3類鮮葉樣品貢獻(xiàn)前2個(gè)主成分的氨基酸含量差異，進(jìn)一步分析旋轉(zhuǎn)后的分矩陣可知，PC1的解釋方差主要是由纈氨酸、異亮氨酸、甜味氨基酸總量、亮氨酸、脯氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸和酪氨酸貢獻(xiàn)，PC2解釋方差則由組氨酸、谷氨酸、苦味氨基酸總量、丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸和蘇氨酸貢獻(xiàn)。圖3C顯示，由于干茶樣品經(jīng)過加工后，樣品內(nèi)游離氨基酸變化趨于一致，導(dǎo)致樣品在PC1和PC2的二維空間重疊，無明顯的聚類分離輪廓。其次，灌木型和喬木型古茶樹干茶樣品相較于福鼎大白干茶樣品體現(xiàn)出較為分散的特征。干茶樣品主成分分析結(jié)果表明，通過圖3D中前2個(gè)主成分載荷得分，難以實(shí)現(xiàn)樣品的聚類(圖3C)，即樣品在22個(gè)變量中的整體差異不明顯。

Asp：天冬氨酸；Ser：絲氨酸；Glu、Gly、His、Arg、Thr、Ala、Pro、The、Cys、Tyr、Val、Met、Lys、Ile、Leu、Phe、SweetAA、BitterAA、UmamiAA和TotalAA分別是谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、茶氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甜味氨基酸、苦味氨基酸、鮮味氨基酸和總游離氨基酸。圖3 鮮葉樣品氨基酸含量主成分得分(A)和載荷得分(B)、干茶樣品主成分得分(C)和載荷得分(D)Fig.3 Principal component score plot (A) and loading score plot (B) for amino acid contents in fresh leaves, principal component score plot (C) and loadings score plot for amino acid contents in dry tea

3 討論與結(jié)論

古茶樹生境和園藝措施是影響其茶鮮葉游離氨基酸積累的潛在因素。茶鮮葉中氨基酸、兒茶素等特征代謝物積累受到茶樹施肥、采摘和修剪等園藝措施影響[17-18]，本研究發(fā)現(xiàn)喬木型古茶樹主要以單株形式生長且經(jīng)歷園藝措施影響最小，主要受采摘影響，修剪和施肥等管理措施較少，而灌木型古茶樹和福鼎大白茶樹受到人工管理影響較為頻繁，因此推測園藝措施影響是導(dǎo)致古茶樹鮮葉游離氨基酸積累差異的主要原因。其次，不同古茶樹類群生化成分含量的變異系數(shù)較大[19-21]，喬木型古茶樹由于單株生長環(huán)境等差異，各單株茶鮮葉游離氨基酸含量存在較大的差異[22]。本研究的主成分分析結(jié)果亦表明，3種類型的茶鮮葉呈現(xiàn)較好的聚類分離特征，進(jìn)一步說明生境和園藝措施差異影響了古茶樹游離氨基酸的積累。

加工可以改善茶鮮葉品質(zhì)差異從而塑造干茶相似品質(zhì)。萎凋、揉捻和發(fā)酵過程中茶鮮葉受到水分、機(jī)械損傷等脅迫，促進(jìn)蛋白質(zhì)水解，有利于氨基酸含量增加。干燥過程，由于受到溫度作用，游離氨基酸發(fā)生降解，其含量逐漸減少，使得茶湯鮮甜滋味減弱，影響茶湯品質(zhì)。已有研究結(jié)果表明，茶氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸等氨基酸參與香氣的形成且呈現(xiàn)烘烤味和花香[9]，與福鼎大白干茶相比，古茶樹干茶表現(xiàn)出的木香感官特征是值得關(guān)注的，已有研究結(jié)果表明，存放陳化可能是形成紅茶木香的潛在因素[23]，而是否有游離氨基酸參與形成木香尚不清楚。另一方面，古茶樹干茶滋味整體呈甜醇味。已有研究結(jié)果表明，鮮葉經(jīng)加工后多糖(蔗糖)水解為單糖(如葡萄糖、果糖)是貢獻(xiàn)紅茶茶湯甜味的潛在因素[7]。其次，灌木型古茶樹鮮葉經(jīng)過加工，總兒茶素含量減少，顯著減少苦澀味物質(zhì)的積累[8]。甜味氨基酸和鮮味氨基酸具有協(xié)同增強(qiáng)茶湯鮮甜、拮抗苦澀味的作用[24-25]，本研究對(duì)象福鼎大白干茶中鮮味氨基酸含量占比高于灌木型和喬木型古茶樹干茶，結(jié)合感官審評(píng)結(jié)果可推測游離氨基酸亦是貢獻(xiàn)茶湯甜醇滋味的重要物質(zhì)。由于茶湯滋味是茶葉中浸出物質(zhì)共同作用的結(jié)果，目前基本明確各主要物質(zhì)的滋味屬性[26-27]，但對(duì)于貢獻(xiàn)茶湯甜醇滋味的關(guān)鍵化合物仍需要進(jìn)一步的分子感官試驗(yàn)確定。

綜上，采用HPLC-FLD方法能實(shí)現(xiàn)茶鮮葉和干茶中18種游離氨基酸的靶向檢測?；谥鞒煞址治龅然瘜W(xué)計(jì)量學(xué)方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的聚類，不同類型茶鮮葉游離氨基酸含量存在一定差異，通過加工工藝處理可弱化這一含量差異，從而塑造相似的干茶品質(zhì)。本研究結(jié)果增進(jìn)了對(duì)不同樹型古茶樹鮮葉游離氨基酸積累差異的認(rèn)識(shí)，為不同樹型古茶樹紅茶品質(zhì)形成提供一定理論依據(jù)。