桃Ⅱ型NADH脫氫酶家族基因鑒定和表達(dá)分析

張春華, 沈志軍， 馬瑞娟， 張圓圓， 郭紹雷， 蔡志翔， 俞明亮

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014)

Ⅱ型NADH脫氫酶(Type ⅡNADHdehydrogenase，EC 1.6.99.3)廣泛存在于真細(xì)菌、古細(xì)菌、酵母、真菌和植物線粒體中[1-3]，基因組測(cè)序的100%植物種類中均有Ⅱ型NADH脫氫酶[4]。Ⅱ型NADH脫氫酶家族蛋白質(zhì)的典型特點(diǎn)是存在一個(gè)保守的C端結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在介導(dǎo)蛋白質(zhì)的二聚化、膜錨定以及底物的識(shí)別中發(fā)揮著重要作用[5]。Ⅱ型NADH脫氫酶不傳遞質(zhì)子，位于線粒體內(nèi)膜表面(內(nèi)側(cè)或者外側(cè))，也有位于質(zhì)體和葉綠體的報(bào)道。Ⅱ型NADH脫氫酶相對(duì)分子質(zhì)量低，一般由單個(gè)多肽鏈組成，驅(qū)動(dòng)電子從NADH轉(zhuǎn)移到泛醌[6]。與多聚體復(fù)合物I相反，Ⅱ型NADH脫氫酶對(duì)魚藤酮不敏感，通常含有1個(gè)FAD非共價(jià)結(jié)合分子作為氧化還原修復(fù)基團(tuán)[2,7]。

植物能通過Ⅱ型NADH脫氫酶氧化外源NADH和NADPH[8-9]。Ⅱ型NADH脫氫酶介導(dǎo)的NADH氧化可以驅(qū)動(dòng)更快的新陳代謝的產(chǎn)能過程，以及加快碳元素流入生物合成路徑，因而可以更高效地合成ATP[5]。每種植物至少含有4種對(duì)魚藤酮不敏感的Ⅱ型NADH脫氫酶[9]。多種植物基因組測(cè)序的完成為研究Ⅱ型NADH脫氫酶家族基因提供了便利。根據(jù)報(bào)道，來自部分植物的Ⅱ型NADH脫氫酶基因已經(jīng)被鑒定，擬南芥(Arabidopsisthaliana，At)7個(gè)[9]、水稻(Oryzasativa,Os)6個(gè)、黃豆(Soybean)2個(gè)[10]、土豆(Solanumtuberosum,St)2個(gè)[11]、玉米(Zeamays，Zm)2個(gè)[9,12]、甜菜(Betavulgaris，Bv)2個(gè)[12-14]等。另外，來自萊氏衣藻(Chlamydomonasreinhardtii,Cr)7個(gè)Ⅱ型NADH脫氫酶已被初步鑒定。

不斷增加的證據(jù)顯示Ⅱ型NADH脫氫酶家族基因在氧化、光呼吸、生物和非生物逆境及其他代謝途徑中起重要作用[10,15]。土豆葉片的Ⅱ型NADH脫氫酶蛋白質(zhì)NDA1依賴光，且對(duì)低溫敏感，5 ℃冷害處理6 d后，蛋白質(zhì)表達(dá)量下降為原來的10%；在早上蛋白質(zhì)表達(dá)量出現(xiàn)峰值，并可能與晝夜節(jié)律和光合作用有關(guān)[16-17]；輸入的蛋白質(zhì)Ⅱ型NADH脫氫酶在洋地黃素滲透時(shí)與膜相關(guān)。擬南芥葉片的Ⅱ型NADH脫氫酶基因AtNDA1受光控制，AtNDA2不依賴光，AtNDA2在檢測(cè)的擬南芥所有組織中均有表達(dá)，AtNDA1特異性地在擬南芥地上所有組織中表達(dá)，在根中幾乎無表達(dá)；AtNDB1和AtNDB2在擬南芥所有組織中均有表達(dá)，AtNDB3和AtNDB4在擬南芥葉片中不表達(dá)，AtNDB4在莖中也不表達(dá)；AtNDC1在擬南芥所有檢測(cè)組織中均有高表達(dá)，表明可能與異養(yǎng)代謝、呼吸等活動(dòng)相關(guān)。在萊氏衣藻中，NDA1在復(fù)合物I缺乏的情況下，起到氧化基質(zhì)的作用[18]。Ⅱ型NADH脫氫酶是一類冗余蛋白質(zhì)，但是擁有良好的可塑性，可以根據(jù)環(huán)境的不同起到不同的作用，賦予了生物體更好的適應(yīng)環(huán)境的能力[5]。

桃(Prunuspersica)是薔薇科(Rosaceae)李屬(Prunus)植物，果實(shí)柔軟多汁、營養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者喜愛，是世界廣泛栽培的果樹。中國是世界桃生產(chǎn)大國，據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)庫(FAOSTAT)最新統(tǒng)計(jì)，2019年中國桃種植面積(84 0919 hm2)和總產(chǎn)量(15 841 928 t)，均穩(wěn)居世界第一，分別占世界桃種植總面積(1 527 052 hm2)的55.07%和總產(chǎn)量(25 737 841 t)的61.55% ；中國桃種植面積排在李、黑刺李、蘋果、梨和柿子之后，超過葡萄；總產(chǎn)量僅次于蘋果、梨，也已超過葡萄(http://www.fao.org/about/en)。桃是二倍體(2n=2x=16)，具有相對(duì)小的基因組(約265 Mb)，特別是桃Lovell、Chinese Cling全基因組測(cè)序獲得26 335～27 852個(gè)注釋基因[19-20]，為研究桃每個(gè)家族基因的特點(diǎn)和功能提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

目前，尚未有桃Ⅱ型NADH脫氫酶家族成員的系統(tǒng)鑒定和分析報(bào)道。鑒于此，本研究鑒定了桃Ⅱ型NADH脫氫酶家族成員，并分析了進(jìn)化特征、基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、組織表達(dá)等特性。研究結(jié)果將為進(jìn)一步驗(yàn)證桃Ⅱ型NADH脫氫酶家族基因在桃生長發(fā)育中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 桃Ⅱ型NADH脫氫酶家族成員的鑒定

根據(jù)擬南芥7個(gè)Ⅱ型NADH脫氫酶基因及其編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列，利用BLAST工具檢索薔薇科基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.rosaceae.org/node/355)桃參考基因組蛋白質(zhì)氨基酸序列，將這些候選序列逐一提交到NCBI的在線工具 CD Search(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域(NADHdehydrogenase-like)搜索，預(yù)測(cè)這些蛋白質(zhì)有無Ⅱ型NADH脫氫酶結(jié)構(gòu)域。存在NADHdehydrogenase-like保守區(qū)域的蛋白質(zhì)就被認(rèn)為是Ⅱ型NADH脫氫酶蛋白質(zhì)。

1.2 桃Ⅱ型NADH脫氫酶家族基因克隆

使用植物總RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品)分別提取桃野雞紅葉芽、老葉、幼葉、一年生枝條的枝表皮、根、幼果肉、熟果肉、熟果皮組織的總RNA，使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳和微量紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的純度和濃度，分別以1 μg各組織的總RNA為模板，使用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand反轉(zhuǎn)錄試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品]合成cDNA第一條鏈，并稀釋10倍。

根據(jù)桃每個(gè)Ⅱ型NADH脫氫酶基因的參考基因組CDS序列設(shè)計(jì)引物(表1)，以桃葉片cDNA 為模板，PCR擴(kuò)增每個(gè)桃Ⅱ型NADH脫氫酶基因的開放閱讀框(Open reading frame，ORF)全長序列。PCR反應(yīng)體系50.0 μl：21.0 μl ddH2O，25.0 μl DNA聚合酶混合物，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μl，cDNA 2.0 μl。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳和膠回收后，回收片段與pEASY-T3載體(北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)連接并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，選取菌液PCR鑒定為陽性的克隆，由通用生物系統(tǒng)有限公司測(cè)序。

表1 桃Ⅱ型NADH脫氫酶基因克隆所用引物

1.3 桃與其他物種Ⅱ型NADH脫氫酶蛋白質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

利用軟件MEGA 4.1內(nèi)置的Clustal W程序?qū)?個(gè)桃Ⅱ型NADH脫氫酶與擬南芥7個(gè)、水稻8個(gè)、玉米1個(gè)、土豆2個(gè)、萊氏衣藻6個(gè)Ⅱ型NADH脫氫酶蛋白質(zhì)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析。7個(gè)擬南芥Ⅱ型NADH脫氫酶蛋白質(zhì)氨基酸序列AT1G07180.1、AT2G29990、AT4G28220、AT4G05020、AT4G21490、AT2G20800、AT5G08740下載自http://www.arabidopsis.org/；8個(gè)水稻Ⅱ型NADH脫氫酶蛋白質(zhì)氨基酸序列Os07t0564500-01、Os01t0830100-02、Os01t0830100-01、Os05t0331200-01、Os06t0684000-02、Os06t0684000-01、Os08t0141400-01、Os06t0214900-01下載自https://rapdb.dna.affrc.go.jp；1個(gè)玉米Ⅱ型NADH脫氫酶蛋白質(zhì)氨基酸序列Zm00001eb151430下載自https://plants.ensembl.org/index.html；2個(gè)土豆Ⅱ型NADH脫氫酶蛋白質(zhì)氨基酸序列PGSC0003DMG400021670、PGSC0003DMG400004168下載自https://phytozome-next.jgi.doe.gov；6個(gè)萊氏衣藻Ⅱ型NADH脫氫酶蛋白質(zhì)氨基酸序列XP_001698901.1、XP_001702271.1、XP_001703055.1、XP_001703643.1、XP_001691969.1、XP_001703056.1下載自https://www.ncbi.nlm.nih.gov/。

根據(jù)多序列聯(lián)配的結(jié)果，使用MEGA 4.1軟件以相鄰連接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并對(duì)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行自舉評(píng)估，隨機(jī)抽樣重復(fù)次數(shù)設(shè)為1 000，其他參數(shù)使用系統(tǒng)默認(rèn)值。并根據(jù)擬南芥和水稻Ⅱ型NADH脫氫酶家族的亞家族分類情況進(jìn)行了桃Ⅱ型NADH脫氫酶家族的亞家族分類。

1.4 桃Ⅱ型NADH脫氫酶基因結(jié)構(gòu)、啟動(dòng)子及保守結(jié)構(gòu)域分析

每個(gè)基因序列及所在染色體位置下載自薔薇科基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.rosaceae.org/node/355)。運(yùn)用在線網(wǎng)站GSDS(http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/)分析Ⅱ型NADH脫氫酶基因結(jié)構(gòu)，包括外顯子、內(nèi)含子、3′UTR和5′UTR。在GDR數(shù)據(jù)庫下載每個(gè)基因起始密碼子前的1～2 000 bp，將序列輸入Promoter 2.0服務(wù)器在線預(yù)測(cè)Ⅱ型NADH脫氫酶基因啟動(dòng)子。

使用在線工具M(jìn)ultiple EM for Motif Elicitati(MEME, version 4.8.1, http//meme-suite.org/tools/meme)分析每個(gè)成員編碼蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域，并下載LOGO圖。參數(shù)設(shè)置為：保守區(qū)域(Motif)數(shù)量最多5個(gè)，保守區(qū)域?qū)挾?～100。

1.5 桃Ⅱ型NADH脫氫酶蛋白質(zhì)的一級(jí)、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用ExPaSy的Protparam軟件(http://expasy.org/tools/protparam.html)預(yù)測(cè)Ⅱ型NADH脫氫酶蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)及特性，包括氨基酸數(shù)目、相對(duì)分子質(zhì)量大小、分子式、總原子數(shù)量、穩(wěn)定性指數(shù)、理論等電點(diǎn)、蛋白質(zhì)親疏水性等。利用在線工具TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)每個(gè)蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域。信號(hào)肽預(yù)測(cè)網(wǎng)站采用https://novopro.cn/tools/signalp.html 和http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/。

利用在線工具SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測(cè)桃Ⅱ型NADH脫氫酶蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲等在整體結(jié)構(gòu)中所占的比例，窗口寬度設(shè)置為17，相似性閾值設(shè)置為8。

1.6 桃Ⅱ型NADH脫氫酶基因的表達(dá)分析

以各組織cDNA為模板，采用Primer Premier 5.0軟件(Premier Biosoft)，為每個(gè)基因設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物(表2)，使擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)在6個(gè)基因間的非保守序列，采用SYBR? Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品]進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序等參考Zhang等[21]的方法。 使用SPSS20.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，所有數(shù)據(jù)以鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行檢驗(yàn)。

表2 桃Ⅱ型NADH脫氫酶基因熒光定量PCR所用引物

2 結(jié)果與分析

2.1 桃Ⅱ型NADH脫氫酶家族成員鑒定

根據(jù)擬南芥Ⅱ型NADH脫氫酶基因編碼的蛋白質(zhì)檢索出6個(gè)桃候選Ⅱ型NADH脫氫酶(表3)，用Conserved Domain Search軟件對(duì)其保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，桃有6種Ⅱ型NADH脫氫酶蛋白質(zhì)。其中，Prupe.6G055600.1、Prupe.4G039000.1、Prupe.3G231400.1只含有1個(gè)NADHdehydrogenase-like結(jié)構(gòu)域；Prupe.3G231300.1和Prupe.4G037100.1除了含有NADHdehydrogenase-like結(jié)構(gòu)域外，還含有EF-hand保守結(jié)構(gòu)域,Prupe.3G231300.1氨基酸序列的426～499 aa含有2個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)域，Prupe.4G037100.1只含有1個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)域，位于390～464 aa；Prupe.5G076700.1氨基酸序列含有1個(gè)小的NADH結(jié)合結(jié)構(gòu)域，這個(gè)小的NADH結(jié)合位點(diǎn)被包含在一個(gè)更大的、被稱作氧化還原輔基的FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域里。

2.2 桃Ⅱ型NADH脫氫酶家族基因克隆

從野雞紅葉片中分離出5個(gè)基因，根據(jù)測(cè)序結(jié)果和參考基因組序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)5個(gè)Ⅱ型NADH脫氫酶基因與桃參考基因組Lovell品種中5個(gè)相應(yīng)基因的ORF分別完全一致，Prupe.6G055600.1、Prupe.4G039000.1、Prupe.3G231400.1、Prupe.4G037100.1、Prupe.5G076700.1ORF全長分別是1 506 bp、1 653 bp、1 746 bp、1 764 bp、1 620 bp，分別編碼501個(gè)、550個(gè)、581個(gè)、587個(gè)、539個(gè)氨基酸；這些基因分別位于3～6號(hào)染色體上(表3)。在多個(gè)組織的cDNA文庫中，多次設(shè)置不同溫度梯度和模板濃度，Prupe.3G231300.1都沒有被擴(kuò)增出來(圖1)。

a:Prupe.6G055600.1;b:Prupe.3G231400.1;c:Prupe.3G231300.1;d:Prupe.3G231400.1;e:Marker;f:Prupe.4G037100.1;g:Prupe.3G231300.1;h:Prupe.5G076700.1;i:Prupe.4G039000.1;j:RPII。圖1 桃6個(gè)Ⅱ型NADH脫氫酶家族基因克隆Fig.1 Cloning of type Ⅱ NADH dehydrogenase family genes in peach

表3 桃Ⅱ型NADH脫氫酶家族基因信息

2.3 桃與其他物種Ⅱ型NADH脫氫酶蛋白質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

為評(píng)估桃和其他物種Ⅱ型NADH脫氫酶蛋白質(zhì)的進(jìn)化關(guān)系，對(duì)桃和其他5個(gè)物種Ⅱ型NADH脫氫酶家族蛋白質(zhì)氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建(圖2)。根據(jù)不同物種間Ⅱ型NADH脫氫酶家族蛋白質(zhì)氨基酸序列的相似性和進(jìn)化關(guān)系的遠(yuǎn)近，特別是根據(jù)擬南芥Ⅱ型NADH脫氫酶亞家族蛋白質(zhì)分類，將桃Ⅱ型NADH脫氫酶蛋白質(zhì)分成3個(gè)亞家族：NDA、NDB、NDC，分別包含2個(gè)、3個(gè)、1個(gè)成員。

圖2 桃與其他物種Ⅱ型NADH脫氫酶家族成員系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of type Ⅱ NADH dehydrogenase family members in peach and other species

NDA亞家族中的Prupe.6G055600.1與At1g07180(AtNDA1)和At2g29990(AtNDA2)親緣關(guān)系均較近，同時(shí)Prupe.6G055600.1與土豆StPGSC0003DMG400004168(StNDA1，NCBI序列號(hào)：CAB52796.1)進(jìn)化關(guān)系也很近，因此，將Prupe.6G055600.1 命名為PpNDA1。Prupe.4G039000.1 命名為PpNDA2。

桃Prupe.3G231400.1與擬南芥At4g28220(AtNDB1)和土豆StPGSC0003DMG400021670(StNDB1)緊密聚在一起，親緣關(guān)系最近，因此，將Prupe.3G231400.1命名為PpNDB1。桃Prupe.3G231300.1與擬南芥At2g20800(AtNDB4)聚在一起，將Prupe.3G231300.1命名為PpNDB4； Prupe.4G037100.1與擬南芥At4g21490(AtNDB3)親緣關(guān)系更近，將Prupe.4G037100.1命名為PpNDB3 (表3)。

桃NDC亞家族中僅含有Prupe.5G076700.1一個(gè)成員，其與擬南芥At5g08740(AtNDC1)親緣關(guān)系最近，在同一分支內(nèi)，因此，Prupe.5G076700.1被命名為PpNDC1(表3)。

桃Ⅱ型NADH脫氫酶家族成員比擬南芥Ⅱ型NADH脫氫酶家族成員少了1個(gè)，桃沒有與擬南芥AtNDB2相對(duì)應(yīng)的同源基因。

2.4 桃Ⅱ型NADH脫氫酶基因結(jié)構(gòu)、啟動(dòng)子及保守結(jié)構(gòu)域分析

桃Ⅱ型NADH脫氫酶基因結(jié)構(gòu)(圖3)顯示，NDA亞家族的2個(gè)基因均含有8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子，而且2個(gè)基因之間外顯子長度和外顯子排列順序幾乎完全相同，但是內(nèi)含子長度、3′UTR長度和5′UTR長度有很大不同。NDB亞家族的Prupe.3G231400.1(PpNDB1)和Prupe.4G037100.1(PpNDB3)基因均分別含有10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子，Prupe.3G231300.1(PpNDB4)含有11個(gè)外顯子10個(gè)內(nèi)含子，且無上下游3′UTR和5′UTR結(jié)構(gòu)?；蜷g相比，同一編號(hào)的外顯子長度幾乎相等。Prupe.5G076700.1(PpNDC1)的基因結(jié)構(gòu)與其他亞家族基因不同，沒有內(nèi)含子，由3′UTR、5′UTR和1個(gè)長外顯子構(gòu)成。

圖3 桃Ⅱ型NADH脫氫酶家族基因結(jié)構(gòu)Fig.3 Gene structure of type Ⅱ NADH dehydrogenase family in peach

桃Ⅱ型NADH脫氫酶家族6個(gè)基因的啟動(dòng)子分別位于基因起始密碼子前2 000 bp范圍的496～546 bp、1 330～1 380 bp、1 771～1 821 bp、1 153～1 203 bp、1 612～1 662 bp、1 678～1 728 bp 處(表4)。

表4 桃Ⅱ型NADH脫氫酶基因啟動(dòng)子分析

保守區(qū)域分析結(jié)果(圖4和圖5)顯示，每個(gè)PpNDA和PpNDB亞家族成員均含有4個(gè)相同的保守結(jié)構(gòu)域: motif 1、motif 2、motif 3、motif 5，這4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域在每個(gè)成員的氨基酸序列中出現(xiàn)的先后順序也相同。PpNDB亞家族的3個(gè)成員除了含有上述4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域外，還含有1個(gè)PpNDB亞家族成員特有的保守結(jié)構(gòu)域motif 4。PpNDC亞家族成員只含有保守結(jié)構(gòu)域motif 2和motif 3。

理學(xué)作為現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的基礎(chǔ)學(xué)科在社會(huì)生產(chǎn)生活中有著重要的地位和作用，可“物理是高中最難學(xué)的一門課”也已經(jīng)成為多年來師生們的共識(shí)，相當(dāng)一部分學(xué)生因?yàn)閷W(xué)不好物理而放棄物理，進(jìn)而放棄理科選擇文科。但對(duì)幾屆學(xué)生的調(diào)查得知，這些反映高中物理不好學(xué)的同學(xué)當(dāng)中有相當(dāng)一部分在初中其實(shí)很喜歡物理，并且成績也不錯(cuò)。

圖4 桃Ⅱ型NADH脫氫酶家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域標(biāo)志Fig.4 Conserved domain markers of type Ⅱ NADH dehydrogenase family proteins in peach

藍(lán)色：motif 1；紅色：motif 2 ；桔黃：motif 3；紫色：motif 4；綠色：motif 5 圖5 桃Ⅱ型NADH脫氫酶家族蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域Fig.5 Conserved domain of type Ⅱ NADH dehydrogenase family proteins in peach

2.5 桃Ⅱ型NADH脫氫酶蛋白質(zhì)一級(jí)、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

桃Ⅱ型NADH脫氫酶蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果(表5)表明，桃Ⅱ型NADH脫氫酶蛋白質(zhì)氨基酸數(shù)目介于501～621 aa，相對(duì)分子質(zhì)量介于55 340～70 070；而且發(fā)現(xiàn) NDC亞家族和PpNDA亞家族成員的氨基酸數(shù)目和相對(duì)分子質(zhì)量小于PpNDB亞家族成員。

Prupe.3G231400.1(PpNDB1)和Prupe.5G076700.1 (PpNDC1)理論等電點(diǎn)值均小于7，說明是酸性蛋白質(zhì)；其余4個(gè)蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn)均大于7，是堿性蛋白質(zhì)。6個(gè)蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定指數(shù)介于31.58～39.18，均屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì)。6個(gè)桃Ⅱ型NADH脫氫酶蛋白質(zhì)親水性指數(shù)平均值介于-0.135～-0.308，均是親水性蛋白質(zhì)(表5)。

表5 桃Ⅱ型NADH脫氫酶家族蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)分析

亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果(表5)顯示，6個(gè)桃Ⅱ型NADH脫氫酶蛋白質(zhì)大概率位于線粒體或葉綠體；跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果表明，6個(gè)蛋白質(zhì)均無跨膜結(jié)構(gòu)域；6個(gè)蛋白質(zhì)Prupe.6G055600.1、Prupe.4G039000.1、Prupe.3G231400.1、Prupe.4G037100.1、Prupe.3G231300.1、Prupe.5G076700.1有信號(hào)肽的概率分別是 0.748%、0.125%、31.022%、4.592%、0.046%、0.114%。

利用SOPMA程序?qū)?個(gè)桃Ⅱ型NADH脫氫酶家族蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果(表6、圖6)顯示，PpNDB亞族成員蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)全部以α-螺旋為主要構(gòu)成元件，其次是無規(guī)則卷曲，β-轉(zhuǎn)角所占比例最低。而PpNDA和PpNDC亞族成員蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中占比最高的是無規(guī)則卷曲，其次是α-螺旋，β-轉(zhuǎn)角所占比例最低。

表6 桃Ⅱ型NADH脫氫酶家族蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

藍(lán)色：α-螺旋；紅色：β-折疊；綠色：β-轉(zhuǎn)角；紫色：無規(guī)則卷曲。圖6 桃Ⅱ型NADH脫氫酶家族蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.6 Secondary structure of type Ⅱ NADH dehydrogenase family proteins in peach

2.6 桃Ⅱ型NADH脫氫酶基因表達(dá)水平分析

以RPII為看家基因，以葉芽表達(dá)量為1，其他7個(gè)組織相對(duì)于葉芽組織表達(dá)量的相對(duì)水平進(jìn)行計(jì)算，桃Ⅱ型NADH脫氫酶家族基因在8個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)水平分析結(jié)果(圖7)表明，Prupe.6G055600.1(PpNDA1)在熟果肉中表達(dá)量顯著高于老葉、枝表皮和其他組織；Prupe.4G039000.1(PpNDA2) 在根中表達(dá)量最高，其次是老葉，再次是葉芽，在果肉中表達(dá)量最低；Prupe.3G231400.1(PpNDB1)在老葉和幼果肉中表達(dá)量最高，其次是根，再次是葉芽和幼葉，在熟果肉中幾乎無表達(dá)；Prupe.4G037100.1(PpNDB3)在老葉和根中表達(dá)量顯著高于其他組織，在熟果肉中幾乎不表達(dá)，在枝表皮、幼果肉、熟果皮表達(dá)量相近。Prupe.3G231300.1(PpNDB4)在枝表皮和熟果肉中檢測(cè)不到表達(dá)，在幼葉和根中表達(dá)量顯著高于其他組織，在熟果皮、幼果肉、葉芽中表達(dá)量相近，沒有顯著差異；Prupe.5G076700.1(PpNDC1)在老葉中表達(dá)量最高，其次是葉芽、幼果肉、枝表皮，再次是幼葉和根，在熟果肉中幾乎檢測(cè)不到表達(dá)。

圖7 桃Ⅱ型NADH脫氫酶家族基因相對(duì)表達(dá)水平Fig.7 Relative expression level of type type Ⅱ NADH dehydrogenase family genes in peach

3 討 論

3.1 桃Ⅱ型NADH脫氫酶家族成員鑒定

本研究鑒定出桃有6個(gè)桃Ⅱ型NADH脫氫酶成員，比擬南芥少了一個(gè)AtNDB2成員，這表明擬南芥與桃Ⅱ型NADH脫氫酶家族成員數(shù)目方面稍有差異，也有很高的保守性；這種物種間的保守性和差異性在其他植物中也被發(fā)現(xiàn)，水稻有8個(gè)Ⅱ型NADH脫氫酶成員。這在一定程度上驗(yàn)證了以往報(bào)道：每種植物線粒體一定程度上至少含有4個(gè)不同的Ⅱ型NADH脫氫酶[9]。綜合這些研究結(jié)果，也說明植物Ⅱ型NADH脫氫酶家族成員數(shù)目較少，是較小的家族。

桃Ⅱ型NADH脫氫酶家族被分成3個(gè)亞家族，其他植物Ⅱ型NADH脫氫酶家族也是被分為3個(gè)亞家族[22]，這體現(xiàn)了同一家族基因在不同物種間的保守性。特別是PpNDC亞家族，有且只有1個(gè)成員PpNDC1，在擬南芥、水稻、白腐菌及本研究中都得到了證實(shí)[22]。

3.2 桃Ⅱ型NADH脫氫酶家族基因克隆

從野雞紅的8種組織cDNA池中均無法擴(kuò)增出PpNDB4(Prupe.3G231300.1)條帶，經(jīng)過在NCBI中查找該基因的基因組序列，發(fā)現(xiàn)與GDR中下載的基因組序列不同，有待進(jìn)一步研究；但是根據(jù)參考基因組Lovell品種中Prupe.3G231300.1的CDS序列設(shè)計(jì)的qRT-PCR引物能擴(kuò)增出127 bp目的片段，其表達(dá)水平在一些組織中也能被檢測(cè)到。這與以往擬南芥中發(fā)現(xiàn)的類似：AtNDB3無法克隆，并被認(rèn)為是一個(gè)假基因[23]。在萌發(fā)過程中的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明，AtNDB3在萌發(fā)早期表達(dá)[24]。假基因是基因家族在進(jìn)化過程中形成的，往往存在于真核生物的多基因家族中。例如，大多數(shù)光合作用的基因已經(jīng)丟失或消失,只保留為假基因[25]。由于假基因在選擇壓力降低的條件下進(jìn)化，可以推測(cè)出它們的種間變異性增加，因此，這些假基因可能是分類學(xué)研究中有用的分子工具[25]。這是首次報(bào)道在桃中發(fā)現(xiàn)假基因，Prupe.3G231300.1的利用有待進(jìn)一步深入探索。

3.3 桃Ⅱ型NADH脫氫酶家族基因結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)特性

基因結(jié)構(gòu)方面，桃PpNDA亞家族2個(gè)基因的外顯子數(shù)量相同，各8個(gè)，這與擬南芥AtNDA亞家族2個(gè)基因的外顯子數(shù)量相等[9]。說明2個(gè)物種間NDA亞家族基因在外顯子數(shù)量上是保守的。比較桃NDA亞家族的2個(gè)基因，發(fā)現(xiàn)外顯子長度和外顯子排列順序、內(nèi)含子排列順序幾乎完全相同，但內(nèi)含子長度、上下游長度有很大不同。比較擬南芥NDA亞家族的2個(gè)基因，所有內(nèi)含子的位置、大多數(shù)內(nèi)含子長度都是保守的[9]，這說明桃和擬南芥2個(gè)物種的NDA亞家族成員基因結(jié)構(gòu)高度保守，除了2個(gè)物種間內(nèi)含子長度略有不同。桃NDB亞家族3個(gè)基因的外顯子位置、長度、數(shù)目、順序高度保守，內(nèi)含子長度有差異；比較擬南芥NDB亞家族4個(gè)基因，大多數(shù)內(nèi)含子位置保守，和NDB1及NDB2相比，NDB4丟失了幾個(gè)內(nèi)含子，這些體現(xiàn)了2個(gè)物種間雖然略有差異，但是具有高度保守性。這些基因結(jié)構(gòu)上的保守性也為進(jìn)化分析結(jié)果提供了支持。NDC亞家族唯一成員擬南芥NDC1有9個(gè)內(nèi)含子，而桃NDC亞家族唯一成員NDC1(Prupe.5G076700.1)沒有內(nèi)含子，這可能是自然選擇的結(jié)果，這種選擇是由最小化轉(zhuǎn)錄成本所產(chǎn)生的優(yōu)勢(shì)驅(qū)動(dòng)的，因?yàn)閮?nèi)含子較短，可以減少轉(zhuǎn)錄和剪接等過程的能量消耗，從而提高轉(zhuǎn)錄效率[26]。

PpNDC1(Prupe.5G076700.1)與擬南芥 AtNDC1(AT5G08740)均是 NDC家族唯一蛋白質(zhì)，兩者的氨基酸序列均含有1個(gè)小的NADH 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，這個(gè)小的NADH結(jié)合位點(diǎn)被包含在一個(gè)更大的、被稱作氧化還原輔基的FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域里。說明物種間同源基因結(jié)構(gòu)上具有高度保守性，可能起源于同一個(gè)祖先。

EF-hand是1個(gè)由α-螺旋“E”(一個(gè)可能結(jié)合鈣的環(huán))和第二個(gè)α-螺旋“F”組成的基序[27]。含有EF-hand保守區(qū)域的蛋白質(zhì)主要有2類：鈣離子傳感器，可傳遞鈣離子信號(hào)；鈣離子信號(hào)調(diào)節(jié)劑，可調(diào)節(jié)鈣離子信號(hào)的形狀和/或持續(xù)時(shí)間，或參與鈣離子穩(wěn)態(tài)[28]。PpNDB亞家族3個(gè)成員中有2個(gè)成員含有EF-hand保守結(jié)構(gòu)域，而且PpNDB4(Prupe.3G231300.1)含有2個(gè)緊緊相鄰的EF-hand結(jié)構(gòu)域，PpNDB3(Prupe.4G037100.1)在390～464 aa含有1個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)域且是鈣離子結(jié)合位點(diǎn)，這與以往報(bào)道相同，植物NDB蛋白含有1個(gè)EF-hand保守區(qū)域，大約70個(gè)氨基酸殘基長度，它能結(jié)合鈣從而保證活性，在煙草中已得到證實(shí)，NDB活性依賴于鈣[4,29]。這間接說明含有EF-hand結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列有共同的祖先，一個(gè)家族的成員間是同源基因。PpNDB4(Prupe.3G231300.1)蛋白質(zhì)含有2個(gè)緊鄰的EF-hand結(jié)構(gòu)域，這與以往報(bào)道的EF-hand保守結(jié)構(gòu)域經(jīng)常成對(duì)出現(xiàn)的結(jié)論一致[27]。含有EF-hand保守結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)具有一系列多種功能[28]，有待在桃中進(jìn)一步探索和挖掘。

桃NDC1(Prupe.5G076700.1)有1個(gè)包含在大的FAD結(jié)構(gòu)域里面的1個(gè)小NADH結(jié)合結(jié)構(gòu)域，相對(duì)分子質(zhì)量是59 056。這與以往報(bào)道相同：含有1個(gè)FAD結(jié)構(gòu)域的典型的Ⅱ型NADH脫氫酶，相對(duì)分子質(zhì)量大小是50 000～60 000[2]。擬南芥中也有1個(gè)具有FAD結(jié)構(gòu)域的典型的Ⅱ型NADH脫氫酶蛋白質(zhì)NDC1(AT5G08740.1)，相對(duì)分子質(zhì)量是57 018，也介于50 000～60 000。大腸桿菌(Escherichiacoli)NDH和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)NDI1也分別是包含F(xiàn)AD的單個(gè)多肽Ⅱ型NADH脫氫酶蛋白質(zhì)，相對(duì)分子質(zhì)量是45 000～50 000[9]。這些說明NDC亞家族中的NDC1相對(duì)分子質(zhì)量在植物、細(xì)菌、酵母等生物中是不同的，在植物中含有1個(gè)FAD結(jié)構(gòu)域的典型的Ⅱ型NADH脫氫酶蛋白質(zhì)NDC1，相對(duì)分子質(zhì)量符合50 000～60 000的規(guī)律[2]，在細(xì)菌和酵母等生物中NDC相對(duì)分子質(zhì)量范圍需要進(jìn)一步確定和總結(jié)。這可能與物種的基因組大小相關(guān)，植物基因組比細(xì)菌、酵母等基因組大。

3.4 桃Ⅱ型NADH脫氫酶家族蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

最初的體內(nèi)GFP融合方法確定擬南芥NDA1、NDA2、NDB1、NDB2、NDC1蛋白質(zhì)都位于線粒體中[9]。Elhafez等[23]通過對(duì)分離線粒體進(jìn)行體外導(dǎo)入分析后確定NDB1、NDB2和NDB4定位于線粒體內(nèi)膜的外部，NDA1、NDA2和NDC1定位在線粒體內(nèi)膜的內(nèi)部。而NDB3因無法克隆，亞細(xì)胞定位未知。然而，隨后的研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥Ⅱ型NADH脫氫酶蛋白質(zhì)事實(shí)上是雙重定位的，NDA1、NDA2和NDB1被發(fā)現(xiàn)定位在線粒體和過氧化物酶體，NDC1被確定定位在線粒體和質(zhì)體[30]。這些研究得出的結(jié)論不同，是因?yàn)樽畛醯难芯績H使用目標(biāo)蛋白質(zhì)的C端GFP標(biāo)簽加上N端前50～100個(gè)氨基酸構(gòu)建載體[22]。

為了得到確定結(jié)論，Xu等[22]2013年通過AtNDA1、AtNDA2基因ORF全長C端融合表達(dá)，確定AtNDA1和AtNDA2表達(dá)的蛋白質(zhì)定位在線粒體中。如果只把編碼AtNDA1、AtNDA2蛋白質(zhì)最后10個(gè)氨基酸的基因融合表達(dá)，則發(fā)現(xiàn)AtNDA1、AtNDA2表達(dá)的蛋白質(zhì)定位在過氧化物酶體。OsNDA1基因ORF全長C端融合表達(dá)，確定OsNDA1表達(dá)的蛋白質(zhì)定位在線粒體中，如果只把編碼OsNDA1蛋白質(zhì)的最后10個(gè)氨基酸的基因融合表達(dá)，則發(fā)現(xiàn)OsNDA1表達(dá)的蛋白質(zhì)不定位在任何位置，OsNDA2表達(dá)的蛋白質(zhì)定位在線粒體和過氧化物酶體；AtNDB1表達(dá)的蛋白質(zhì)定位在線粒體和過氧化物酶體,AtNDB2和AtNDB4表達(dá)的蛋白質(zhì)均只定位在線粒體；OsNDB1和OsNDB2基因ORF全長C端融合表達(dá)，確定OsNDB1和OsNDB2表達(dá)的蛋白質(zhì)定位在線粒體中, 如果只把編碼OsNDB1和OsNDB2蛋白質(zhì)最后10個(gè)氨基酸的基因融合表達(dá)，則OsNDB1和OsNDB2表達(dá)的蛋白質(zhì)定位在過氧化物酶體；AtNDC1和OsNDC1表達(dá)的蛋白質(zhì)均定位在線粒體和質(zhì)體。在植物中，線粒體和質(zhì)體的功能也對(duì)各種發(fā)育和環(huán)境作出反應(yīng)，但有關(guān)信號(hào)的細(xì)節(jié)仍然未知；質(zhì)體功能可以影響線粒體的生物發(fā)生和活性[31]。光合作用缺陷細(xì)胞可改變線粒體基因在葉中表達(dá)和基因組拷貝數(shù)，但不影響在根中的表達(dá)和基因組拷貝數(shù)，這在大麥中較為明顯[32]。

本研究中6個(gè)Ⅱ型NADH脫氫酶蛋白質(zhì)被預(yù)測(cè)定位在線粒體或葉綠體的概率較高，這與其他物種(擬南芥和水稻)C端融合表達(dá)確定的亞細(xì)胞定位結(jié)果[22]既有相同之處，又有差異。PpNDA1被預(yù)測(cè)的最高可信度的亞細(xì)胞定位在線粒體，這與已驗(yàn)證的擬南芥AtNDA1[9]、萊氏衣藻CrNDA1[18]、土豆StNDA1[11]的亞細(xì)胞定位結(jié)果相同。萊氏衣藻CrNDA2和CrNDA3定位于葉綠體，CrNDA1、CrNDA5、CrNDA6、CrNDA7亞細(xì)胞定位結(jié)果目前還未知[33]；AtNDB2和StNDB1位于線粒體。下一步將對(duì)桃Ⅱ型NADH脫氫酶蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位進(jìn)行試驗(yàn)確定。

3.5 桃Ⅱ型NADH脫氫酶家族基因表達(dá)水平

基因表達(dá)水平分析結(jié)果顯示，桃NDB亞家族的3個(gè)基因均在老葉、幼葉、根中表達(dá)量更高，在熟果肉、熟果皮和枝表皮中表達(dá)量相對(duì)低或檢測(cè)不到，說明同一亞家族成員之間不僅在基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)保守區(qū)域、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)方面具有保守性，在行使的功能方面也可能具有保守性，且在成熟果實(shí)中行使的功能少或只在特定條件下的成熟果實(shí)中才具有功能。除了Prupe.3G231300.1(PpNDB4) 外，其余5個(gè)桃Ⅱ型NADH脫氫酶基因在老葉中的表達(dá)水平均分別顯著高于其在幼葉中的表達(dá)水平，據(jù)此推測(cè)5個(gè)桃Ⅱ型NADH脫氫酶基因在成熟的、深綠的老葉中行使的功能可能強(qiáng)于其在淺綠的嫩葉中行使的功能。Prupe.4G039000.1(PpNDA2)、Prupe.4G037100.1(PpNDB3)、Prupe.3G231300.1(PpNDB4)在白色幼根中表達(dá)量較高，且顯著高于其在葉芽、枝表皮、幼果肉、熟果肉、熟果皮中的表達(dá)水平，據(jù)此推測(cè)這3個(gè)Ⅱ型NADH脫氫酶基因可能在根生長、發(fā)育等方面具有重要作用。有研究結(jié)果表明，通過線粒體呼吸鏈中的非磷酸化途徑氧化NADH在陸地植物和濕地植物中都很常見；在濕地植物的根部，這些特性尤為顯著，所以它們可以在長期缺氧和缺氧脅迫下生存[34-35]。將來可以進(jìn)一步從Ⅱ型NADH脫氫酶基因入手，解析其在桃樹抗?jié)车确矫娴姆肿幼饔脵C(jī)理。

6個(gè)桃Ⅱ型NADH脫氫酶成員的系統(tǒng)性分析為未來基因功能研究提供了重要方向和依據(jù)。下一步將通過轉(zhuǎn)基因、亞細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)互作等試驗(yàn)驗(yàn)證基因功能，以期明確桃Ⅱ型NADH脫氫酶基因在調(diào)控光呼吸、適應(yīng)生物和非生物逆境(如冷害、澇害等)及其他代謝途徑等過程的具體作用機(jī)理。