防治水稻惡苗病拮抗細(xì)菌的篩選、鑒定和評(píng)價(jià)

李風(fēng)順， 喬俊卿， 張榮勝， 劉郵洲， 劉永鋒

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，江蘇 南京 210095； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，江蘇 南京 210014)

水稻惡苗病是常見種傳病害，自1828年日本首次報(bào)道后，幾乎在世界各水稻種植區(qū)均有發(fā)生，在中國稻區(qū)分布廣泛，造成不同程度的危害，一般減產(chǎn)10%～20%，嚴(yán)重時(shí)達(dá)50%[1-2]。水稻惡苗病由藤倉鐮刀菌復(fù)合菌群引起，已報(bào)道的病原菌種屬包括藤倉鐮刀菌(Fusariumfujikuroi)、層出鐮刀菌(Fusariumproliferatum)、擬輪枝鐮刀菌(Fusariumverticilliodes)、Fusariumandiyazi、Fusariumasiaticum和禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)，其中藤倉鐮刀菌和層出鐮刀菌分布最廣，致病力最強(qiáng)，是引起水稻惡苗病的主要致病菌，其他種屬的鐮刀菌有混合侵染的現(xiàn)象[3-4]。水稻惡苗病癥狀主要表現(xiàn)為：苗期徒長、葉片細(xì)長呈淡綠色、矮化、死苗；成株期出現(xiàn)根部和莖基部腐爛，嚴(yán)重時(shí)整株枯死或徒長，長倒生根；水稻灌漿后，發(fā)病嚴(yán)重的植株籽粒帶菌(粉紅色霉層)[5-6]。

目前水稻生產(chǎn)上，采用化學(xué)藥劑拌種、浸種或包衣防治水稻惡苗病。截至2020年，中國農(nóng)藥信息網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，中國登記防治水稻惡苗病的種衣劑有68種(包括單劑和復(fù)配劑)，產(chǎn)品有效成分均為化學(xué)藥劑，其中約80%的產(chǎn)品有效成分含有咪鮮胺、精甲霜靈、咯菌腈或多菌靈。隨著水稻惡苗病病菌對(duì)多菌靈、咪鮮胺產(chǎn)生抗藥性[7-9]，咯菌腈、精甲霜靈和氰烯菌酯成為市場(chǎng)上防治水稻惡苗病的主要制劑[10]。由于水稻惡苗病病菌對(duì)化學(xué)藥劑產(chǎn)生的抗藥性逐年上升，過量使用化學(xué)農(nóng)藥造成生態(tài)環(huán)境嚴(yán)重污染，農(nóng)藥殘留增加，嚴(yán)重危害人類健康。隨著中國植保綠色防控的推廣，生物防治成為綠色綜合防控技術(shù)中的重要措施。生物農(nóng)藥源于自然，對(duì)環(huán)境友好，在病蟲害綜合治理中，是一類理想的可替代或部分替代化學(xué)農(nóng)藥的產(chǎn)品，大力發(fā)展生物農(nóng)藥，符合當(dāng)前中國農(nóng)業(yè)和環(huán)境可持續(xù)發(fā)展的要求[11]。

中國在20世紀(jì)90年代即有關(guān)于防治水稻惡苗病的生防微生物篩選的相關(guān)研究，如陳志誼等[12]報(bào)道了利用拮抗芽孢桿菌防治水稻紋枯病和惡苗病；2006年，李斌等[13]報(bào)道了枯草芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌對(duì)水稻惡苗病病菌具有較好拮抗效果。已有研究主要是以水稻惡苗病病菌(Fusariummoniliforme)為指示菌篩選拮抗菌株，由于水稻惡苗病是多種菌群復(fù)合侵染，因此利用致病菌復(fù)合菌群為指示菌篩選拮抗菌株，更符合生產(chǎn)實(shí)際。本研究以不同種屬的惡苗病致病菌為指示菌篩選拮抗菌，通過溫室盆栽試驗(yàn)，最終獲得優(yōu)良生防促生菌株，以期為創(chuàng)制防治水稻惡苗病的種子處理劑提供具有潛力的菌株資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

土壤樣品采集于江蘇省南京市溧水區(qū)和常州市金壇區(qū)的水稻、西瓜、青菜、辣椒和安徽淮南的樟樹、紫荊、鵝掌楸、桂花和樸樹等植物根圍土壤，共16份。

供試菌株為實(shí)驗(yàn)室保存的水稻惡苗病病菌：Fusariumfujikuroi50-1、Fusariumasiaticum25-2、FusariumproliferatumE-Q、FusariumgraminearumDG-9、FusariumgraminearumDG-11、Fusariumproliferatum63-2。水稻品種：金剛30。

水稻惡苗病病菌活化、培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基。拮抗細(xì)菌的分離、純化及發(fā)酵培養(yǎng)等所用的培養(yǎng)基為1/2 TSB、M715、LB、YPGA培養(yǎng)基，生物膜形成所用培養(yǎng)基為Msgg培養(yǎng)基，芽孢桿菌產(chǎn)孢所用的培養(yǎng)基為SSM培養(yǎng)基。各培養(yǎng)基配方見表1。

表1 本研究所用培養(yǎng)基

1.2 拮抗細(xì)菌的分離和純化

采用稀釋涂板法進(jìn)行拮抗細(xì)菌的分離。稱取10 g土壤于90 ml無菌水中，25 ℃ 150 r/min振蕩1 h后，即得到所需的土壤懸浮液，將土壤懸浮液進(jìn)行10倍梯度稀釋，稀釋液分別涂布分離平板(分離培養(yǎng)基為LB、YPGA、1/2TSB、M715)。平板于28 ℃生長2～5 d，依據(jù)菌落形態(tài)、大小、色澤等挑選不同分離物，轉(zhuǎn)接至相應(yīng)培養(yǎng)平板，通過劃線法進(jìn)行單胞純化，直至有單菌落為止。本研究共分離獲得432株細(xì)菌，并進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 拮抗細(xì)菌的篩選

采用孢子萌發(fā)抑制法進(jìn)行拮抗細(xì)菌初步篩選。6株水稻惡苗病病菌在PDA平板上活化，生長4～5 d后，用無菌水洗滌孢子，分別將孢子液調(diào)整為1 ml 1×106個(gè)孢子，隨后，將6種孢子液等體積混合，并調(diào)整混合孢子液濃度為1 ml 1×105個(gè)孢子，吸取100 μl均勻涂布于PDA平板，晾干備用。將單胞純化后的細(xì)菌用無菌牙簽接入PDA平板培養(yǎng)，28 ℃培養(yǎng)3～4 d，調(diào)查細(xì)菌抑制孢子萌發(fā)的情況，3次重復(fù)。

采用平板對(duì)峙試驗(yàn)法進(jìn)行拮抗細(xì)菌復(fù)篩。6株水稻惡苗病病菌在PDA平板上活化，生長2～3 d后，沿生長茂盛的菌落邊緣打孔(直徑5 mm)制備菌餅，將菌餅置于PDA平板中央，先將其放入28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，備用。以菌餅為中心，按“十”字方位將單胞純化后的細(xì)菌接入已培養(yǎng)24 h的PDA平板，每菌株重復(fù)3次，28 ℃恒溫培養(yǎng)直到對(duì)照平板長滿真菌時(shí)，調(diào)查拮抗菌抑菌帶寬。

1.4 拮抗菌生物學(xué)相關(guān)特性的測(cè)定

1.4.1 拮抗細(xì)菌的生物膜形成能力和群集游動(dòng)能力(Swarming)檢測(cè) 將拮抗菌株平板活化，單胞接入LB培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)，再次轉(zhuǎn)接入新鮮LB培養(yǎng)液中，待對(duì)數(shù)生長期OD600為1.0時(shí)，取菌液1 μl滴于Msgg培養(yǎng)基[14]中，28 ℃培養(yǎng)，分別于24 h、36 h和48 h觀察菌株生物膜情況，3次重復(fù)。同時(shí)，將上述菌液取1 μl滴于0.7% LB平板中心，28 ℃培養(yǎng)，分別于24 h和48 h觀察菌株群集游動(dòng)情況，測(cè)量菌落直徑，3次重復(fù)。

1.4.2 拮抗細(xì)菌產(chǎn)生脂肽類物質(zhì)的檢測(cè) 將拮抗菌株平板活化，單胞接入LB培養(yǎng)液中30 ℃180 r/min培養(yǎng)12～16 h；隨后，將培養(yǎng)液按照1%接種體積接入新鮮LB培養(yǎng)液中，30 ℃ 180 r/min培養(yǎng)48 h，利用鹽酸沉淀法提取脂肽類抗生素。脂肽類物質(zhì)粗提物經(jīng)0.22 μm無菌濾膜過濾，進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)。具體檢測(cè)方法如下：HPLC分析采用C18柱(Sephasil Peptide C18 5 μm ST 4.6/250)；流動(dòng)相為乙腈(A)、水(B)和0.1%三氟乙酸；采用梯度檢測(cè)方法(0～25 min，60% A和40% B; 25～35 min, 70% A和30% B; 35～60 min, 93% A和7% B)；流速為0.8 ml/min，進(jìn)樣量為10 μl，檢測(cè)波長為210 nm，柱溫為30 ℃[15]。

1.5 拮抗細(xì)菌種屬分子鑒定

離心收集拮抗細(xì)菌LB過夜培養(yǎng)的菌體，按照常規(guī)SDS(十二烷基硫酸鈉)堿裂解法小量提取基因組DNA。以細(xì)菌基因組為模板擴(kuò)增16S rRNA 部分序列。16S rRNA序列擴(kuò)增引物：16S F(27f),5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；16S R (1492r),5′-GGTTACCTTACGACTT-3′。測(cè)序由北京擎科生物技術(shù)有限公司完成，通過NCBI 網(wǎng)站的BLAST 程序進(jìn)行同源性比對(duì)，采用Mega軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 拮抗細(xì)菌對(duì)水稻的促生作用評(píng)價(jià)

將水稻健康種子在體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液中浸泡2 min，用無菌水沖洗2～3次，再用75%乙醇浸泡1 min，用無菌水沖洗至無乙醇?xì)埩艉笤跓o菌濾紙上晾干，每30粒分裝于滅菌離心管。分別選用OD600=1.00、OD600=0.10和OD600=0.01的拮抗菌孢子液(利用芽孢桿菌產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基培養(yǎng)至90%產(chǎn)芽孢，芽孢離心收集后用無菌水稀釋到相應(yīng)濃度)浸種24 h，以無菌水作為對(duì)照。將種子取出，保持濕潤狀態(tài)，室溫催芽72 h記錄萌發(fā)情況，每處理測(cè)量10粒正常萌發(fā)種子的根長，比較不同濃度拮抗菌孢子液對(duì)種子根長的促生作用。用OD600=0.10的各拮抗菌的孢子液(無菌水稀釋)浸種已消毒的水稻種子24 h后，室溫催芽，待露白后將種子播種于一次性水杯中，置于溫室(16～25 ℃)中生長，每杯10粒，每處理重復(fù)3次。30 d后調(diào)查所有植株的株高和鮮質(zhì)量，評(píng)估拮抗菌的促生效果。

1.7 拮抗細(xì)菌對(duì)水稻苗期惡苗病的防效評(píng)價(jià)

拮抗細(xì)菌平板活化后，單胞接入LB培養(yǎng)基， 30 ℃ 180 r/min培養(yǎng)12～16 h，按照1%接種體積接入YPGA培養(yǎng)液中，30 ℃ 180 r/min培養(yǎng)48～72 h，待拮抗細(xì)菌細(xì)胞80%以上成為芽孢后，收集發(fā)酵菌液備用。將健康種子與試驗(yàn)田留存的自然發(fā)病的惡苗病水稻種子混合(健康種子∶惡苗病種子=4∶1)，分裝50粒到15 ml滅菌離心管中，分別用OD600=1.0和OD600=0.1的拮抗細(xì)菌發(fā)酵菌液浸種24 h，用無菌水和25%咪鮮胺乳油(4 000倍稀釋液)作為空白和化學(xué)藥劑對(duì)照，重復(fù)3次。種子催芽后播種于盆缽中，30 d后調(diào)查發(fā)病情況，計(jì)算發(fā)病率和防治效果。

發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)/總株數(shù)×100%。

防治效果=[(對(duì)照發(fā)病率-處理發(fā)病率)/對(duì)照發(fā)病率]×100%。

1.8 數(shù)據(jù)分析方法

數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析采用Excel和DPS軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗細(xì)菌的分離、純化和篩選

將16份土壤樣品稀釋懸浮液涂布于不同的分離培養(yǎng)基平板上，共分離獲得不同菌落形態(tài)的細(xì)菌分離株432株，利用6株水稻惡苗病病菌孢子混合液初步篩選獲得17株對(duì)孢子萌發(fā)有抑制作用的菌株。隨后，通過平板對(duì)峙試驗(yàn)評(píng)價(jià)17株菌株對(duì)6株指示菌菌絲生長的抑制效果，結(jié)果(表2)顯示，6株拮抗菌對(duì)不同的水稻惡苗病病菌都具有較為顯著的抑制效果，這6株菌株分別是LSRS26、JTRSM1、JTGSL12、JTGSM22、JTLM2和AHGHL2。

表2 拮抗菌對(duì)水稻惡苗病病菌的平板抑制作用

2.2 拮抗細(xì)菌的生防相關(guān)特征評(píng)價(jià)

本研究對(duì)篩選獲得的6株拮抗菌進(jìn)行了生物膜形成能力、群集游動(dòng)能力(Swarming)和芽孢桿菌脂肽類物質(zhì)產(chǎn)生情況的分析。

生物膜形成試驗(yàn)結(jié)果(圖1)顯示，在生物膜形成培養(yǎng)基Msgg中，拮抗菌培養(yǎng)24 h時(shí)，只有菌株JTRSM1形成了較為致密的菌膜，而菌株LSRS26、JTGSL12和AHGHL2僅僅在培養(yǎng)基表面看到非常單薄的菌膜；隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，在36 h時(shí)，菌株LSRS26、JTRSM1、JTGSL12和AHGHL2都可以形成致密褶皺的生物膜，在培養(yǎng)48 h時(shí)，4株菌的生物膜更加致密、褶皺更多(圖1A)；但是菌株JTGSM22和JTLM2培養(yǎng)48 h后，仍然不能形成明顯的生物膜。4株菌株在培養(yǎng)48 h形成生物膜的干質(zhì)量分析結(jié)果(圖1B)顯示，菌株LSRS26、JTRSM1和AHGHL2形成的生物膜干質(zhì)量基本相當(dāng)，為4.40～4.65 mg，菌株JTGSL12形成生物膜的干質(zhì)量略低，為3.37 mg。

A：拮抗菌形成的生物膜表形；B：拮抗菌培養(yǎng)48 h形成的生物膜干質(zhì)量。圖1 拮抗菌在Msgg培養(yǎng)基中形成生物膜的情況Fig.1 Biofilm formation of antagonistic bacteria in Msgg culture

群集游動(dòng)能力試驗(yàn)結(jié)果(圖2A)顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，5株拮抗菌的Swarming菌落直徑逐漸增加，但菌株JTLM2的群集游動(dòng)能力較差，基本未發(fā)生游動(dòng)現(xiàn)象。此外，在培養(yǎng)48 h時(shí)，菌株JTGSM22游動(dòng)能力最強(qiáng)，直徑達(dá)7 cm；游動(dòng)菌落直徑比較結(jié)果(圖2B)表明，各菌株游動(dòng)能力強(qiáng)弱：JTGSM22>JTGSL12>LSRS26>AHGHL2>JTRSM1>JTLM2。

A：拮抗菌群集游動(dòng)平板表形；B：拮抗菌群集游動(dòng)擴(kuò)散直徑。圖2 拮抗菌在0.7% LB平板的群集游動(dòng)能力Fig.2 Swarming ability of antagonistic bacteria in 0.7% LB plate

采用鹽酸(HCl)沉淀法提取芽孢桿菌脂肽類物質(zhì)粗提物，其中菌株JTGSM22 和JTLM2發(fā)酵液加HCl后未產(chǎn)生沉淀，其余4株菌株均產(chǎn)生沉淀并提取到脂肽類物質(zhì)，隨后通過高效液相色譜檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)生脂肽類抗生素的情況，結(jié)果如圖3所示，菌株LSRS26、JTGSL12、JTRSM1、AHGHL2 均可產(chǎn)生表面活性素(Surfactin)、伊枯草菌素(Iturin)和范革素(Fengycin)。

Surfactin：表面活性素；Fengycin：范革素；Iturin：伊枯草菌素。圖3 高效液相色譜檢測(cè)拮抗細(xì)菌產(chǎn)生脂肽類物質(zhì)情況Fig.3 High performance liquid chromatography (HPLC) detection of lipopeptides produced by antagonistic bacteria

2.3 拮抗細(xì)菌種屬的鑒定

利用16S rDNA基因部分序列，對(duì)6株拮抗菌進(jìn)行種屬鑒定。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI進(jìn)行同源性比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。序列比對(duì)結(jié)果表明，菌株LSRS26、JTRSM1、JTGSL12和AHGHL2是Bacillusamyloliquefaciens(解淀粉芽孢桿菌)，菌株JTGSM22和JTLM2是Paenibacillusjamilae(杰米拉類芽孢桿菌)。

Bacillus amyloliquefaciens：解淀粉芽孢桿菌；Paenibacillus jamilae：杰米拉類芽孢桿菌。圖4 拮抗菌16S rDNA部分序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phyligenetic tree constructed by part region of the 16S rDNA of antagonistic bacteria

2.4 拮抗細(xì)菌對(duì)水稻的促生作用

綜合拮抗細(xì)菌的抑菌活性、生防相關(guān)特征、種屬鑒定以及后期發(fā)酵生產(chǎn)的難易等因素，本研究選擇拮抗菌LSRS26、JTRSM1和JTGSL12進(jìn)行水稻促生作用評(píng)價(jià)。利用拮抗菌不同濃度的孢子液對(duì)水稻種子進(jìn)行浸種處理，評(píng)價(jià)其對(duì)種子發(fā)芽和胚根伸長的促進(jìn)作用。試驗(yàn)結(jié)果(圖5)顯示，當(dāng)用OD600=0.01和1.00的拮抗菌芽孢菌液浸種后，LSRS26、JTRSM1和JTGSL12菌株對(duì)水稻種子發(fā)芽都沒有促進(jìn)作用；當(dāng)用OD600=0.10的菌液浸種后，菌株LSRS26和JTRSM1對(duì)水稻發(fā)芽和胚根伸長都具有促進(jìn)作用，JTGSL12處理與對(duì)照無顯著差異。盆栽苗期株高和植株鮮質(zhì)量數(shù)據(jù)分析結(jié)果(圖6)表明，用OD600=0.10的菌液浸種后，3株芽孢桿菌對(duì)水稻植株鮮質(zhì)量和株高都具有不同程度的促進(jìn)作用，其中JTGSL12對(duì)水稻植株鮮質(zhì)量增加的促進(jìn)效果最為顯著。用菌株JTGSL12處理后，水稻株高平均達(dá)23.57 cm，植株鮮質(zhì)量平均為0.372 g；用菌株JTGSM1處理后，水稻植株鮮質(zhì)量平均為0.325 g。

圖5 拮抗細(xì)菌對(duì)水稻種子發(fā)芽和胚根伸長的促進(jìn)作用Fig.5 Promotion effects of antagonistic bacteria on rice germination and radicula elongation

圖6 拮抗細(xì)菌(OD600=0.10)對(duì)水稻株高和鮮質(zhì)量的促生作用Fig.6 Promotion effects of antagonistic bacteria on rice plant height and fresh weight

2.5 拮抗細(xì)菌對(duì)水稻苗期惡苗病的盆栽防治效果

利用不同濃度(OD600=1.0和OD600=0.1)菌液對(duì)帶病稻種浸種24 h后，進(jìn)行催芽播種，并在30 d時(shí)調(diào)查水稻植株惡苗病發(fā)病情況，結(jié)果(圖7)顯示，在菌液OD600=1.0時(shí)浸種，3株芽孢桿菌對(duì)水稻惡苗病都表現(xiàn)出不同程度的防治作用，防效為58.00%～72.00%，其中JTGSL12的防效最高，為71.62%。在菌液OD600=0.1時(shí)浸種，3株芽孢桿菌對(duì)水稻惡苗病的防效均比菌液OD600=1.0時(shí)顯著下降，防效為32%～50%，其中LSRS26的防效較好。

不同處理間標(biāo)有不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖7 拮抗菌發(fā)酵菌液對(duì)水稻惡苗病苗期防效評(píng)價(jià)Fig.7 Control effects of antagonistic bacteria on rice bakanae disease in seedling stage

3 結(jié)論與討論

由藤倉鐮刀菌復(fù)合菌群引起的水稻惡苗病近年來在中國稻區(qū)時(shí)有發(fā)生，造成不同程度的危害，其中藤倉鐮刀菌、層出鐮刀菌分布最廣，致病力最強(qiáng)，也是引起江蘇省水稻惡苗病的主要病原菌種類[16]。由于惡苗病病菌對(duì)常用化學(xué)藥劑咪鮮胺、氰烯菌酯等的抗藥性增強(qiáng)和植保綠色防控技術(shù)的推廣，使用生物防治技術(shù)防治水稻惡苗病的相關(guān)研究逐漸增多。有研究報(bào)道，枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、多黏芽孢桿菌和放線菌等可用于防治水稻惡苗病[17-21]。本研究從植物根際土壤中分離獲得不同形態(tài)的細(xì)菌432株，以不同水稻惡苗病致病菌F.fujikuroi、F.proliferatum、F.asiaticum、F.graminearum為指示菌，篩選獲得6株對(duì)不同水稻惡苗病病菌均有較好抑制效果的拮抗菌，其中4株鑒定為解淀粉芽孢桿菌，2株鑒定為杰米拉類芽孢桿菌。本研究獲得的拮抗菌是以惡苗病致病菌復(fù)合菌群為指示菌進(jìn)行篩選，區(qū)別于以往報(bào)道的以單一病原菌為指示菌的篩選；這些拮抗菌更適用于防治復(fù)合菌群引起的水稻惡苗病，可為開發(fā)適用范圍更廣的生防制劑積累菌株資源。

芽孢桿菌活體微生物制劑效價(jià)的穩(wěn)定性和貨架期主要受其抑菌活性物質(zhì)、定殖能力和芽孢形成能力的影響。拮抗菌的生物膜形成能力與其在生境中的定殖能力密切相關(guān)，游動(dòng)能力決定了生防菌在根圍的營養(yǎng)攝取能力，脂肽類抗生素的產(chǎn)生直接與生防芽孢桿菌的抑菌效果密切相關(guān)[22-25]。本研究在篩選獲得6株拮抗菌后，進(jìn)一步評(píng)估了菌株的生物膜形成能力、群集游動(dòng)能力和芽孢桿菌產(chǎn)脂肽類物質(zhì)的情況。解淀粉芽孢桿菌LSRS26、JTGSL12和JTGSM1在對(duì)惡苗病病菌的抑菌效果、生物膜形成能力、群集游動(dòng)能力和產(chǎn)抑菌物質(zhì)方面表現(xiàn)較為優(yōu)秀，且易于生產(chǎn)、發(fā)酵形成芽孢；而菌株JTLM2和JTGSM22為杰米拉類芽孢桿菌，與多黏芽孢桿菌同源，雖有較強(qiáng)的抑菌活性，但JTLM2的游動(dòng)能力最差，JTGSM22在培養(yǎng)基中產(chǎn)生的多糖較多，不利于定殖和液體生產(chǎn)、發(fā)酵。綜合以上分析，本研究最終選擇芽孢桿菌LSRS26、JTGSL12和JTGSM1進(jìn)一步開展對(duì)水稻的促生作用和對(duì)惡苗病的防治效果研究。

隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，早期枯草芽孢桿菌菌群中的解淀粉芽孢桿菌被進(jìn)一步劃分為單一的新種[26]?；蚪M序列分析發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌比枯草芽孢桿菌含有更多的次生代謝產(chǎn)物合成基因簇，且可產(chǎn)生種類更多的抑菌物質(zhì)，如解淀粉芽孢桿菌FZB42可以產(chǎn)生Surfactin、 Fengycin、Bacillomycin D等，而枯草芽孢桿菌模式株Bs168雖然含有部分脂肽類抗生素的合成基因簇，但不能正常合成相應(yīng)物質(zhì)[27]。本研究中，高效液相色譜檢測(cè)結(jié)果表明，菌株LSRS26、JTGSL12和JTGSM1產(chǎn)生的Iturin和Fengycin相對(duì)較多，而這些物質(zhì)是抑制真菌的主要活性物質(zhì)。本研究按照平板抑菌效果、定殖能力、游動(dòng)能力和產(chǎn)抑菌物質(zhì)能力，并結(jié)合后期菌株發(fā)酵難易程度等多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)篩選和評(píng)價(jià)生防菌，與郭堅(jiān)華等[28]的研究思路類似，并進(jìn)行了必要的擴(kuò)展，這更有利于精準(zhǔn)獲得在田間具有潛在應(yīng)用價(jià)值的菌株資源。

水稻種植大戶主要采用化學(xué)種子處理劑進(jìn)行水稻惡苗病的防治，隨著國家農(nóng)藥、化肥雙減工作的推進(jìn)，綠色防控勢(shì)在必行[29-30]，而微生物農(nóng)藥使用是其中的重要部分，因此，生防菌篩選確定后，繼續(xù)研發(fā)生物農(nóng)藥制劑是推進(jìn)市場(chǎng)應(yīng)用的必然過程。本研究團(tuán)隊(duì)后續(xù)將以篩選獲得的生防菌株作為材料，進(jìn)一步研發(fā)防治水稻惡苗病的種子處理劑。雖然，生物防治越來越多地應(yīng)用于病害防治領(lǐng)域，但與化學(xué)藥劑防治相比，生物防治效果相對(duì)較差，且不穩(wěn)定。因此，可以在種子處理劑研發(fā)過程中，加強(qiáng)助劑的篩選、生防菌與現(xiàn)有化學(xué)農(nóng)藥的兼容性等方面的研究，篩選可以增效的助劑和具有兼容性的化學(xué)藥劑，后期田間生產(chǎn)中可以考慮將生物農(nóng)藥與化學(xué)農(nóng)藥混用，既降低化學(xué)農(nóng)藥用量，又可以保證防治效果。