北美鵝掌楸LtAGO1基因的克隆、表達(dá)及其啟動(dòng)子分析

魏靈敏， 溫少瑩， 馬際凱， 夏 輝， 李嘉昱， 吳栩佳， 李火根

( 南京林業(yè)大學(xué) 林木遺傳與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 南京林業(yè)大學(xué) 南方現(xiàn)代林業(yè)創(chuàng)新中心， 南京 210037 )

葉是高等植物進(jìn)行光合作用和蒸騰作用的主要器官，葉原基起源于莖頂端分生組織(shoot apical meristem, SAM)的周邊區(qū)。在控制細(xì)胞由分裂轉(zhuǎn)入生長(zhǎng)的形態(tài)建成過(guò)程中，葉原基發(fā)生了極性分化(Bowman & Eshed, 2000)。1基因的突變將會(huì)影響葉原基分化及器官極性的選擇等一系列發(fā)育進(jìn)程(Wu et al.，2009； Liu & Nonomura, 2016)。王永益(2019)通過(guò)點(diǎn)突變能獲得擬南芥針狀葉的1-27突變體和卷曲芽狀復(fù)葉的1-38 突變體。李素芬等(2014)對(duì)1超表達(dá)得到了葉緣呈鋸齒狀的擬南芥。在模式植物水稻和玉米中，采用敲除、過(guò)表達(dá)1基因及互補(bǔ)缺陷突變體的方法，初步明確1基因的缺失會(huì)降低水稻的結(jié)實(shí)率和花粉育性，而1基因的過(guò)表達(dá)能使葉片正面卷曲、株高降低(徐東東， 2014；Li et al.，2019)。番茄168靶向調(diào)控1基因的表達(dá)，增強(qiáng)了番茄對(duì)低鉀脅迫的抗性(Liu et al.，2020)；擬南芥1-27比野生型對(duì)淹水更敏感，且在低氧條件下和4共同調(diào)控該脅迫信號(hào)的的傳遞(Elena et al.，2020)。姚曉華等(2021)發(fā)現(xiàn)，青稞1編碼的蛋白在抗條紋病的調(diào)控通路中發(fā)揮重要作用。近期研究發(fā)現(xiàn)，1是通過(guò)誘導(dǎo)茉莉酸(JA)信號(hào)通路中相關(guān)基因的產(chǎn)生并激活JA反應(yīng)來(lái)響應(yīng)脅迫(Liu et al.，2018)?？梢?，1通過(guò)多種途徑參與植物抗逆的響應(yīng)及調(diào)節(jié)過(guò)程。此外，1參與小麥花藥和花粉粒的發(fā)育(馮楠，2018)，擬南芥根分生組織需要1的活性來(lái)維持細(xì)胞的增殖(Adrien et al.，2019)。1基因在植物器官極性選擇、分生組織分化、花器官發(fā)育和脅迫響應(yīng)等多方面起重要調(diào)控作用。

北美鵝掌楸與鵝掌楸都是以葉形奇特、干型優(yōu)美為特色的具有觀賞價(jià)值的園林樹種，其葉片具有三裂和五裂的形態(tài)差異，是研究觀葉樹種葉形多樣性及品種改良的理想材料。近年來(lái)，楊穎等(2014)證實(shí)北美鵝掌楸中有9個(gè)基因參與葉片的衰老進(jìn)程。Ma等(2018，2019)探明鵝掌楸從葉原基分化成葉片4個(gè)階段的形態(tài)發(fā)育過(guò)程，從轉(zhuǎn)錄組中篩選驗(yàn)證10條與葉發(fā)育相關(guān)的差異基因，發(fā)現(xiàn)6基因可使擬南芥葉序紊亂、葉片深裂及不育。然而，目前對(duì)于北美鵝掌楸奇特葉形的形成機(jī)制仍不清楚，1基因是否參與了葉形發(fā)育的調(diào)控進(jìn)程，與北美鵝掌楸葉芽和花芽孕育的關(guān)系也尚未明確。

高等植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程受基因的表達(dá)量控制，基因的轉(zhuǎn)錄水平受包含順式作用元件的啟動(dòng)子影響(Dey et al.，2015)。擬南芥和啟動(dòng)子可調(diào)控花和花藥的發(fā)育 (Shih et al.，2014；Dai et al.，2019)，表明啟動(dòng)子在影響植物的性狀和調(diào)控方式上發(fā)揮重要作用。本研究采用RACE克隆技術(shù)獲得北美鵝掌楸1基因的全長(zhǎng)cDNA，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)及組織差異表達(dá)分析，初步了解該基因功能，并重點(diǎn)關(guān)注1基因啟動(dòng)子序列的分析和組織表達(dá)特異性，旨在為1基因啟動(dòng)子對(duì)相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 不同組織的取樣 在南京林業(yè)大學(xué)的鵝掌楸種源試驗(yàn)林中，選取物候期基本一致的北美鵝掌楸(美國(guó)南卡羅來(lái)納州種源)和鵝掌楸(中國(guó)武夷山種源)作為供試材料。2018年4月，分別采集長(zhǎng)勢(shì)良好的3個(gè)株系幼嫩葉片的3個(gè)部位(葉緣、葉基部和葉中部)，具體參考沈宗根等(2003)的方法。同時(shí)，采集北美鵝掌楸同一時(shí)期的8個(gè)組織樣品(葉片、莖、雄蕊、雌蕊、花芽、花萼、葉芽和花瓣)。2018年3—8月期間，分別采集北美鵝掌楸葉芽萌動(dòng)期、幼葉期、葉成熟期和葉衰老期的葉片，具體參考肖懷娟(2014)的方法?？蓪⑵鋭澐譃?個(gè)部分，即a、c和e為葉緣凸出部分，b和d為葉緣凹陷部分，f為葉柄，g為葉中間部分。據(jù)前期的物候觀察發(fā)現(xiàn)，在7月，北美鵝掌楸葉片的形態(tài)變異最大。因此，本研究于2018年7月采集北美鵝掌楸不同大小的葉片，用消毒的剪刀分離樣品至1 g，具體參考李四游(2015)的方法。所有樣品重復(fù)取樣3次，置于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于提取RNA。

1.1.2 生化試劑 植物總RNA提取試劑盒購(gòu)自天根(TIANGEN)生物公司，PrimeScriptRT Master Mix(Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒、3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptRTase試劑盒、SMARTerRACE 5′/3′ Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PrimeSTARMax DNA Polymerase高保真酶、DL 2 000 DNA marker和SYBR Premix Ex Taq酶均購(gòu)自Takara公司，核酸染料Gel Stain、Easy Pure Quick Gel Extraction Kit凝膠回收試劑盒和Blunt載體均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，ClonExpressUltra One Step Cloning Kit重組酶購(gòu)自諾唯贊生物公司，大腸桿菌()T1與農(nóng)桿菌()GV3101購(gòu)自上海唯地生物公司，過(guò)表達(dá)載體PBI121-GUS由本實(shí)驗(yàn)室提供，引物合成由南京金斯瑞公司完成，其編號(hào)及序列見表1。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的克隆 根據(jù)北美鵝掌楸()轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ancangio.uga.edu/content/liriodendron-tulipifera)，篩選出注釋名為1基因的EST序列，通過(guò)Oligo 7軟件設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，以北美鵝掌楸葉芽的cDNA、3′-RACE和5′-RACE為模板，擴(kuò)增1基因的3個(gè)目的片段。PCR體系為50 μL，擴(kuò)增程序：98 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃徹底延伸5 min。將目的片段連接至Blunt載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌T1感受態(tài)細(xì)胞，挑菌送測(cè)。利用DNAMAN軟件拼接后獲得全長(zhǎng)cDNA序列，使用NCBI ORF Finder 在線軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預(yù)測(cè)開放閱讀框并設(shè)計(jì)引物，驗(yàn)證基因克隆的正確性。依據(jù)驗(yàn)證成功的1基因CDS序列，查找其上游啟動(dòng)子序列。該啟動(dòng)子序列信息來(lái)自鵝掌楸(廬山種源)NJFU-Lchi-2.0基因組測(cè)序結(jié)果(Chen et al.，2019)，利用同源克隆法設(shè)計(jì)驗(yàn)證引物，引物序列見表1。使用改良CTAB法(馬明等，2007)提取采樣組織的DNA，以此為模板擴(kuò)增出約2 000 bp的啟動(dòng)子序列并測(cè)序確認(rèn)。

表 1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.21基因的生物信息學(xué)分析 使用NCBI conserved domain在線軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)預(yù)測(cè)LtAGO1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。使用ExPASy中的Protparam工具(https://web.expasy.org/protparam/)在線分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，使用SOPMA在線軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和Phyre2在線軟件(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)分別預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二、三級(jí)結(jié)構(gòu)，使用SignalP 5.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)蛋白是否含信號(hào)肽，使用PSORT在線軟件(https://wolfpsort.hgc.jp/)預(yù)測(cè)蛋白亞細(xì)胞的定位情況。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLASTx中查找同源序列，使用Clustal X軟件分析LtAGO1蛋白同源性和 MEGA 7軟件構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)進(jìn)化樹。使用PlantCARE 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)對(duì)克隆得到的啟動(dòng)子序列進(jìn)行順式作用元件分析。

1.2.31基因的表達(dá)分析 使用植物總RNA提取試劑盒分別提取鵝掌楸屬不同發(fā)育時(shí)期的葉片及不同組織的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈，稀釋20倍后作為RT-qPCR模板。通過(guò)Oligo 7軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，參考本實(shí)驗(yàn)室鵝掌楸內(nèi)參基因97(Tu et al.，2019)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量qPCR反應(yīng)，引物序列見表1。反應(yīng)體系為20 μL，分別為 SYBR Premix Ex Taq Ⅱ10 μL，上下游引物各0.4 μL(5 μmol·L)，ROX Reference Dye or Dye Ⅱ0.4 μL，模板(100 ng)2 μL，RNAase-free ddH0 6.8 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，40個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，用2法(Livak et al.，2001)計(jì)算并分析基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 構(gòu)建載體及轉(zhuǎn)化、篩選 使用I和Ⅲ 酶分別酶切超表達(dá)載體PBI121質(zhì)粒，經(jīng)電泳跑膠確定目標(biāo)產(chǎn)物后切膠， 并回收目的片段1。利用諾唯贊同源重組酶將帶酶切位點(diǎn)的PCR目的產(chǎn)物構(gòu)建到酶切后的表達(dá)載體PBI121上，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌中擴(kuò)增， 獲得GUS表達(dá)載體PBI121-1-GUS。將經(jīng)PCR、酶切及測(cè)序后鑒定正確的GUS表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)進(jìn)農(nóng)桿菌GV3101，并通過(guò)花序浸染法(Clough & Bent, 1998)轉(zhuǎn)染到野生型擬南芥中。將收種得到的T0代擬南芥種子播種在含有50 mg·L卡那霉素(Kanamycin)的1/2MS培養(yǎng)基上，篩選出具有抗卡那霉素的轉(zhuǎn)基因植株，利用啟動(dòng)子測(cè)序引物對(duì)T1代擬南芥葉片的DNA進(jìn)行PCR鑒定，以野生型植株為陰性對(duì)照。將符合預(yù)期結(jié)果的轉(zhuǎn)基因植株繼代篩選至T2代，用于GUS染色分析。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株表型觀察 轉(zhuǎn)基因株系和野生型擬南芥的種子先后經(jīng)75%酒精、10%次氯酸鈉消毒和3次無(wú)菌水洗滌，之后播種在1/2MS培養(yǎng)基(pH=5.8)中，4 ℃春化2 d后，置于溫度為25 ℃、光周期為16 h光照/8 h黑暗、光照強(qiáng)度為5 000 lx的人工光照培養(yǎng)箱內(nèi)。光照培養(yǎng)10 d后，測(cè)量擬南芥幼苗根長(zhǎng)并記錄，5次重復(fù)。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株GUS組織化學(xué)染色 參照Solarbio 公司即用型GUS試劑盒說(shuō)明書，分別選取在1/2MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)4、6、9、12、16、20、25 d等不同時(shí)期及不同組織的轉(zhuǎn)1∷GUS的T2代擬南芥轉(zhuǎn)化株，按Jefferson(1987)的方法放到染色液中染色，37 ℃過(guò)夜孵育，75%酒精洗滌脫色5～6次后在體視顯微鏡下拍照。以GV3101空菌株浸染野生型擬南芥為陰性對(duì)照，35S∷GUS空載體浸染的擬南芥為陽(yáng)性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 LtAGO1基因全長(zhǎng)cDNA的獲得

從北美鵝掌楸葉芽中獲得1中間片段長(zhǎng)度為3 592 bp，利用RACE克隆獲得長(zhǎng)度為440 bp和636 bp的5′端和3′端序列(圖2：A)，經(jīng)拼接得到4 258 bp的cDNA全長(zhǎng)序列。經(jīng)ORF finder預(yù)測(cè)到5′ -UTR序列長(zhǎng)度為78 bp，3′-UTR序列長(zhǎng)度為880 bp，含13個(gè)polyA，ORF長(zhǎng)度為3 300 bp，共編碼1 100個(gè)氨基酸。對(duì)ORF兩端設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增并測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果顯示開放閱讀框序列長(zhǎng)度大小與拼接序列一致，且無(wú)變異位點(diǎn)。蛋白結(jié)構(gòu)分析得到該蛋白包含2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，即Gly-rich-AGO1和Piwi。其中，Piwi結(jié)構(gòu)域位于AGO1的C端，含有RNA 5′ 端結(jié)合位點(diǎn)和對(duì)mRNA有切割作用的活性位點(diǎn)(圖2：B)。以上結(jié)果驗(yàn)證了所得cDNA序列的正確性，故將該基因命名為1。

圖 1 北美鵝掌楸和鵝掌楸的葉片和采樣部位Fig. 1 Leaves and sampling parts of Liriodendron chinense and L. tulipifera

A. a. 5′-RACE; b. 3′-RACE; c. 中間片段; d. 開放閱讀框; M1. Maker 2 000; M2. Maker 5 000; B. 保守結(jié)構(gòu)域; C. 二級(jí)結(jié)構(gòu); D. 三級(jí)結(jié)構(gòu)。A. a. 5′-RACE segment; b. 3′-RACE segment; c. Middle segment; d. Open reading frame(ORF) fragment; M1. Maker 2 000; M2 . Maker 5 000; B. Conserved domain; C. Secondary structure; D. Tertiary structure.圖 2 LtAGO1的克隆與結(jié)構(gòu)分析Fig. 2 Cloning and structure analysis of LtAGO1 proteins

2.2 LtAGO1蛋白二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)

圖2：C顯示，該蛋白由延伸鏈(extended strand)、α螺旋(h)、β轉(zhuǎn)角(t)和無(wú)規(guī)則卷曲(c)組成，其中無(wú)規(guī)則卷曲最多，占52.14%；此外，占氨基酸序列較多的是α螺旋(28.57%)和延伸鏈(13.83%)，β轉(zhuǎn)角最少(5.46%)。為深入了解蛋白結(jié)構(gòu)，對(duì)LtAGO1預(yù)測(cè)并模擬蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖2：D)，結(jié)果顯示LtAGO1蛋白結(jié)構(gòu)與AGO2蛋白最為相似，且置信度達(dá)100%。利用SignalP 5.0 Server 預(yù)測(cè)得到D值(信號(hào)肽均值與Y-max的平均值)較小(0.001 6)，推測(cè)該基因編碼的蛋白不含信號(hào)肽，為非分泌蛋白。對(duì)LtAGO1蛋白亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，LtAGO1蛋白位于微體、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜的分值分別為0.3、0.3、0.1和0，說(shuō)明該蛋白可能定位于細(xì)胞核和微體中。

2.3 LtAGO1蛋白同源性比對(duì)及進(jìn)化樹分析

將1編碼的氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，與沉水樟()、海棗()和小果野蕉()等的AGO1蛋白同源，且相似性較高(72.97%～76.33%)。經(jīng)多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)LtAGO1蛋白與其他物種AGO1同源蛋白總體表現(xiàn)為C端較保守，N端保守性較差，且同源序列中均存在一個(gè)保守的Piwi結(jié)構(gòu)域(圖3)。LtAGO1蛋白與不同種類植物AGO1蛋白序列一致性較高，說(shuō)明該基因在植物進(jìn)化過(guò)程中比較保守。通過(guò)與其他物種AGO1同源蛋白比對(duì)及構(gòu)建的進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，北美鵝掌楸與樟科的沉水樟AGO1蛋白(RWR84608.1)聚在一起，親緣關(guān)系最近，與海棗(XP_008812792.1)、小果野蕉(XP_009386429.1)的親緣關(guān)系較近，與麻風(fēng)樹(XP_012079244.1)和橡膠樹(XP_021670505.1)的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)(圖4)。

圖 3 LtAGO1蛋白同源性分析Fig. 3 Homology analysis of LtAGO1 protein

圖 4 LtAGO1蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig. 4 Homology and phylogenetic analysis of LtAGO1 protein

2.4 LtAGO1的時(shí)空表達(dá)差異分析

利用RT-qPCR檢測(cè)分析1在北美鵝掌楸8個(gè)組織中的表達(dá)量，結(jié)果如圖5：A所示，1在北美鵝掌楸所有的組織中均有表達(dá)，但表達(dá)量存在一定差異。其中，雄蕊和花芽的相對(duì)表達(dá)量較高，顯著高于其他組織，其次是花瓣，在花萼、花芽、葉片、葉芽和雌蕊中的表達(dá)量較低，1在北美鵝掌楸不同組織間的相對(duì)表達(dá)量為雄蕊>花芽>花瓣>花萼>葉片>雌蕊>葉芽>莖。該基因在花器官中特異表達(dá)，推測(cè)1可能在花器官發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

對(duì)葉基部、葉中部和葉緣進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，結(jié)果如圖5：B所示，在北美鵝掌楸中，1的相對(duì)表達(dá)量為葉緣>葉中部>葉基部；在鵝掌楸中，1的相對(duì)表達(dá)量為葉緣>葉基部>葉中部。由此可見，1主要在鵝掌楸和北美鵝掌楸葉片中的葉緣部位表達(dá)，且該基因在鵝掌楸葉片所有部位的相對(duì)表達(dá)量均高于北美鵝掌楸的相對(duì)表達(dá)量，尤其是鵝掌楸葉中部和葉基部的表達(dá)量是北美鵝掌楸的4.5～7.5倍，說(shuō)明1在兩個(gè)種間葉片的空間分布上存在差異。

A. AGO1在北美鵝掌楸不同組織中的表達(dá); B. AGO1在鵝掌楸屬不同組織中的表達(dá); C. AGO1在北美鵝掌楸不同發(fā)育時(shí)期葉中的表達(dá); D. AGO1在北美鵝掌楸葉不同部位中的表達(dá)。 表示差異極顯著(P<0.01)。A. AGO1 gene expressions of different tissues in L.tulipifera; B. AGO1 gene expressions of different tissues in Liriodendron; C. AGO1 gene expressions of different times of leaf in L.tulipifera; D. AGO1 gene expressions of different parts of leaf in L.tulipifera. means extremely significant differences(P<0.01).圖 5 AGO1基因在鵝掌楸屬不同組織中的表達(dá)模式Fig. 5 Expression patterns of AGO1 gene in different tissues of Liriodendron L.

對(duì)葉芽萌動(dòng)期(時(shí)期1和時(shí)期2)、幼葉期(時(shí)期3)、成熟期(時(shí)期4至?xí)r期6)和衰老期(時(shí)期7)的葉片進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，結(jié)果如圖5：C所示：在葉芽萌動(dòng)期至展葉期，1的表達(dá)量隨著葉芽的逐漸膨大而降低；在生長(zhǎng)期，1的表達(dá)量與葉片大小呈負(fù)相關(guān)的關(guān)系，且在葉面積最大時(shí)達(dá)到最低值；當(dāng)葉片進(jìn)入衰老期，1的表達(dá)量比生長(zhǎng)后期的表達(dá)量高，但比展葉期的低，且在葉原基形成的過(guò)程中，1的表達(dá)量遠(yuǎn)高于葉成熟期的表達(dá)量。1在北美鵝掌楸葉片不同發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)量為葉芽萌動(dòng)期>幼葉期>衰老期>成熟期，說(shuō)明1在北美鵝掌楸分生組織生長(zhǎng)較旺盛的時(shí)期表達(dá)。

對(duì)葉緣凸出部分(即葉尖，a, c和e)和凹陷部分(b和d)進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，結(jié)果如圖5：D所示，1在葉柄的相對(duì)表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他部位的表達(dá)量，相較而言，該基因在凹陷部位(b)的相對(duì)表達(dá)量高于凸出部位(c)，此外在其他部位基本不表達(dá)。因此，1在北美鵝掌楸葉片中的相對(duì)表達(dá)量為葉柄>葉凹陷>葉尖，說(shuō)明1可能在葉柄的形成中起著重要作用。

2.5 LtAGO1蛋白共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)

LtAGO1蛋白共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)顯示(圖6)，1不僅與逆境應(yīng)激響應(yīng)基因、6 和3發(fā)生互作， 還與介導(dǎo)miRNA葉極性分化的1和1基因發(fā)生互作。 據(jù)報(bào)道，長(zhǎng)度20～24 nt的小RNA(sRNA)能響應(yīng)多種逆境脅迫(Chen et al.，2002；Zhang et al.，2008)，其sRNA的產(chǎn)生主要依賴、和基因家族所編碼的蛋白(Saito & Siomi , 2010 )。3與6協(xié)同作用能將單鏈RNA轉(zhuǎn)錄為dsRNA，誘導(dǎo)產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄后基因沉默，降低病原菌的危害(Yoshikawa et al.，2013)。此外，6還與7、3和4共同調(diào)控trans-acting siRNA通路，其下游靶基因是參與葉形遠(yuǎn)軸化的生長(zhǎng)素響應(yīng)因子(Peragine et al.，2004)。在煙草中，1的沉默導(dǎo)致植株矮小，葉片畸形。1通過(guò)介導(dǎo)miRNA來(lái)調(diào)節(jié)-Ⅲ 基因的表達(dá)，從而維持葉的平展發(fā)育(Yu et al.，2005)。1最早被發(fā)現(xiàn)和花器官發(fā)育相關(guān)(Chen et al.，2002)，擬南芥中絕大部分miRNA均受到1的調(diào)控(Yu et al.，2006)，和1-3一樣，1既能調(diào)控發(fā)育，又能參與ABA信號(hào)通路的調(diào)控(Park et al.，2002)。1與這些基因相互作用，協(xié)同發(fā)揮抗逆及發(fā)育的調(diào)控作用。

圖 6 LtAGO1蛋白共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)Fig. 6 Co-expression network of LtAGO1 protein

2.6 LtAGO1啟動(dòng)子克隆、表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

以北美鵝掌楸基因組DNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，得到2 001 bp的1啟動(dòng)子序列(圖7：A)。將啟動(dòng)子擴(kuò)增產(chǎn)物1連接到植物表達(dá)載體PBI121上(圖7：D)，連接產(chǎn)物經(jīng)菌落PCR發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為2 000 bp左右，與陽(yáng)性對(duì)照條帶大小相一致(圖7：B)，檢測(cè)后的測(cè)序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)序列一致。經(jīng)雙酶切電泳后的結(jié)果(圖7：C)顯示，重組的質(zhì)粒被酶切成兩條條帶，一條大小為12 758 bp的條帶，另一條幾乎與1大小一致的序列條帶，說(shuō)明1啟動(dòng)子成功構(gòu)建到PBI121表達(dá)載體中。

A. M. DNA marker DL5 000; ProAGO1. LtAGO1啟動(dòng)子序列; B. 菌液PCR檢測(cè); C. M1. DNA marker DL15 000; 1. Hind Ⅲ 單酶切; 2. Hind Ⅲ和XbarⅠ雙酶切; + . LtAGO1啟動(dòng)子序列; D. PBI121-ProAGO1-GUS表達(dá)載體的構(gòu)建。A. M. DNA marker DL5 000; ProAGO1. LtAGO1 promoter sequence; B. PCR detection of Escherichia coli; C. M1. DNA marker DL15 000; 1. Single-digestion products by Hind Ⅲ; 2. Double-digestion products by Hind Ⅲ and XbarⅠ; +. LtAGO1 promoter sequence; D. PBI121-ProAGO1-GUS vector construction.圖 7 LtAGO1啟動(dòng)子的克隆及載體構(gòu)建Fig. 7 Cloning and vector construction of LtAGO1 promoter

2.7 LtAGO1啟動(dòng)子順式作用元件分析

利用PlantCARE軟件對(duì)1啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，結(jié)果如表2所示，1啟動(dòng)子中含有RNA聚合酶Ⅱ起始轉(zhuǎn)錄所必需的CAAT-box、TATA-box元件和較多的光響應(yīng)元件(如Box 4 、G-box、GT1-motif和 MYB等)，此外還包含與防御相關(guān)的響應(yīng)元件(如防御與應(yīng)激元件TC-rich repeats，茉莉酸甲酯響應(yīng)調(diào)節(jié)元件CGTCA/TGACG-motif，水楊酸響應(yīng)元件TCA-element，ABA響應(yīng)元件MYC，冷脅迫相關(guān)元件as-1，厭氧誘導(dǎo)調(diào)控元件ARE)和生長(zhǎng)調(diào)控相關(guān)元件(如分生組織表達(dá)調(diào)控元件CCGTCC-box、玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控元件O-site)。

表 2 LtAGO1啟動(dòng)子中的順式作用元件預(yù)測(cè)Table 2 The cis-acting elements in promoter sequence of LtAGO1

2.8 轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)及表型觀察

經(jīng)PCR檢測(cè)后，共獲得1∷GUS轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株11株(圖8：C)。收種并播下T2代轉(zhuǎn)基因植株，發(fā)現(xiàn)野生型的根長(zhǎng)為(1.5±0.2)cm，轉(zhuǎn)基因的根長(zhǎng)為(0.5±0.2)cm，且須根和主根一樣發(fā)達(dá)(圖8：D)，葉面積較野生型小，第二對(duì)真葉的頂端出現(xiàn)凹形缺刻和白化。30 d時(shí)，鑒別出兩種表型的株系，主要特征如下：植株矮小(圖8：F)，抽薹較晚，且出現(xiàn)不育的重瓣花，大部分蓮座葉表面積較野生型小(圖8：E)。其中，株系1有1片向中-側(cè)軸方向延伸生長(zhǎng)的葉片，葉基部狹窄，葉形呈扇形，其他葉片表面積是野生型的一半，且呈葉基歪斜、葉柄彎曲、中-側(cè)軸向和基-頂軸向的不對(duì)稱發(fā)育。株系2的蓮座葉數(shù)量較野生型少2片，葉形缺刻程度較株系1更深，其中有1片葉的葉面積是其他葉片的5～10倍，葉基楔形，葉頂端凹陷呈心形，其他葉基歪斜，葉的主要生長(zhǎng)方向由基部至頂端方向延伸生長(zhǎng)，葉形態(tài)呈線形或條狀發(fā)育，葉柄較短。推測(cè)1啟動(dòng)子從葉原基分化期就開始影響擬南芥的葉片在中-側(cè)軸及基-頂軸兩個(gè)方向上發(fā)生程度各異的極性分化，且隨著時(shí)間而加深變異的程度，最終使葉緣缺刻的表型得以維持。

A. 擬南芥葉片和花的表型; B. 擬南芥花不育的表型; C. M為DL 5 000 DNA分子標(biāo)準(zhǔn)量; +. LtAGO1啟動(dòng)子序列; 1-11. 轉(zhuǎn)ProAGO1∷GUS擬南芥植株; - . 陰性對(duì)照; D. 擬南芥幼苗根的發(fā)育; E. 擬南芥蓮座葉的發(fā)育; F. 擬南芥花的發(fā)育。A. Leaf and flower phenotypes of A. thaliana ; B. Phenotype of floral sterility in A. thaliana; C. M. DNA marker DL 5 000; +. LtAGO1 promoter sequence; 1-11. Transgenic ProAGO1∷GUS in A. thaliana plants; - . Negative control; D. Root development of A. thaliana seedlings; E. Development of rosette leaf in A. thaliana ; F. Flower development in A. thaliana.圖 8 轉(zhuǎn)ProAGO1∷GUS擬南芥植株的PCR鑒定和表型觀察Fig. 8 PCR identification and phenotype of transgenic ProAGO1∷GUS Arabidopsis thaliana plants

2.9 LtAGO1啟動(dòng)子活性分析

圖9顯示，由1啟動(dòng)子控制的基因在植株發(fā)育過(guò)程中呈階段性表達(dá)。在萌發(fā)后的第4天和第6天，幼苗的GUS活性不表達(dá)(圖9：B1-B2)；在葉芽分化期(第9天至第25天)，1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS在葉芽頂端穩(wěn)定表達(dá)，且在新分化的葉柄上啟動(dòng)活性最強(qiáng)(圖9：B3-B7)。在生殖生長(zhǎng)階段，其在主葉脈、葉緣鋸齒尖、果柄、花萼及雌蕊等部位表達(dá)，說(shuō)明1在成熟的花、果莢、葉和莖的維管束中均表達(dá)(圖9：B8-B11)。因此，1啟動(dòng)子的GUS活性強(qiáng)度為葉頂芽>花器官>維管束，屬于分生組織特異性啟動(dòng)子。

A1-A9. 生長(zhǎng)4、6、9、12、16、45 d的野生型植株; B1-B11. 生長(zhǎng)4、6、9、12、16、20、25、45 d的轉(zhuǎn)ProAGO1∷GUS植株; C1-C9. 生長(zhǎng)4、6、9、12、16、45 d的轉(zhuǎn)35S∷GUS植株。A1-A9. Wild A. thaliana seedlings of 4, 6, 9, 12, 16, 45-day-old; B1-B11. Transgenic ProAGO1∷GUS A. thaliana seedlings of 4, 6, 9, 12, 16, 20, 25, 45-day-old; C1-C9. Transgenic 35S∷GUS A. thaliana seedlings of 4, 6, 9, 12, 16, 45-day-old .圖 9 轉(zhuǎn)基因擬南芥組織GUS染色分析Fig. 9 Promoter-GUS assay of transgenic Arabidopsis thaliana in different parts

3 討論與結(jié)論

本研究克隆得到北美鵝掌楸1基因，通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)1和其他物種1的相似性很高，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核，這些信息與李紅英等(2018)在胡楊中的研究結(jié)果相吻合。組織特異性分析發(fā)現(xiàn)，1在葉原基分化期的表達(dá)量明顯高于成熟期和衰老期，且在幼葉的葉緣部位高含量表達(dá)，而在成熟葉中只在葉柄表達(dá)；1在玉米的幼葉及吐絲期的雌穗中表達(dá)量最高(徐東東，2014)，且在玉米新生葉中的表達(dá)量高于老葉(許鑫等，2014)。在北美鵝掌楸生殖生長(zhǎng)過(guò)程中，1在雄蕊的表達(dá)量最高，其次是花芽，與龍眼(楊曼曼，2015)、蘋果(鹿游等，2013)的組織特異性研究結(jié)果類似，說(shuō)明1在幼苗期參與葉原基的分化，而在生殖期普遍存在于細(xì)胞分裂生長(zhǎng)較旺盛的花器官中。

啟動(dòng)子是基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控中心，本研究預(yù)測(cè)到1基因啟動(dòng)子上含有多個(gè)光響應(yīng)、激素誘導(dǎo)、分生組織表達(dá)及多個(gè)非生物脅迫響應(yīng)元件，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)1能成功啟動(dòng)GUS表達(dá)，其表達(dá)具有時(shí)空特異性：GUS在幼苗期的頂端分生組織表達(dá)，隨著頂端逐漸分化出新的葉片，該啟動(dòng)子僅在新分化的葉柄處表達(dá)，后期在成熟的花、果莢、葉和莖的維管束中表達(dá)。Vaucheret等(2006)對(duì)轉(zhuǎn)1∷GUS的擬南芥分析發(fā)現(xiàn)，1在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中表達(dá)，尤其在分生組織和維管束組織中的表達(dá)豐度最高。這說(shuō)明1的表達(dá)不僅在頂端分生組織， 也在側(cè)生分生組織中的其他部位，但目前有關(guān)相應(yīng)的表達(dá)機(jī)理還未見報(bào)道。

葉極性分化是原基細(xì)胞感受極性分化信號(hào)并作出相應(yīng)反應(yīng)的過(guò)程，而沿著近-遠(yuǎn)軸、基-頂軸和中-側(cè)軸3個(gè)極性方向分化的過(guò)程又決定了葉形態(tài)的建成過(guò)程(Du et al.，2018)。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)1∷GUS表達(dá)載體得到葉柄彎曲、葉中-側(cè)軸向和基-頂軸向極性喪失的擬南芥株系。在番茄中下調(diào)1的表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致遠(yuǎn)軸面出現(xiàn)與近軸面相同的毛狀體，且葉片小葉柄出現(xiàn)發(fā)育缺陷 (Wang et al.，2015)。此外，1啟動(dòng)子的表達(dá)能促使擬南芥在發(fā)育過(guò)程中發(fā)生異位分生組織的活動(dòng)，致使擬南芥葉基楔形、葉頂端缺刻呈心形。在對(duì)1功能缺失突變體的其他研究中，發(fā)現(xiàn)1的缺失會(huì)促使植物體的葉卷曲、植株矮化及結(jié)實(shí)率下降(Wu et al.，2009； Liu & Nonomura, 2016)，Kidner等(2005)對(duì)過(guò)表達(dá)1和雙突變的擬南芥分析發(fā)現(xiàn)，1是通過(guò)激活基因調(diào)節(jié)干細(xì)胞功能從而影響葉的極性效應(yīng)。由此可知，1基因的缺失和過(guò)表達(dá)都會(huì)不同程度地影響葉極性的喪失，推測(cè)1可能是通過(guò)兩種不同的調(diào)控途徑參與到葉的形態(tài)建成中。目前， 對(duì)這一分子機(jī)制的研究普遍認(rèn)為，葉原基和葉發(fā)育的過(guò)程皆需要處于激活狀態(tài)，且家族其他基因處于沉默狀態(tài)。Yang等(2006)發(fā)現(xiàn)1是通過(guò)正向調(diào)控和抑制的表達(dá)而決定葉片和花瓣近-遠(yuǎn)軸的發(fā)生。Arunika等(2004)研究認(rèn)為，葉片的形態(tài)建成(如葉中孔洞的形成、葉緣的裂痕)均與關(guān)鍵部位的細(xì)胞發(fā)生程序性死亡(PCD)相關(guān)，而Zhang等(2009)的研究也證實(shí)正向卷曲葉片的發(fā)生是因?yàn)楸趁嫒~肉細(xì)胞的程序性死亡。那么，1是否也是通過(guò)調(diào)控細(xì)胞的分化方向和速度而影響葉形的多樣性，且該基因如何響應(yīng)葉原基分化的起始信號(hào)，其具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。在生殖發(fā)育方面，該研究的表達(dá)株系抽薹較晚，花大而重瓣且不育，這一現(xiàn)象與Li等(2019)的研究結(jié)果相吻合。究其原因，可能是花器官由頂端分生組織分化形成，1在頂端分生組織中持續(xù)而穩(wěn)定的表達(dá)，從而能參與到葉與花器官的形態(tài)建成中。但是，兩者之間有無(wú)相關(guān)的基因共同被1所調(diào)控，還有待于進(jìn)一步研究。

本研究以北美鵝掌楸為研究對(duì)象，首次分析了1在不同組織部位的時(shí)空表達(dá)譜，明確了其啟動(dòng)子在擬南芥分生組織中的表達(dá)模式，初步探索了1對(duì)北美鵝掌楸葉形發(fā)育的調(diào)控作用。下一步我們將會(huì)構(gòu)造1超表達(dá)載體轉(zhuǎn)化楊樹，并將1與葉形發(fā)育的關(guān)鍵成員家族基因進(jìn)行蛋白互作研究。本研究結(jié)果將為進(jìn)一步分析1基因在木本植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的作用提供理論參考，也為促進(jìn)觀葉樹種的葉形態(tài)遺傳改良研究提供良好的實(shí)踐意義。