應(yīng)用EP7-A2 文件探討3 種常用中藥注射液對(duì)凝血檢測項(xiàng)目的干擾

齊迅捷，張婧，熊遠(yuǎn)輝，彭梅

（萍鄉(xiāng)市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 萍鄉(xiāng) 337000）

干擾是指在臨床實(shí)驗(yàn)中被檢測物濃度因樣品特性或其他成分的影響而出現(xiàn)的臨床顯著性偏差[1]。 這種影響可見于檢測系統(tǒng)的非特異性、指示反應(yīng)響應(yīng)不佳、被測物活性抑制等情況.在臨床實(shí)際工作中病人結(jié)果與真值間的偏離主要有三個(gè)原因，包括系統(tǒng)偏差、不精密度和干擾.在某種程度上由一個(gè)干擾物引起的未預(yù)料作用可使臨床檢驗(yàn)結(jié)果具有顯著誤差[2]。 近年來隨著祖國對(duì)中醫(yī)藥的扶持和研究力度加大， 使得中醫(yī)藥領(lǐng)域呈現(xiàn)蓬勃發(fā)展趨勢.更多的中醫(yī)藥被用于臨床.有研究顯示部分中藥成分對(duì)血小板的凝集有抑制作用， 對(duì)凝血時(shí)間（CT）、血漿凝血酶原時(shí)間（PT）及活化部分凝血酶原時(shí)間（APTT）的檢驗(yàn)結(jié)果均可產(chǎn)生干擾[3]。本研究探討3 種中藥注射液是否對(duì)凝血檢測存在干擾，參照EP7-A2 文件，先采用“配對(duì)-差異”實(shí)驗(yàn)方案確定引起干擾的干擾物和此干擾物干擾的凝血檢測項(xiàng)目。 再通過“劑量-效應(yīng)”實(shí)驗(yàn)，確定干擾物濃度和干擾程度之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Sysmex CA-7000 全自動(dòng)凝血分析儀，定期進(jìn)行校準(zhǔn)。 試劑購置武漢中太生產(chǎn)的凝血酶原時(shí)間(PT)批號(hào)：221043；活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)批號(hào)：320091；凝血酶時(shí)間(TT)批號(hào)：521041；纖維蛋白酶原(FIB)批號(hào)：620101。

1.2 基礎(chǔ)樣本 收集健康體檢者血漿，近期未服用任何藥物、無飲酒且不吸煙的健康體檢者，靜脈采血后離心提取血漿混合為基礎(chǔ)樣本備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物 對(duì)照組空白干擾物為緩沖液，干擾藥物為金陵藥業(yè)股份有限公司的脈絡(luò)寧注射液，批號(hào)20200312； 天津天士力之驕藥業(yè)有限公司的注射用丹參多酚酸(凍干粉)，批號(hào)20211103；和昆明龍津藥業(yè)股份有限公司的注射用燈盞花素(凍干粉)，批號(hào)20210105-2。

1.4 方法

1.4.1 “配對(duì)-差異”實(shí)驗(yàn)方案 根據(jù)CLSI EP7－2A文件的實(shí)驗(yàn)方法，脈絡(luò)寧注射液使用原液，注射用丹參多酚酸和注射用燈盞花素每支均用2 mL 注射用水溶解。 對(duì)照組樣本使用基礎(chǔ)血漿3.8 mL 加入空白干擾劑緩沖液0.2 mL 進(jìn)行20 倍稀釋；實(shí)驗(yàn)組樣本使用基礎(chǔ)血漿3.8 mL 分別加入藥物0.2 mL進(jìn)行20 倍稀釋。 稀釋后脈絡(luò)寧注射液濃度為50 μL/mL； 注射用丹參多酚酸濃度為2.5 mg/mL，注射用燈盞花素濃度為0.25 mg/mL。計(jì)算dobs即干擾組樣本均值與對(duì)照組樣本均值的差計(jì)算cut-off 值dC(雙側(cè)檢驗(yàn))dC=如果dobs＞dC，說明存在干擾。

1.4.2 計(jì)算“配對(duì)-差異”方案的實(shí)驗(yàn)次數(shù) 首先計(jì)算最大允許干擾值dmax/ 批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差S 的比值。S 由基礎(chǔ)樣本重復(fù)測定10 次計(jì)算后得出。 dmax為最大允許干擾值， 參照衛(wèi)生部室間質(zhì)評(píng)臨床可接受范圍。 得出dmax/S 比值后，查表得出n=3。 見表1。

表1 dmax/S 與重測次數(shù)對(duì)應(yīng)情況

1.4.3 “劑量-效應(yīng)”實(shí)驗(yàn)方案 根據(jù)CLSI EP7－2A文件的要求確定最高濃度和最低濃度.實(shí)驗(yàn)過程中盡可能小的稀釋測試樣本，最好不超過5%，也就是原液稀釋20 倍，同“配對(duì)-差異”實(shí)驗(yàn)所用藥物濃度相同.將此濃度確定為最高濃度分別為脈絡(luò)寧注射液濃度為50 μL/mL； 注射用丹參多酚酸濃度為2.5 mg/mL。 最低濃度本實(shí)驗(yàn)確定為 “配對(duì)-差異”實(shí)驗(yàn)所用對(duì)照組樣本濃度為0.確定最高和最低濃度樣本后， 將低濃度和高濃度樣本等體積混勻，配成中間濃度樣本。 將低濃度和中間濃度樣本等體積混勻，配成25%濃度的樣本。 將中間濃度和高濃度樣本等體積混勻，配成75%濃度的樣本，見表2。做劑量效應(yīng)曲線時(shí)在每個(gè)測試濃度水平上重復(fù)測試3 次。 在同一種干擾藥物分析批內(nèi)測定5個(gè)樣本，為了平均系統(tǒng)漂移影響，測定順序第一次按照升序測定，第二次按照降序測定，第三次按照升序測定。

表2 兩種中藥注射液的5 個(gè)濃度梯度的濃度值

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 22.0 軟件計(jì)算dmax/S、dobs、dC值、藥物濃度與干擾效應(yīng)的線性方程和相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 “配對(duì)-差異”實(shí)驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)3 種中藥注射液“配對(duì)-差異” 實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組和干擾組的PT、FIB、TT、APTT 的檢測數(shù)據(jù)計(jì)算dobs和dC，根據(jù)dobs和dC分析每種藥物對(duì)凝血檢測項(xiàng)目是否存在干擾.干擾物 為 脈 絡(luò) 寧 注 射 液 的 樣 本PT、FIB、TT、APTT 的dobs＞dC，均存在干擾。 并且TT、APTT 是負(fù)干擾，PT、FIB 是正干擾，見表3。 干擾物為注射用燈盞花素的樣本PT、FIB、TT、APTT 的dobs≤dC都不存在干擾現(xiàn)象，見表4。 干擾物為注射用丹參多酚酸的樣本PT、FIB、TT、APTT 的dobs＞dC，均存在干擾。 并且TT是負(fù)干擾，PT、FIB、APTT 是正干擾，見表5。

表3 脈絡(luò)寧注射液對(duì)凝血功能檢測的干擾

表5 注射用丹參多酚酸對(duì)凝血功能檢測的干擾

2.2 “劑量-效應(yīng)”實(shí)驗(yàn)結(jié)果 脈絡(luò)寧注射液和注射用丹參多酚酸對(duì)凝血檢測項(xiàng)目PT、FIB、TT、APTT測定的干擾劑量-效應(yīng)實(shí)驗(yàn)均呈線性關(guān)系，脈絡(luò)寧對(duì)PT 和FIB 的干擾為正相關(guān)。 對(duì)TT 和APTT 的干擾為負(fù)相關(guān)。 注射用丹參多酚酸對(duì)PT、FIB、APTT 的干擾為正相關(guān)，對(duì)TT 的干擾為負(fù)相關(guān)，見表6。

表6 兩種中藥注射液干擾劑量- 效應(yīng)的相關(guān)系數(shù)和回歸方程

3 討論

患者在臨床治療過程中， 會(huì)使用大量或多量品種不同的治療藥物， 這些藥物對(duì)臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性會(huì)造成影響.而臨床檢驗(yàn)結(jié)果對(duì)臨床疾病的診斷和療效觀察等越來越重要[4-7]。 了解藥物對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的影響， 不但可以合理地分析判斷檢驗(yàn)結(jié)果， 而且可以通過適當(dāng)?shù)臋z驗(yàn)方法克服這種影響[8-10]。目前，有研究顯示西藥抗生素對(duì)凝血檢測項(xiàng)目有較大的干擾[11-12]。2005 年美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)通過了EP7-A2 文件，使干擾研究有了標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)方案。 有學(xué)者運(yùn)用此文件研究了乳糜標(biāo)本對(duì)D-二聚體檢測項(xiàng)目的干擾[13]。 本研究運(yùn)用EP7-A2 文件對(duì)脈絡(luò)寧注射液、注射用丹參多酚酸、 注射用燈盞花素3 種中藥注射液是否對(duì)凝血檢測項(xiàng)目產(chǎn)生干擾進(jìn)行系統(tǒng)性的研究。 先通過“配對(duì)-差異”實(shí)驗(yàn)篩選出對(duì)凝血檢測項(xiàng)目存在干擾的脈絡(luò)寧注射液和注射用丹參多酚酸，并且脈絡(luò)寧對(duì)PT 和FIB 的干擾為正干擾， 對(duì)TT 和APTT 的干擾為負(fù)干擾。 注射用丹參多酚酸對(duì)PT、FIB、APTT 的干擾為正干擾， 對(duì)TT 的干擾為負(fù)干擾。 由于按照“配對(duì)-差異”實(shí)驗(yàn)的要求采用的藥物干擾濃度為單瓶藥物劑量的20 倍稀釋后的濃度，注射用燈盞花素臨床用藥劑量是每次2~5 瓶靜脈輸注， 而脈絡(luò)寧注射液和注射用丹參多酚酸則是每次1 瓶劑量靜脈輸注， 因此燈盞花素可能由于劑量小的原因沒有出現(xiàn)干擾現(xiàn)象。 運(yùn)用“劑量-效應(yīng)” 實(shí)驗(yàn)對(duì)上述2 種篩選出產(chǎn)生干擾的中藥注射液進(jìn)行濃度與凝血檢測干擾效應(yīng)之間的關(guān)系進(jìn)行研究。 脈絡(luò)寧注射液和注射用丹參多酚酸對(duì)凝血檢測項(xiàng)目PT、FIB、TT、APTT 測定的干擾劑量-效應(yīng)實(shí)驗(yàn)均呈線性關(guān)系。

但是，EP7-A2 文件推薦的“配對(duì)-差異”實(shí)驗(yàn)方案和“劑量-效應(yīng)”實(shí)驗(yàn)方案也存在局限性[14]，干擾篩選的“配對(duì)-差異”實(shí)驗(yàn)是體外加入的干擾物，干擾物的濃度應(yīng)該盡量接近臨床治療狀態(tài)下的最高血藥濃度[15]，實(shí)際上加入的干擾物并不等同于在人體內(nèi)的循環(huán)狀態(tài)下存在的藥物的狀態(tài)和濃度。并且對(duì)樣本產(chǎn)生干擾的可能不是藥物本身而是藥物的代謝產(chǎn)物。 “劑量-效應(yīng)”實(shí)驗(yàn)方案中的最高濃度和最低濃度的設(shè)定也不能真實(shí)反應(yīng)用藥前后的人體內(nèi)出現(xiàn)的最高濃度和最低濃度。 而第三種“利用患者樣本作偏倚分析” 實(shí)驗(yàn)方案是目前看起來最能夠檢測藥物或者藥物代謝產(chǎn)物干擾的方法，但是實(shí)驗(yàn)的可控操作性不強(qiáng)。 例如，患者可能服用多種藥物和其他食物等， 不能確定哪種藥物或食物產(chǎn)生的干擾。 另外藥物在病人體內(nèi)的代謝速度也是存在一定的個(gè)體差異的。

本研究的3 種中藥注射液均為活血化瘀類藥物， 由于此類藥物對(duì)凝血系統(tǒng)的作用不同于西藥作用于特定的凝血因子或者凝血過程中特定的靶點(diǎn)，而是多成分、多靶點(diǎn)、多維度的作用，作用機(jī)制較復(fù)雜[16]。具體干擾凝血檢測的原理有待進(jìn)一步檢測某些凝血因子， 另外結(jié)合血栓彈力圖和血液流變學(xué)的結(jié)果進(jìn)行綜合分析。 本研究由于條件有限僅只進(jìn)行前期的干擾試驗(yàn)。 在臨床實(shí)際工作中，當(dāng)凝血檢測結(jié)果與患者臨床癥狀不相符并且未出現(xiàn)其他并發(fā)癥，且在室內(nèi)質(zhì)控合格的前提下，排除采血、標(biāo)本運(yùn)送、溫度、離心等因素外，應(yīng)該考慮患者是否運(yùn)用了對(duì)凝血檢驗(yàn)結(jié)果造成干擾的藥物。 并且不應(yīng)該只關(guān)注西藥類的影響， 還應(yīng)重視活血化瘀類中藥的臨床使用劑量是否會(huì)對(duì)凝血檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。 綜合分析檢測報(bào)告與臨床實(shí)際的癥狀和病情的發(fā)生發(fā)展。