血清HBV RNA 定量檢測在慢性乙肝患者抗病毒治療中臨床研究

孫華寶，李美琦，賴啟南，斯志娟，漆童豐，王淑梅

（1.南昌市第九醫(yī)院檢驗科，江西 南昌 330002；2.南昌市第九醫(yī)院感染科，江西 南昌 330002）

乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）感染是一個嚴重的全球公共衛(wèi)生問題， 全世界有超過20 億人感染乙肝病毒。 據(jù)估計，每年約有78.6 萬人死于慢性HBV 感染相關疾病，包括肝硬化或肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）。 據(jù)2016年中國疾病預防控制中心數(shù)據(jù)顯示， 我國現(xiàn)約有9000 余萬人感染HBV，其中約三分之一為CHB 患者，且每年因感染HBV 所致的肝衰竭、肝硬化和肝細胞癌去世的患者有60 余萬人[1]。 一直以來，CHB 的發(fā)病機制較為復雜， 迄今尚未完全闡明。HBV 在患者體內長期高水平地復制激發(fā)了機體免疫清除應答反應，從而導致肝細胞的損傷。 《慢性乙型肝炎防治指南（2015 版）》指出，CHB 臨床治療的核心措施就是抗病毒優(yōu)化治療，其中核苷（酸）類似物（Nucleic acid drugs，NAs）方便給藥、副作用少、抑制病毒作用強而得到廣泛應用。 NAs 可以通過抑制病毒逆轉錄途徑從而抑制DNA 合成來發(fā)揮抗病毒作用， 但它不能夠清除共價閉合環(huán)狀DNA (Covalently closed circular DNA，cccDNA)，導致患者一旦停藥后常常會發(fā)生病毒學反彈和疾病復發(fā)的現(xiàn)象，很難實現(xiàn)臨床治愈，需要患者長時間甚至終生服藥[2]。 由此看來，在NAs 抗病毒治療過程中，尋找能夠預測CHB 患者發(fā)生HBeAg 陰轉血清學轉換和安全停藥的生物標志物， 對于抗病毒治療和減輕患者負擔顯得尤為重要。

cccDNA 作為HBV 復制的初始模板， 其在肝細胞核內水平的檢測是評價NAs 療效及停藥的重要指標，但由于該檢測需要收集肝組織標本而存在一定的局限性[3]。 近年來，已有研究發(fā)現(xiàn)血清HBV RNA 與肝組織HBV cccDNA 水平存在一定的相關性， 且在接受NAs 治療的患者血清中發(fā)現(xiàn)其水平與患者病毒學應答和預后有關， 因此HBV RNA 可以作為cccDNA 的替代標志物[4]。早在1996年，Kck 等在研究中發(fā)現(xiàn)CHB 感染者的血清中存在HBV RNA。 此外，根據(jù)近期的國內外慢性乙肝指南[5]，研究者已經(jīng)將血清HBV RNA 作為一種新型的標志物，并指出其主要成分前基因RNA（pgRNA）是以病毒樣顆粒釋放入血的。 因為pgRNA 是cccDNA 的直接轉錄體，所以其水平能夠精確地反映肝細胞中cccDNA 的存在狀態(tài)。 由此看來，血清HBV RNA 的檢測將為CHB 患者體內病毒復制狀態(tài)及其治療效能提供更為直接的證據(jù)[6]。 因此，在臨床實踐中， 接受NAs 治療的患者HBV DNA 與HBV RNA 水平是否存在相關性，存在相關性的顯著程度以及HBV RNA 的檢測能否用來判斷病毒學應答， 這一系列的問題是本研究需要進一步研究和探討的。本研究采用前瞻性隨訪， 選擇兩型CHB 患者接受NAs 抗病毒治療中及停藥后進行HBV RNA、高敏HBV DNA、HBeAg 及HBsAg 等指標檢測并研究其間各指標相關性，以用來評估HBV RNA 作為病毒學應答的判定標準、 療效判定和安全停藥指標用于臨床實踐的可行性。

1 病例與方法

1.1 病例 選取南昌市第九醫(yī)院2019 年1 月至2021 年6 月收治的280 例CHB 患者。 納入標準：臨床診斷均符合2000 年第十次全國病毒性肝炎與肝病學術會議修訂的《病毒性肝炎防治方案》的標準，NAs 治療適應癥采用2015 版《慢性乙型肝炎防治指南》的標準，肝炎病史半年以上，所有患者均簽署知情同意書。 入組排除標準：（1）酒精性、藥物性、感染性、遺傳性、免疫性及其他病毒性肝臟疾??；（2）合并嚴重的心血管、腎、內分泌、血液系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及精神病患者；（3）垂體、甲狀腺疾病者；（4）妊娠、哺乳期婦女。 本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準（2018 倫審字02 號）。

1.2 方法

1.2.1 血清丙氨酸轉氨酶 （Alanine transaminase，ALT）和谷草轉氨酶（Aspartate transaminase，AST）檢測： 采取患者清晨空腹血， 采用速率法上機檢測， 使用的試劑盒為北京九強生物技術股份有限公司，儀器為HITACHI7600 型自動生化分析儀。

1.2.2 血清HBV RNA 和HBV DNA 檢測 采用定量聚合酶鏈式反應 （quantitative polymerase chain reactio，qPCR） 技術，HBV RNA 定量測定試劑盒為湖南圣湘生物技術股份有限公司，HBV DNA 定量檢測試劑盒為瑞士羅氏制藥公司；HBV RNA 檢測下限是100 copies/mL，HBV DNA 檢測下限是20 IU/mL，檢測儀器分別為ABI 7500 和Cobas 480。操作嚴格按照說明書。

1.2.3 血清乙肝五項定量檢測 化學發(fā)光法測定，儀器和試劑是北京科美生物技術有限公司配套產品，其中HBsAg 檢測參考值為0~0.05 IU/mL、線性范圍為0~125 IU/mL，HBeAg 檢測參考值為0~0.7 PEIU/L、線性范圍為0~60 PEIU/L。 若初始檢測值高于檢測上限，則對樣品進行稀釋（1∶100）后檢測。

1.3 統(tǒng)計分析 統(tǒng)計軟件采用SPSS 17.0 ， 正態(tài)計量資料采用“±s”進行描述，多組獨立、正態(tài)、方差齊資料組間比較采用單方差分析， 兩兩比較采用LSD 法，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 研究對象的一般資料 選取HBeAg 陽性組和HBeAg 陰性組CHB 患者各140 例， 其中男性218例、女性72 例，年齡最小23 歲、最大75 歲，二組患者在性別、年齡方面比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

表1 試驗分組一般資料

2.2 HBeAg （+） 組NAs 治療期間HBV DNA 與RNA 轉歸變化 比較各治療節(jié)點患者血清HBeAg、HBV DNA 與RNA 轉歸情況， 其中HBV DNA 下降水平、 陰轉率最快最高，HBeAg 和HBV RNA 轉歸較慢，且較同步，見表2、表3、圖1。

表3 HBeAg（+）組NAs 治療期間HBV DNA 與RNA 轉變水平（±s）

表3 HBeAg（+）組NAs 治療期間HBV DNA 與RNA 轉變水平（±s）

項目名稱 治療前 治療24 周 治療48 周 治療72 周 F P HBeAg（PEIU/L）HBV DNA(lg IU/mL)HBV RNA(lg copies/mL)846.38±1417.64 4.88±1.47 3.98±1.46 533.04±1098.69 3.18±2.23 3.88±1.36 283.7±800.71 1.52±1.60 2.97±1.66 106.98±384.68 1.00±1.57 1.89±1.86 14.404 141.808 52.0368 0.000 0.000 0.000

圖1 HBV DNA 與HBV RNA 預測HBeAg 轉陰ROC 曲線圖

表2 HBeAg（+）組NAs 治療期間HBV DNA 與RNA 轉歸

2.3 HBeAg （-） 組NAs 治療期間HBV DNA 與RNA 轉歸變化 比較各治療節(jié)點患者血清HBV DNA 與RNA 轉歸情況， 其中HBV DNA 下降水平、 陰轉率最快最高，HBV RNA 轉歸較慢，同HBeAg（+）組基本相同，見表4—表5。

表4 HBeAg（-）組NAs 治療期間HBV DNA 與RNA 轉歸情況

表5 HBeAg（-）組NAs 治療期間HBV DNA 與RNA 轉變情況

2.4 高敏HBV DNA 檢測在CHB 患者NAs 治療期間臨床應用 臨床檢測HBV DNA， 常規(guī)試劑檢測下限為100 IU/mL， 羅氏高敏檢測試劑為20 IU/mL，并有三種結果模式即陽性（具體數(shù)字）、陰性（檢測到乙肝基因片斷但結果<20 IU/mL）、陰性（未檢測到乙肝基因片斷）。 見表6—表7。

表6 HBeAg（+）組高敏HBV DNA 結果一覽表

表7 HBeAg（-）組高敏HBV DNA 結果一覽表

3 討論

對于采用NAs 治療的CHB 患者預后，國內外指南中仍以血清HBV DNA 低于檢測值下限作為病毒學應答（Viralgical response, VR）[7]。 然而，由于NAs 對cccDNA 缺乏直接抗病毒作用， 且HBV 感染無法被完全消除，因此血清HBV DNA 的消失僅僅代表了病毒逆轉錄的過程被有效抑制， 并不能反映cccDNA 的轉錄活躍狀態(tài)。 在NAs 治療初期，患者血清中可以檢測到HBV DNA，隨著NAs 治療的進行，患者血清中HBV DNA 逐漸下降至無法檢測到的水平， 但與此同時，cccDNA 的活動并未停止。 在cccDNA 耗竭或轉錄沉默前，核衣殼包裹的來自cccDNA 的前基因組pgRNA 仍可以RNA 病毒樣顆粒的形式釋放， 且其過程不為NAs 治療所阻斷[8]，這可能是導致目前CHB 患者通過NAs 治療難以實現(xiàn)臨床治愈的原因之一。 HBV RNA 是反轉錄酶催化合成負鏈DNA 的模板，也是攜帶病毒遺傳信息的第一道傳遞者，對于病毒復制、耐藥產生和療效監(jiān)控都有重要生物學意義[9]。 近期的國內外慢乙肝指南[10]均指出血清HBV RNA 作為一種新型的血清標志物，能精確地反映肝細胞中cccDNA 的存在狀態(tài)， 因此它的檢測將為CHB 患者體內病毒復制狀態(tài)及其治療效能提供更為直接的證據(jù)[11]。 為了更加準確的評估抗病毒效果，有學者建議將血清HBV RNA 的檢測納入病毒學應答的評估中，并將血清HBV DNA 和HBV RNA 共同持續(xù)消失（低于檢測下限）重新定義[12]。 因此，在臨床實踐中， 接受NAs 治療的CHB 患者血清中HBV DNA 與HBV RNA 是否存在相關性， 其相關性程度大小及HBV RNA 的水平檢測能否用來判斷病毒學應答，是需要進一步研究解答的問題。

本研究采用前瞻性隨訪設計， 分為HBeAg 陽性和陰性均接受NAs 治療的CHB 患者兩實驗組各140 例并檢測其治療前、 治療24 周、48 周、72周四個時間節(jié)點的高敏HBV DNA、HBV RNA、HBsAg、HBeAg、ALT、AST 等血清標志物水平，并分析其相關性，結果顯示。

3.1 HBV RNA 和HBV DNA 動態(tài)變化相關性 在慢性乙肝患者接受NAs 治療中，HBV RNA 和HBV DNA 水平均成下降趨勢， 兩者成正相關，但HBV DNA 下降水平、轉陰率均顯著高于HBVRNA（P=0.000），且HBeAg 陰性組下降水平、轉陰率均高于HBeAg 陽性組，說明HBV RNA 比HBV DNA更能反映患者病毒復制情況及用于療效監(jiān)測，與之前Butler EK 等研究結果相同[13]。

3.2 HBV RNA 預測HBeAg 陰轉的能力 在HBeAg陽性組，HBV DNA 陰轉速度明顯快于HBeAg 和HBV RNA， 但HBeAg 與HBV RNA 陰轉幾乎同步，HBV DNA 的AUCROC=0.680，P=0.059，HBV RNA的AUCROC=0.878，P=0.000， 說明當血清HBV DNA被藥物完全抑制到難以檢測的水平時， 血清HBV RNA 的變化水平在一定程度上可以用來預測HBeAg 的血清學轉換， 這與之前Huang YW 等研究結果相同[14]。 同時，HBeAg 陰性患者血清HBV RNA 陽性檢出率低于HBeAg 陽性患者；HBeAg 陽性患者血清HBV RNA 與其他的病毒血清學指標的相關性優(yōu)于HBeAg 陰性患者，這可能是HBeAg陽性患者體內的cccDNA 轉錄活性相較于HBeAg陰性患者活躍所造成的。

3.3 HBV RNA 與HBeAg 動態(tài)變化的相關性 在HBeAg 陽性CHB 患者接受NAs 治療中，HBV RNA 和HBeAg 水平均成下降趨勢， 兩者成正相關， 但HBeAg 水平下降幅度大， 兩者差異顯著，HBV RNA 更能反映患者體內病毒復制狀況，說明HBV RNA 比HBeAg 能更好地監(jiān)測療效。

3.4 HBV DNA 高敏檢測臨床意義 本研究檢測兩組CHB 患者治療期間高敏HBVDNA 標本，結果顯示隨著治療期延長，HBV DNA 水平逐漸下降，但<20 IU/mL 結果數(shù)量明顯高于結果陰性 （未檢測到乙肝基因片斷）數(shù)量，提示若采取常規(guī)DNA 核酸檢測，這部分患者將顯示為陰性，差異有統(tǒng)計學意義 （P=0.000），HBV DNA 高敏檢測用于監(jiān)測CHB患者NAs 療效意義顯著。

綜上所述，來源于非整合的完整的HBV 基因組的HBV RNA，是病毒復制和預后的敏感性血清標志物， 可以作為監(jiān)測CHB 患者cccDNA 活性的一個潛在的新型標記物， 其血清水平更能夠反映和監(jiān)測慢CHB 患者NAs 抗病毒療效，可用于抗病毒安全停藥的評估。